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LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR / GENÉTICA

HIBRIDIZAÇÃO

INSTRUÇÕES GERAIS

1. Neste experimento, você irá aprender o método de FISH e o ARRAY CGH.

2. Utilize a seção “Recomendações de Acesso” para melhor aproveitamento da


experiência virtual e para respostas às perguntas frequentes a respeito do
VirtuaLab.

3. Caso não saiba como manipular o Laboratório Virtual, utilize o “Tutorial


VirtuaLab” presente neste Roteiro.

4. Caso já possua familiaridade com o Laboratório Virtual, você encontrará as


instruções para realização desta prática na subseção “Procedimentos”.

5. Ao finalizar o experimento, responda aos questionamentos da seção “Avaliação


de Resultados”.

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RECOMENDAÇÕES DE ACESSO
PARA ACESSAR O VIRTUALAB

ATENÇÃO:

O LABORATÓRIO VIRTUAL DEVE SER ACESSADO POR COMPUTADOR. ELE NÃO DEVE SER
ACESSADO POR CELULAR OU TABLET.

O REQUISITO MÍNIMO PARA O SEU COMPUTADOR É UMA MEMÓRIA RAM DE 4 GB.

SEU PRIMEIRO ACESSO SERÁ UM POUCO MAIS LENTO, POIS ALGUNS PLUGINS SÃO
BUSCADOS NO SEU NAVEGADOR. A PARTIR DO SEGUNDO ACESSO, A VELOCIDADE DE
ABERTURA DOS EXPERIMENTOS SERÁ MAIS RÁPIDA.

1. Caso utilize o Windows 10, dê preferência ao navegador Google Chrome;


2. Caso utilize o Windows 7, dê preferência ao navegador Mozilla Firefox;
3. Feche outros programas que podem sobrecarregar o seu computador;
4. Verifique se o seu navegador está atualizado;
5. Realize teste de velocidade da internet.

Na página a seguir, apresentamos as duas principais dúvidas na utilização dos


Laboratórios Virtuais. Caso elas não se apliquem ao seu problema, consulte a nossa seção
de “Perguntas Frequentes”, disponível em: https://algetec.movidesk.com/kb/pt-br/

Neste mesmo link, você poderá usar o chat ou abrir um chamado para o contato com
nossa central de suporte. Se preferir, utilize os QR CODEs para um contato direto por
Whatsapp (8h às 18h) ou para direcionamento para a central de suporte. Conte conosco!

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PERGUNTAS FREQUENTES

1) O laboratório virtual está lento, o que devo fazer?

a) No Google Chrome, clique em “Configurações” -> “Avançado” -> “Sistema” ->


“Utilizar aceleração de hardware sempre que estiver disponível”. Habilite a
opção e reinicie o navegador.

b) Verifique as configurações do driver de vídeo ou equivalente. Na área de


trabalho, clique com o botão direito do mouse. Escolha “Configurações
gráficas” e procure pela configuração de performance. Escolha a opção de
máximo desempenho.

Obs.: Os atalhos e procedimentos podem variar de acordo com o driver de


vídeo instalado na máquina.

c) Feche outros aplicativos e abas que podem sobrecarregar o seu computador.

d) Verifique o uso do disco no Gerenciador de Tarefas (Ctrl + Shift + Esc) ->


“Detalhes”. Se estiver em 100%, feche outros aplicativos ou reinicie o
computador.

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2) O laboratório apresentou tela preta, como proceder?

a) No Google Chrome, clique em “Configurações” -> “Avançado” -> “Sistema” ->


“Utilizar aceleração de hardware sempre que estiver disponível”. Habilite a
opção e reinicie o navegador. Caso persista, desative a opção e tente
novamente.

b) Verifique as configurações do driver de vídeo ou equivalente. Na área de


trabalho, clique com o botão direito do mouse. Escolha “Configurações
gráficas” e procure pela configuração de performance. Escolha a opção de
máximo desempenho.

Obs.: Os atalhos e procedimentos podem variar de acordo com o driver de


vídeo instalado na máquina.

c) Verifique se o navegador está atualizado.

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DESCRIÇÃO DO LABORATÓRIO

MATERIAIS NECESSÁRIOS

• 2x SSC;
• Álcool a 70%, 90% e 100%;
• Amostra DNA referência e DNA teste;
• Berço lâmina;
• Braçadeira metálica;
• Câmara úmida;
• Chapa de aquecimento;
• Estufa bacteriológica;
• H2O destilada;
• Hipoclorito de sódio;
• Lâmina de vidro e Lamínula aCGH;
• Micropipeta 10 µL;
• Microscópio de fluorescência;
• Notebook;
• Óleo de imersão;
• Pinça metálica;
• Scanner;
• Silicone;
• Solução DAPI/antifade;
• Solução de lavagem 1;
• Solução de lavagem 2;
• Sonda.

