Simulação Clonagem Molecular

Guia dos Laboratórios Virtuais | Versão em
Português
Simulação de Clonagem
molecular
2020
| Movimento Biotecnologia Brasil | www.movbiotecbrasil.com |

Português
1-
Bem-vindo à simulação de clonagem molecular! Você está prestes a aprender tudo

o que é necessário para editar um genoma e produzir um organismo completamente
novo. Você será capaz de usar essas técnicas para determinar a função de um gene
de reparo de DNA?
2-
O uso do LabPad é uma maneira importante de tirar o máximo proveito desta

simulação. É a primeira vez que você joga uma simulação Labster?
a) Sim, Por favor, acompanhe-me pelos recursos do LabPad
b) Não, eu já sei como funciona, obrigado

Português
3-
Este é o seu laboratóriopad. Use o Laboratóriopad em qualquer momento para acessar

a teoria relevante sobre o laboratório ou instruções adicionais sobre o que fazer em
seguida.
Você pode baixar o laboratóriopad para explorar a sala clicando no botão "EXPLORE"
abaixo.
Experimente!
4-
Bem feito! Quando o LabPad estiver abaixado, você poderá me ouvir sem precisar
clicar em Continuar.

Português
5-
O LabPad o guiará pelo laboratório virtual e armazenará todas as informações

coletadas durante o jogo. Clique em CONTINUAR para continuar. Leia as
informações nesta caixa de texto em branco com cuidado - você não poderá mais
acessá-las depois de clicar em CONTINUAR.
6-
Você pode acessar todas as informações relevantes nas quatro guias acima.
No momento, você está na guia HOME. Clique na guia TEORIA para aprender sobre
as quatro guias do LabPad.

Português
7-
Use a roda do mouse ou arraste a barra cinza no lado direito do LabPad para rolar
para baixo.
8-
As imagens são armazenadas na guia "MÍDIA".

No ambiente virtual, você estará trabalhando com produtos químicos perigosos. Dê
uma olhada no símbolo de aviso neste frasco! Isso significa que o frasco contém
produtos químicos corrosivos. Clique no botão azul "Visualizar imagem" abaixo para
identificar outros símbolos de perigo que você pode encontrar no laboratório.

Português
9-
O que é importante ao trabalhar com produtos químicos corrosivos? Clique na resposta

correta abaixo.
Se você estiver trabalhando com produtos químicos corrosivos, precisará…
a) Armazene-os em recipientes de metal.
b) Certifique-se de que você não bebe demais.
c) Use jaleco e luvas.
d) Descarte-os na pia.
10-
Muito bem! Essa é a resposta correta.

Quando você responde a uma pergunta do questionário corretamente, sua pontuação
aumenta. Você ganha 10 pontos se responder à pergunta corretamente na primeira
tentativa. Para cada tentativa adicional, 2 pontos são subtraídos da sua pontuação.

Português
Esta pergunta não é pontuada, é por isso que a PONTUAÇÃO no canto superior
esquerdo do seu LaboratórioPad ainda está em zero.
11-
Você pode acompanhar o seu progresso na guia “MISSÃO”. Vá para a guia “MISSÃO”
se quiser obter uma visão geral do seu trabalho ou carregar a partir de um ponto de
verificação.
Você também pode ver seu progresso e o tempo do laboratório virtual no canto
superior direito do LaboratórioPad.
Toda vez que você inicia um laboratório, o relógio no LaboratórioPad indica 8:00.
12-

Português
Bom trabalho! Agora você sabe usar as funções do LabPad. É hora de começar a
trabalhar. Você pode interagir com os objetos neste laboratório clicando neles uma vez.
Se você passar o mouse sobre um objeto, será exibida uma dica de ferramenta.
13-
Eu realmente preciso monitorar a expressão do gene RADS2 sem matar as células

de levedura!
Clique aqui para continuar.
14-
Eu não entendo isso ... Nenhum dos resultados é útil!


Português
15-
Como posso monitorar a expressão do gene em uma célula viva?

16-
Preciso encontrar uma ótima solução e preciso AGORA.


Português
17-
Vou ao aquário fazer uma pausa ...

18-
Talvez a solução venha de alguma forma para mim.


Português
19-
Todos esses peixes ... Eles são tão bonitos.

21-
Água-viva, é claro!
Clique aqui para continua

Português
22-
Eles brilham porque produzem proteína verde fluorescente ...
23-
Por que eu não pensei nisso antes? Clique aqui para continuar.

Português
24-
Ah, sim, estou pronto para iniciar a pesquisa sobre FtADS2 e reparo de DNA! Clique
aqui para continuar.
25-
Bem vindo de volta! Vejo que você teve um 'momento eureka'. Às vezes, sair do seu
espaço regular pode resultar em uma ótima ideia criativa.
Estamos estudando mecanismos de reparo de DNA induzidos por radiação e

suspeitamos que RAD52 é um jogador importante na reparação de danos no DNA.
Nós simplesmente não sabemos como monitorar a expressão de RAD52 em
leveduras sem matar as células. Sua ideia criou uma nova estratégia!