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PROCEDIMENTOS

1. SELECIONANDO O EXPERIMENTO

Visualize o menu numérico, de 1 e 2, dos métodos a serem realizados: Hibridização da


sonda (Fish) e Método Array CGH (aCGH).

HIBRIDIZAÇÃO DA SONDA

2. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO

Higienize as mãos na pia. Coloque os equipamentos de proteção individual localizados


no “Armário de EPIs”: jaleco, luvas, óculos e máscara.

3. PREPARANDO A LÂMINA

Pipete 5 µL da sonda na lâmina com o material fixado. Em seguida, coloque a lamínula


e aplique o silicone com a bisnaga. Leve a lâmina para chapa de aquecimento e ligue-a,
deixe aquecendo por 5 minutos. Retire a lâmina da chapa, coloque-a na câmara úmida,
leve para a estufa e incube overnight. Retire a câmara da estufa e a lâmina de dentro
dela e, em seguida, retire o silicone e lamínula com a pinça.

4. REMOVENDO O EXCESSO DE SOLUÇÃO

Coloque a lâmina dentro do berço e leve para a cuba contendo a solução 2SSC. Incube
por 2 minutos. Depois mova o berço para a cuba com água destilada e deixe incubando
por 20 segundos. Em seguida, mova o berço para a cuba com álcool 70%. Repita esse
mesmo processo para o álcool 90 % e 100%.

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5. VISUALIZANDO A LÂMINA NO MICROSCÓPIO

Coloque a lâmina na banca e espere secar. Em seguida, pipete 10 µL de DAPI na lâmina,


coloque uma lamínula por cima, leve ao microscópio e observe até a objetiva de 100x.
Lembre-se de adicionar o óleo de imersão para visualizar a lâmina na objetiva de maior
aumento. Ligue o notebook para concluir observação.

6. SELEIONANDO O EXPERIMENTO

Visualize o menu numérico, de 1 e 2, dos métodos a serem realizados: Hibridização da


sonda e

MÉTODO ARRAY CGH (aCGH)

7. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO

Higienize as mãos na pia. Coloque os equipamentos de proteção individual localizados


no “Armário de EPIs”: jaleco, luvas, óculos e máscara.

8. MIX DAS AMOSTRAS

Pipete na lâmina: 10 µL da amostra de DNA referência e 10 µL da amostra de DNA teste.

9. HIBRIDIZAÇÃO

Leve a lâmina para abraçadeira de fixação, coloque a lamínula e feche a braçadeira.


Mova a braçadeira para o agitador e ligue-o e deixe a amostra por 24 horas.

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10. REMOÇÃO DO EXCESSO DA AMOSTRA

Retire a braçadeira do agitador, a lâmina de dentro da braçadeira e coloque no berço.


Leve o berço para a cuba contendo a solução de lavagem 1. Em seguida, leve para o
agitador e deixe por 5 minutos. Depois mova o berço para a cuba com solução de
lavagem 2 e retorne para o agitador deixando por 5 minutos a rotação de 20 rpm a
37°C.

11. DETECÇÃO DA FLUORESCÊNCIA

Retire a cuba do agitador, retire o berço da cuba, coloque a lâmina na banca e espere
secar. Ligue o computador, selecione o ícone “Scanner array” e leve a lâmina para o
scanner.

12. AVALIANDO OS RESULTADOS

Siga para a seção “Avaliação dos Resultados”, neste roteiro, e responda de acordo
com o que foi observado nos experimentos

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AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS

1. Qual a diferença do método FISH para o aCGH?

2. Quais são as aplicações para esses dois métodos?

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TUTORIAL VIRTUALAB

1. SELECIONANDO O EXPERIMENTO

Visualize o menu numérico, de 1 e 2, dos métodos a serem realizados: Método Fish e


Método aCGH.

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Selecione o “Método Fish” clicando com o botão esquerdo do mouse.

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2. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO

Visualize a pia clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome “Pia”
localizada dentro do painel de visualização no canto superior esquerdo da tela. Se
preferir, também pode ser utilizado o atalho do teclado “Alt+1”.

Lave as mãos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a pia.

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Visualize o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o
nome “Armário de EPIs” ou através do atalho do teclado “Alt+2”.

Abra o armário de EPI clicando com o botão esquerdo do mouse sobre as portas.