Português
26-
Precisamos detectar a expressão de RAD52 na célula de levedura. Para fazer isso,

podemos criar um sistema de gene repórter para o gene RAD52.
Usaremos a proteína fluorescente verde aprimorada da água-viva (eGFP) como gene

repórter; portanto, as células que expressam RAD52 exibem uma cor verde
fluorescente.
27-
São necessárias várias experiências para confirmar o envolvimento do RAD52 no

reparo do DNA. Precisamos adquirir um gene repórter eGFP para RAD52, montar
um plasmídeo de expressão, transformar células de levedura com o plasmídeo e
finalmente explodir as células transformadas com radiação UV para ver como elas
respondem.

Português
28-
Existem inúmeras estratégias para realizar a clonagem molecular. Neste laboratório.

você aprenderá uma técnica clássica e bem caracterizada para a clonagem
molecular.
29-
Sua primeira missão é isolar o DNA RAD52 e eGFP.

O DNA RAD52 pode ser isolado das células de levedura.
A aquisição do gene eGFP é ainda mais fácil, pois pode ser cortada de um plasmídeo
de biblioteca.
Os laboratórios costumam armazenar uma biblioteca de plasmídeos contendo certos

genes que podem ser isolados a qualquer momento.

Português
Verificaremos se as peças de DNA que estamos usando são as corretas, verificando
seu comprimento e usando eletroforese em gel
30-
Como discutimos anteriormente, o gene RAD52 pode ser isolado das células de
levedura. O que devemos fazer primeiro para poder isolar o gene de que precisamos?
a) Realize extração de DNA
b) Realizar sequenciamento de DNA
c) Use uma enzima de restrição
d) Separe o DNA usando eletroforese em gel
31-
Opção selecionada: Executar extração de DNA

Português
Está correto! Primeiro, precisamos extrair o DNA das células de levedura. Existem
vários métodos para extrair o DNA. Usaremos o método fenol-clorofórmio,
geralmente métodos para extrair o DNA. Usaremos o método fenol-clorofórmio que
é comumente usado em muitos laboratórios, mas lembre-se, fenol e clorofórmio são
ambos líquidos muito perigosos que devem ser manuseados com cuidado!
Você pode ler mais sobre a extração de DNA usando fenol-clorofórmio clicando no
botão 'Exibir teoria'
32-
Para isolar o RAD52, o que devemos fazer após extrair todo o DNA das células da
levedura?
a) Prossiga para a etapa de ligação
b) Transforme as células de levedura
c) Amplificar o gene RAD52
d) Sequenciar o DNA

Português
33-
Opção selecionada. Amplifique o gene RAD52
Brilhante! O extrato de DNA que obtemos do fermento conterá todos os genes que o
fermento precisa para sobreviver, tanto do núcleo quanto das mitocôndrias. Para
isolar especificamente o gene RAD52, realizaremos uma PCR com iniciadores
seletivos para o nosso gene de interesse. Isso amplificará apenas o gene RAD52.
34-
Há um plasmídeo contendo eGFP em sua bancada de trabalho. Como podemos

cortar o gene eGFP do plasmídeo?
a) Crescer o plasmídeo nas bactérias para que secretem o gene
b) Realizar digestão com enzimas de restrição
c) Realizar sequenciamento de DNA em todo o plasmídeo
d) Isolar o DNA usando extração fenol-clorofórmio

Português
35-
Opção selecionada: Executar digestão com enzimas de restrição.

Exatamente! Podemos realizar a digestão com enzimas de restrição para cortar a
eGFP do plasmídeo.
Geralmente já existem locais de restrição no plasmídeo onde você pode cortar e
inserir um gene. Ao identificar os lugares localizados ao redor do eGFP, podemos
executar a digestão e isolar o eGFP.
36-
Ok. Vamos preparar nossa amostra de DNA de levedura primeiro.

Seu assistente de laboratório se ofereceu para realizar a extração com fenol-
clorofórmio para você. Não é ótimo ter um assistente virtual tão diligente?
Você pode ler sobre o processo que eles usaram nas páginas de teoria.

Português
37-
Como você pode confirmar que extraímos com sucesso o DNA do fermento?
a) Pese usando uma balança analítica
b) Analise usando eletroforese em gel e o NanoDrop
c) Analise usando o transiluminador UV
d) Analise usando eletroforese em gel e uma escala analítica
38-
Opção selecionada: Analise usando eletroforese em gel e o NanoDrop

Português
Gênio! A eletroforese em gel nos permite visualizar o DNA que foi extraído.
Às vezes, a extração do DNA é malsucedida e as bandas não são visíveis durante a

eletroforese em gel. A força da banda se correlaciona com a concentração de DNA,
mas uma maneira mais precisa de medir a concentração de DNA é medi-la usando
um espectrofotômetro como o NanoDrop.
39-
Abra a tampa do NanoDrop
40-
Pipete o genoma do fermento isolado na placa NanoDrop.

Português
41-
Feche a máquina de NanoDrop e depois clique em medir
42-
Fantástico! Você mediu com sucesso a concentração de DNA genômico da levedura

usando o NanoDrop. Como você pode ver, a concentração de DNA é de 44,5 ng/µL.
O DNA genômico contém milhares de genes, mas estamos interessados apenas no
RAD52. Para obter apenas o RAD52, podemos usar primers específicos e amplificar
o RAD52.
O assistente de laboratório executará a PCR para você.
Clique na guia 'Teoria' para aprender sobre a PCR

Português
43-
Após a PCR com iniciadores específicos para o gene RAD52, podemos realizar uma
eletroforese em gel e comparar o DNA RAD52 com uma escada.
Clique no botão 'Visualizar imagem' para ver o resultado da eletroforese em gel.
O que você pode concluir sobre o tamanho do gene RAD52?

a) O gene RAD52 tem precisamente 1416 pares de base
b) O gene RAD52 tem precisamente 2543 pares de base
c) O gene RAD52 tem cerca de 3500 pares de base
d) O gene RAD52 tem cerca de 1500 pares de base
44-
Opção selecionada: O gene RAD52 tem cerca de 1500 pares de bases

Português
Excelente! Com base no resultado da eletroforese em gel, você pode concluir que o
RAD52 tem cerca de 1500 pares de bases. De pesquisas anteriores, sabemos que o
gene RAD52 tem 1416 pares de bases.
Isso sugere que isolamos o gene correto.
45-
Onde está localizado o gene eGFP?

Você pode encontrar essas informações clicando no botão 'Visualizar imagem' e
visualizar o mapa de plasmídeo.
a) Na posição 1-267
b) Na posição 702
c) Na posição 4670-4890
d) Na posição 2506-3225
46-

Português
Opção selecionada: Na posição 2506-3225
Precisamente! Estes números correspondem às posições dos pares de bases no

plasmídeo. O gene eGFP começa na 2506ª posição e termina na 3225ª posição.
Um mapa de plasmídeo contém muitas informações, como a posição dos genes e os

locais de restrição.
Como você pode ver, existem muitos locais de restrição localizados neste plasmídeo.
No começo, pode ser confuso ler um mapa de plasmídeo. Aproveite o tempo para
estudar o mapa e identificar as partes do plasmídeo em que você está interessado.
Nesse caso. é o gene eGFP.
47-
Quais duas enzimas de restrição cortam esse plasmídeo uma vez e podem ser
usadas para isolar o gene eGFP?
Clique no botão 'Visualizar imagem' e encontre os lugares de restrição únicos.

a) Só precisamos usar uma enzima
b) Ncol e Xhol
c) Notl e EcoRI
d) Xbal e Xhol

Português
48-
Opção selecionada: Xbal e Xhol
Você é demais! Podemos usar Xhol e Xbal porque ele corta em 2454 antes do eGFP
e em 3255 diretamente após o eGFP.
Também poderíamos usar o EcoRl, no entanto, ele corta em três locais diferentes e
os produtos têm tamanho bastante semelhante, dificultando o isolamento do eGFP.
Notl e Ncol não cortam diretamente antes ou antes do eGFP; portanto, não é
adequado usar essas enzimas para isolar a eGFP.
49-
Bom trabalho! Vamos usar Xhol e Xbal para cortar o eGFP do plasmídeo.

Português
Para garantir que as enzimas de restrição funcionem corretamente, precisamos
selecionar a temperatura ideal de tampão e incubação! Clique no botão 'Visualizar
imagem' para ver uma tabela contendo as condições ideais para cada enzima de
restrição.
50-
Clique no Kit de enzimas de restrição.
51-
Para garantir que as enzimas de restrição funcionem corretamente, precisamos

selecionar a temperatura ideal de tampão e incubação!
Qual buffer devemos escolher para cortar o eGFP usando Xbal e Xhol?

Português
Clique no botão “Visualizar imagem” para ver uma tabela contendo as condições
ideais para cada enzima de restrição.
a) Tampão 3
b) Tampão 4
c) Tampão 1
d) Tampão 2
52-
Opção selecionada: Buffer 3
Brilhante! Nas condições ideais de reação, a enzima possui a atividade mais alta, a
melhor fidelidade e a maior estabilidade.
O pH, os cofatores enzimáticos, a composição do sal, a força iônica e os

estabilizadores afetam e determinam a condição ideal para cortar o eGFP de seu
plasmídeo. O tampão 3 é o tampão ideal para Xbal e Xhol.

Português
53-
Clique na bolsa branca para pegar um tubo de 1,5 mL e coloque-o no rack.
54-
Use a pipeta para misturar as três soluções no tubo de 1,5 mL.
Certifique-se de que o tubo de 1,5 mL contenha apenas xhol, xbal e tampão 3. Caso
tenha adicionado substância errada, descarte o tubo na lixeira, pegue um novo tubo
e comece de novo.

Português
55-
Adicione o plasmídeo eGFP ao tubo de 1,5 mL.
56-
Coloque o tubo de 1,5 mL no bloco de aquecimento.

Português
57-
Coloque o tubo de 1,5 mL, contendo o plasmídeo Xhol, Xbal, Buffer 3 e eGFP, no
bloco de aquecimento.
58-
Qual temperatura de incubação é ideal para cortar a eGFP de seu plasmídeo?

Lembre-se de que estamos usando o Xbal e o Xhol para isolar o eGFP. Clique no
botão 'Visualizar imagem' para ver a tabela.
a) 37 ° C
b) 25 ° C
c) 65 ° C
d) 80 ° C

Português
59-
Opção selecionada. 37 ° C
Impressionante! A temperatura de incubação também determina a atividade das
enzimas de restrição
As enzimas de restrição atingirão sua atividade máxima a 37 ° C.
60-
Ajuste a temperatura para 37 C e pressione

o botão 'INICIAR.

Português
61-
As enzimas de restrição são capaz de clivar a estrutura do açúcar (fosfato do DNA)

em locais específicos. As enzimas de restrição se ligam e cortam o DNA. Existem
três tipos de extremidades de DNA geradas a partir de cortes de enzimas de
restrição.
62-
Primeiro, enzimas como o EcoRl geram extremidades 'pegajosas' 5’ pendentes.


Português
63-
Segundo. enzimas como o Bgll geram extremidades 3´pegajosas pendentes.

64-
Enzimas como Dpnl geram extremidades contundentes que não têm bases
pendentes.

Português
65-
Em resumo, a enzima de restrição cria três tipos de extremidades nas seções do

DNA: extremidades adesivas 5 ', extremidades adesivas 3' e extremidades cegas.
termina sem corte.
66-
Nas extremidades adesivas, alguns nucleotídeos de uma fita não têm bases
complementares na outra, enquanto nas extremidades cegas, ambas as fitas são
completas e complementares até a última base.

Português
67-
Você acabou de aprender os três tipos de fins criados nos fragmentos de DNA pelas
enzimas de restrição. Qual das seguintes enzimas de restrição produz cadeias de
DNA de ponta cega?
Clique no botão 'Visualizar imagem' para ver a sequência de DNA resultante para
cada uma das enzimas de restrição.
a) Xhol
b) Hind III
c) EcoRI
d) EcoRV
68-
Opção selecionada. EcoRV

Português
Você entendeu! A digestão com EcoRV resulta em uma fita de DNA de ponta cega,
isso significa que as fitas de DNA direta e reversa têm comprimentos iguais.
As cadeias de DNA para frente e para trás têm comprimentos iguais.
Clique na guia 'Teoria' se quiser aprender mais sobre as enzimas de restrição.
69-
Agora precisamos identificar qual fragmento contém o gene eGFP e separá-lo do

plasmídeo.
Podemos usar a eletroforese em gel para separar as sequências de DNA e

subsequentemente identificar qual banda corresponde ao gene eGFP.
70-
Leve o plasmídeo digerido do bloco de aquecimento para a bancada 2.

Português
71-
Pipete o plasmídeo digerido e a escada de DNA para o aparelho de eletroforese em

gel.
72-
1. Pegue a pipeta e coloque uma nova ponta.

2. Elaborar a solução plasmídica digerida.
3. Clique no aparelho de eletroforese em gel para se aproximar do gel.
4. Clique em um dos poços que ainda não contém uma amostra e carregue o
plasmídeo digerido no poço de gel vazio.
5. Repita este procedimento para a escada de DNA.
Caso você tenha adicionado a mesma substância ao poço disponível, clique no botão
Redefinir para recomeçar.

Português
73-
A corrente elétrica no aparelho de eletroforese em gel separou os fragmentos de DNA

de acordo com seu tamanho.
Você adicionou a escada de DNA e o plasmídeo digerido nos poços 1 e 2.
O assistente carregou 5 amostras desconhecidas no poço 3-7.
Você terminou de examinar o resultado da simulação de eletroforese em gel?

a) Não, ainda quero examinar o resultado.
b) Sim, eu terminei!
74-
Qual é o próximo passo após a realização de eletroforese em gel para obter o

fragmento eGFP puro que foi cortado de seu plasma

Português
a) Realize a ligação enzimática do DNA
b) Realizar analises espectrofolométricos do NanoDrop
c) Realizar digestão com enzimas de restrição
d) Realize uma extração eletroforética em gel
75-
Opção selecionada. Realize uma extração eletroforética em gel
Está correto! Separamos o eGFP do plasmídeo usando eletroforese em gel.

O próximo passo é extrair o fragmento de DNA eGFP usando o kit de extração em
gel. O kit de extração de gel pode purificar o eGFP de várias enzimas e gel de
agarose, resultando no eGFP puro.
76-

Português
Clique em 'Visualizar imagem' para ver o resultado da eletroforese em gel. A escada
de DNA está no poço 1. Nos poços 2-7, você e o assistente carregaram uma
variedade de plasmídeo digerido.
O eGFP foi isolado a partir do plasmídeo pPyCAG-eGFP-IP utilizando enzimas de

restrição Xbal e Xhol. Com base nessas informações, qual banda contém o eGFP?
Dica: eGFP (720 pb), pPyCAG-eGFP-IP (6660 pb).

a) A
b) C
c) D
d) B
77-
Opção selecionada. C
Maravilhoso! Xbal e Xhol cortam precisamente no ponto inicial e final da sequência
eGFP. Então teremos dois fragmentos, que são a espinha dorsal do plasmídeo e a
eGFP.
Com base no mapa do plasmídeo, sabemos que o eGFP tem 720 pares de base.
Depois de comparar a banda de amostra com a escada de DNA, sabemos que a
banda 'C' tem um tamanho de cerca de 700 pb e podemos concluir que essa banda
é o eGFP.

Português
78-
Pegue um tubo limpo de 1,5 mL e coloque-o no rack.
79-
Pegue o bisturi e clique no gel de eletroforese para cortar a banda que contém o
fragmento eGFP.

Português
80-
Clique no tubo limpo de 1,5 mL para colocar o gel excisado nele.
81-
Ótimo! Você coletou uma seção de gel de agarose contendo o gene eGFP. Agora
precisamos recuperar o DNA do gel usando um kit de extração de gel.
O assistente de laboratório executará a etapa de extração de gel para você.

Português
82-
Uma vez que o fragmento de DNA é purificado e concentrado, precisamos combinar

os genes RAD52 e eGFP para produzir um gene de fusão RAD52-eGFP.
O processo de fusão de fragmentos de DNA é chamado de ligação.
Vamos começar o procedimento de ligação do DNA!
83-
Abaixe o bisturi

Português
84-
Leve o tubo com o gene eGFP para a bancada 1 para realizar a ligação do DNA.
85-
Coloque o tubo no rack.

Português
86-
Pegue um novo tubo de 1,5 mL e coloque-o no rack.
87-
Adicione o gene eGFP e o gene RAD52 ao tubo.

Português
88-
Adicione o tampão ligase 10x.
89-
Adicione a ligase de DNA T4

Português
90-
Incubar a mistura de ligação usando o bloco de aquecimento a 22 ° C. Clique em

'START” para iniciar a incubação.
91-
Existem vários resultados possíveis ao realizar a ligação. Pense em quais enzimas

de restrição foram usadas para isolar os dois genes. As imagens na guia de mídia do
LabPad podem ajudar.
Qual dessas orientações de DNA está correta ao ligar RAD52 e eGFP?

a) Figura B
b) Figura A
c) Figura D
d) Figura C

Português
92-
Opção selecionada: Figura A
Bom trabalho! Esperávamos que o eGFP fosse ligado a jusante na extremidade 3 'do
RAD52 com a orientação correta, porque aqui o eGFP e o RAD52 têm extremidades
adesivas salientes compatíveis. Escolhemos especificamente as enzimas de
restrição para que o eGFP não se junte à extremidade 5 'a montante do RAD52. Isso
ocorre porque o excesso de 5 'não é complementar a nenhuma das extremidades
adesivas do eGFP e não se unirá à extremidade 5' do RAD52. Isso ocorre porque o
excesso de 5 'não é complementar a nenhuma das extremidades adesivas do eGFP.
93-
Brilhante! Você ligou com sucesso o RAD52 e o eGFP. Para colocar esse gene de
fusão em uma célula viva, devemos primeiro incorporá-lo a um plasmídeo de
expressão. Assim como fundir o RAD52 e o eGFP. a construção do plasmídeo de

Português
expressão é realizada utilizando a ligação RAD52 e eGFP. a construção do
plasmídeo de expressão é realizada usando enzimas de ligação.
Como a maioria dos plasmídeos de expressão, o que usaremos contém um gene de

resistência a antibióticos, para que possamos cultivar seletivamente apenas as
células que foram transformadas com sucesso
94-
Pegue um novo tubo de 1,5 mL e coloque-o no rack.
95-
Misture o corte pTRE e o gene RAD52-eGFP (no bloco de aquecimento) no tubo de

1,5 mL.

Português
96-
Incubar a mistura de ligação usando o bloco de aquecimento a 22 °C. Clique em

“START” para iniciar a reação.
97-
Um plasmídeo é uma molécula de DNA circular de fita dupla que pode ser usada
como vetor e pode transportar, replicar e expressar genes de interesse.

Português
98-
O gene de interesse, chamado de 'inserção', e o vetor plasmídeo, precisam ser

cortados usando uma enzima de restrição cuidadosamente selecionada. Precisamos
garantir que as peças tenham extremidades adesivas compatíveis
99-
Ter extremidades adesivas compatíveis significa que os pares de bases pendentes

no vetor e na pastilha são complementares.

Português
100-
A DNA ligase catalisa a ligação do 3'-OH ao 5’-fosfato, ligando a inserção e o vetor

juntos covalentemente
101-
A montagem do plasmídeo contendo a inserção foi bem sucedida.


Português
102-
Você fez um ótimo trabalho! O seu gene de fusão RAD52-eGFP foi ligado com
sucesso ao vetor plasmídico.
Sua próxima missão é expressar o RAD52-eGFP em um hospedeiro de expressão.

Nesse caso, transformaremos uma levedura.
A transformação é uma técnica importante, pela qual DNA exógeno, como o nosso
pTRE-RAD52-eGFP, é inserido nas células hospedeiras. As células hospedeiras
começarão a produzir proteínas baseadas no DNA exógeno
103-
Pegue o plasmídeo pTRE-R4D52-eGFF 'e vá para a bancada 3, na extremidade

esquerda do laboratório.

Português
104-
Qual das seguintes técnicas vamos usar para inserir DNA exógeno nas células de
levedura?
a) Transformação
b) Transdução
c) Todas as opções
d) Conjugação
105-
Opção selecionada. Transformação
Está certo! Nesse caso, usaremos a transformação para inserir o plasmídeo na célula
de levedura. A transformação é o único método que envolve a captação direta de
DNA.

Português
A conjugação requer contato célula a célula através de um pilus sexual.
A transdução requer um bacteriófago como intermediário para transferir o DNA de

uma célula para outra.
106-
Sabemos que o DNA exógeno não pode entrar na célula de levedura por si só. O que
devemos fazer para tornar a transformação bem-sucedida?
a) Criar células de levedura competentes
b) Tornar o crescimento médio mais rico
c) Adicione antibiótico ao meio
d) Amplificar o DNA exógeno

Português
107-
Opção selecionada: Criar células de levedura competentes
Brilhante! As células de levedura precisam ser competentes para que possam coletar
DNA exógeno do ambiente.
108-
Em laboratórios de biotecnologia reais, o processo de transformação pode precisar

ser repetido várias vezes antes de obter uma transformação bem-sucedida. Isso
geralmente é necessário porque há muitas variáveis envolvidas em uma única
transformação. Neste laboratório virtual, todos esses parâmetros foram otimizados
para sua conveniência.
Eu preparei as células de levedura competentes para você. Tudo o que você precisa
fazer agora é executar o procedimento de transformação usando um eletroporador.

Português
Tenha cuidado ao usar um eletroporador, pois ele é capaz de produzir uma tensão
de até 3.000 volts.
109-
Coloque o plasmídeo pTRE-RAD52-eGFP no rack.
110-
Misture o plasmídeo pTRE-RAD52-eGFP e as células competentes em uma nova

cubeta

Português
111-
Coloque a cubeta dentro da eletroporatora e pressione “COMECAR”
112-
Transfira o plasmídeo e a levedura da cubeta para um novo tubo de 1,5 mL e coloque-

o no gelo.

Português
113-
É comum que apenas algumas das células de levedura absorvam com sucesso o
plasmídeo. Como determinamos quais colônias de leveduras contêm o plasmídeo
pTRE-RAD52-eGFP?
a) Através de eletroforese em gel

b) Através da seleção de antibióticos
c) Não pode ser determinado
d) Sequenciando cada colônia
114-
Opção selecionada: Através da seleção de antibióticos
Está correto! Colônias de leveduras que contêm o plasmídeo pTRE-RAD52-eGFP

expressarão o gene de resistência a antibióticos. Isso indica que as colônias de

Português
levedura sem o plasmídeo são incapazes de exibir resistência a antibióticos e
morrerão quando cultivadas em um meio contendo o antibiótico específico
115-
Nossa próxima missão é cultivar e selecionar qual colônia contém o plasmídeo pTRE-
RAD52-eGFP. Somente as células que foram transformadas com sucesso
expressam um gene de resistência a antibióticos e crescem em um meio que contém
o medicamento.
O plasmídeo que usamos contém um gene de resistência à doxiciclina.
116-
1. Clique no bico de Bunsen para ligá-lo.

2. Coloque uma placa de ágar ao lado do bico de Bunsen.

Português
117-
Pipete a mistura plasmídeo-levedura do tubo de 1,5 mL na geladeira para a placa de

ágar.
118-
Esterilize a espátula Drigalski usando o bico de Bunsen antes de clicar na placa de

ágar.

Português
119-
Espalhe a cultura do fermento uniformemente. Você precisa obter 90% de cobertura

em menos de um minuto. Clique e arraste nas placas
120-
Parece que você não conseguiu espalhar a bactéria por toda a placa de ágar. Quanto
melhor as células são espalhadas, mais fácil é isolar uma única colônia na próxima
etapa. Vamos incubar as células e ver se você as espalhou uniformemente o
suficiente.

Português
121-
Incubar a placa de ágar na incubadora na bancada 2.
122-
Ótimo! Retire a placa da incubadora e coloque-a na bancada 3.

Português
123-
Qual colônia devemos escolher para a análise da expressão?
124-
Opção selecionada: A
Excelente! Precisamos escolher uma única colônia.
B é uma única colônia, mas tem uma cor diferente do que o resto das colônias. Essa
diferença de cor pode indicar a possibilidade de contaminação; portanto, devemos
escolher a colônia A.

Português
125-
Por que devemos escolher uma única colônia?

a) Todas as respostas estão corretas
b) Evitar grande variação genética na cultura expandida
c) Para garantir que todas as células cultivadas sejam clones genéticos de uma única
célula original
d) Para garantir que todas as células de levedura cultivadas sejam idênticas
126-
Opção selecionada. Todas as respostas estão corretas
Boa escolha! Uma colônia de leveduras representa um grupo de células originadas

de uma célula original; portanto, todas as células em uma única colônia são idênticas
e contêm a mesma informação genética.

Português
127-
Maravilhoso! Você obteve com sucesso células de levedura transformadas. Para

garantir que temos células suficientes para a nossa próxima missão, precisamos
cultivar ainda mais nossa levedura transformada em caldo nutritivo.
Lembre-se de trabalhar assepticamente para minimizar as chances de

contaminação!
128-
Ótimo! Retire o prato da incubadora e coloque-o na bancada 3.

Português
129-
Esterilize o laço na chama do bico de Bunsen.
130-
Escolha uma única colônia usando a alça de arame e transfira-a para o meio caldo
nutritivo.

Português
131-
Incubar a cultura de levedura (levedura + meio caldo nutriente) na incubadora na

bancada 2.
132-
Dada a temperatura, pH e nutrientes certos, as células de levedura se multiplicam.

Mais comumente por uma forma de reprodução assexuada chamada brotamento.

Português
133-
Um pequeno botão é formado na célula-mãe, então o núcleo se divide e metade dele

migra para o pequeno botão. Isso vai crescer na célula filha. O processo é repetido,
produzindo muitas células de levedura.
134-
Qual das seguintes imagens você esperaria ao inocular e incubar a levedura

transformada em meio caldo? Clique no botão 'Visualizar imagem' para ver as
imagens.
a) Figura II porque as células de levedura não se multiplicaram no meio
b) Figura II porque as células de levedura se multiplicaram no meio
c) Figura I porque as células de levedura não se multiplicaram no meio
d) Figura I porque as células de levedura se multiplicaram em meio

Português
135-
Opção selecionada. Figura I porque as células de levedura se multiplicaram no meio
Está correto! As células de levedura crescerão e se multiplicarão exponencialmente.

O aumento da densidade das células de levedura fará com que o meio do caldo
pareça turvo.
136-
Em que fase devemos começar a expandir a cultura do fermento em uma nova placa
de ágar?
a) Quando a cultura de levedura atinge a fase estacionária
b) Quando a cultura de levedura atinge a fase logarítmica
c) Quando a cultura de levedura atinge a fase lag
d) Quando a cultura de levedura atinge a fase de declínio

Português
137-
Opção selecionada. Quando a levedura atinge a fase logarítima
Maravilhoso! Começamos a espalhar a cultura do fermento durante o tempo de

duplicação mais ativo (fase logarítmica). O objetivo do uso de levedura na fase de
log é garantir que as células de levedura possam crescer adequadamente na nova
mídia.
138-
Agora que temos as células de levedura transformadas, podemos expô-las à luz UV

para induzir danos ao DNA. Se o RAD52 estiver envolvido na via de reparo, a
irradiação das células deve desencadear a expressão da nossa proteína de fusão
RAD52-eGFP.

Português
139-
Como o gene RAD52-eGFP pode nos ajudar a estudar o mecanismo de reparo do

DNA?
a) Analise o gene RAD52 com sequenciamento
b) Podemos observar a eGFP
c) Conhecemos a sequência de DNA da eGFP
d) Levedura transformada crescerá melhor à luz UV
140-
Opção selecionada. Podemos observar o eGFP
Gênio! Quando o RAD52 é expresso, o eGFP também será produzido porque você
uniu os dois genes. Se você acender uma luz azul no GFP, ele emitirá luz verde. Se
você expuser suas colônias à luz azul, poderá decifrar visualmente quais colônias
expressam RAD52 e quais não.

Português
Há uma placa de ágar com as células de levedura pTRE-RAD52-eGFP
transformadas na bancada 3. Vamos observá-la no transiluminador.
141-
Siga estas etapas:

1. Vá para bancada 3.
2. Abra a tampa do transiluminador UV clicando no botão 'OPEN'. Depois clique em
'VOLTAR'.
3. Coloque a placa DOX (-) no transiluminador.
4. Feche a tampa.
A placa DOX (-) contém ágar e cultura de levedura pTRE-RAD52-eGFP. Não contém
doxiciclina

Português
142-
Feche a tampa e acenda a luz azul.
143-
Dê uma olhada nas colônias de leveduras sob a luz azul.

Obviamente, não há eGFP produzido. Isso significa que nosso gene p'TRE-RAD52-
eGFP não é expresso.
Agora vamos expor as células de levedura à radiação UV para ver se isso altera a
expressão do RAD52.

Português
144-
Ligue a luz UV.
145-
O DNA é suscetível a mudanças pontuais que levariam a danos no DNA. A radiação

UV é uma das influências físicas que podem causar danos ao DNA.

Português
146-
Existem muitos tipos de danos no DNA, mas, essencialmente, podem ser quebras de
fita simples ou de fita dupla.
147-
Nas quebras de fita simples, as polimerases de DNA atuam preenchendo a lacuna

na fita de DNA quebrada.
148-

Português
Então, a DNA ligase sela a fita de DNA.

149-
Nas quebras de fita dupla, o complexo MRN que consiste nas proteínas Mrell, Rad50
e Nbs se liga à extremidade 5 'da fita de DNA quebrada.
150-

Português
O complexo MRN digere a cadeia de DNA na direção 5 'para 3'.
151-
O RAD52 se liga ao excesso de 3 '.

152-

Português
O RAD52 interage com o RAD51, desencadeando uma troca de fitas de DNA com
uma seção homóloga em outro cromossomo. O fio trocado é usado como modelo
para reparo.
153-
A DNA polimerase sintetiza a parte que falta das fitas de DNA
154-

Português
A DNA Ligase adiciona o nucleotídeo final para selar a ruptura.
155-
A área onde as duas vertentes são cruzadas é chamada de 'junção de Holliday'.

Quando os dois fios são separados enzimaticamente - novamente, ficamos com a
junção resolvida.
156-

Português
Agora, incube a cultura do fermento na incubadora na bancada 2.
157-
Durante a incubação, as células da levedura expressam proteínas de reparo do DNA,

a fim de reparar os danos causados pela exposição aos raios UV.
Vamos ver se o RAD52 também é expresso.
158-

Português
1. Pegue a placa de ágar na incubadora.

2. Volte a bancada 3 e coloque-o no transiluminador.
159-
Feche a tampa e acenda a luz azul.
160-

Português
Fantástico. As colônias de leveduras emitem luz.

Isso significa que nosso gene pTRE-RAD52-eGFP é expresso.
Não é incrível como podemos usar técnicas de clonagem molecular para fundir duas
proteínas, a fim de observar processos moleculares?
161-
Sua pontuação foi salva juntamente com o seu progresso de 100%.

Parabéns, você concluiu a simulação. Esperamos que você tenha gostado e se sinta
mais sábio agora!
Pressione EXIT para fechar a simulação. Isso abrirá uma pesquisa. Por favor,
dedique um minuto para fornecer seus comentários, isso nos ajudará a melhorar o
Labster.

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Eu não entendo isso ... Nenhum dos resultados é útil!

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Precisamos detectar a expressão de RAD52 na célula de levedura. Para fazer isso,

Usaremos a proteína fluorescente verde aprimorada da água-viva (eGFP) como gene

São necessárias várias experiências para confirmar o envolvimento do RAD52 no

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Existem inúmeras estratégias para realizar a clonagem molecular. Neste laboratório.

Sua primeira missão é isolar o DNA RAD52 e eGFP.

Os laboratórios costumam armazenar uma biblioteca de plasmídeos contendo certos

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Opção selecionada: Executar extração de DNA

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Opção selecionada. Amplifique o gene RAD52

Há um plasmídeo contendo eGFP em sua bancada de trabalho. Como podemos

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Opção selecionada: Executar digestão com enzimas de restrição.

Ok. Vamos preparar nossa amostra de DNA de levedura primeiro.

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Opção selecionada: Analise usando eletroforese em gel e o NanoDrop

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Às vezes, a extração do DNA é malsucedida e as bandas não são visíveis durante a

Abra a tampa do NanoDrop

Pipete o genoma do fermento isolado na placa NanoDrop.

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Feche a máquina de NanoDrop e depois clique em medir

Fantástico! Você mediu com sucesso a concentração de DNA genômico da levedura

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O que você pode concluir sobre o tamanho do gene RAD52?

Opção selecionada: O gene RAD52 tem cerca de 1500 pares de bases

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Onde está localizado o gene eGFP?

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Precisamente! Estes números correspondem às posições dos pares de bases no