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Selecione os EPIs necessários para a realização do ensaio clicando com o botão esquerdo
do mouse sobre eles. Nesse experimento, é obrigatório o uso de jaleco e luvas.

Feche as portas do armário clicando com o botão esquerdo do mouse sobre as portas.

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3. PREPARANDO A LÂMINA

Visualize a bancada clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome
“Experimento” ou através do atalho do teclado “Alt+3”.

Ajuste o volume da micropipeta clicando com o botão direito do mouse e selecione a


opção “Reajustar volume”.

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Configure o volume para 5 µL utilizando o seu teclado numérico e confirme clicando


com o botão esquerdo do mouse em “Ok”.

Destampe o tubo com substância fluorescente clicando com o botão esquerdo do


mouse na sonda.

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Pipete 5 µL da substância fluorescente clicando com o botão direito do mouse na


micropipeta e selecione a opção “Colocar em sonda”.

Mova a micropipeta clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione


a opção “Colocar em lâmina”.

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Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione a


opção “Desprezar líquido”.

Coloque a lamínula clicando com o botão esquerdo do mouse na lamínula.

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Aplique o silicone clicando com o botão esquerdo do mouse na bisnaga de silicone.

Mova a lâmina clicando com o botão esquerdo do mouse na lâmina.

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Ligue a chapa de aquecimento clicando com o botão esquerdo do mouse nos botões
indicados.

Aqueça a lâmina por 5 minutos ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do
mouse em “Avançar”.

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Retire a lâmina da chapa clicando com o botão direito do mouse na lâmina e selecione
a opção “Colocar na bancada”.

Mova a lâmina para a câmara úmida clicando com o botão esquerdo do mouse na
lâmina.

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Tampe a câmara úmida clicando com o botão esquerdo do mouse na câmara úmida.

Mova câmara para a estufa clicando com o botão direito do mouse na câmara úmida e
selecione a opção “Colocar na estufa bacteriológica”.

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Feche a porta da estufa clicando com o botão esquerdo do mouse na porta da estufa
bacteriológica.

Ligue a estufa clicando com o botão esquerdo do mouse no botão “Power”.

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Incube a lâmina por 24 horas ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do
mouse em “Avançar”.

Abra a estufa clicando com o botão esquerdo do mouse na porta da estufa


bacteriológica.

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Retire a câmara úmida clicando com o botão esquerdo do mouse na câmara úmida.

Destampe a câmara clicando com o botão esquerdo do mouse na câmara úmida.

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Retire a lâmina clicando com o botão direito do mouse na lâmina e selecione a opção
“Retirar objetos”.

Retire o silicone clicando com o botão esquerdo do mouse na pinça metálica.

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Retire a lamínula clicando com o botão esquerdo do mouse na lamínula.

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4. REMOVENDO O EXCESSO DE SOLUÇÃO

Coloque a lâmina no berço clicando com o botão esquerdo do mouse na lâmina.

Mova a o berço de lâminas clicando com o botão esquerdo do mouse no berço de


lâminas.

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Incube a lâmina por 2 minutos ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo do
mouse em “Avançar”.

Mova a o berço de lâminas clicando com o botão esquerdo do mouse no berço de


lâminas.

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Repita esse processo para a cubras com o álcool a 70%, 90% e 100%.

Retire o berço de lâminas clicando com o botão esquerdo do mouse na cuba com álcool
a 100%.

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5. VISUALIZANDO A LÂMINA NO MICROSCÓPIO

Retire a lâmina clicando com o botão direito do mouse no berço de lâminas.

Espere a lâmina secar por 1 minuto ou avance o tempo clicando com o botão esquerdo
do mouse em “Avançar”.

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Ajuste o volume da micropipeta clicando com o botão direito do mouse e selecione a


opção “Reajustar volume”.

Configure o volume para 10 µL utilizando o seu teclado numérico, em seguida, clique


em “ok” com o botão esquerdo do mouse.

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Pipete 10 µL clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione a opção


“Colocar em DAPI/Antifade”.

Mova a micropipeta clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione


a opção “Colocar em lâmina”.

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Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione a


opção “Desprezar líquido”.

Coloque a lamínula clicando com o botão esquerdo do mouse na lamínula.

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Mova a lâmina clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione a


opção “Levar para microscópio”.

Visualize o interruptor do microscópio clicando com o botão esquerdo do mouse na


câmera com o nome “Microscópio Lateral” ou através do atalho do teclado “Alt+6”.

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Ligue o microscópio clicando com o botão esquerdo do mouse no interruptor localizado


na base lateral do equipamento.

Visualize o microscópio clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o


nome “Microscópio” ou através do atalho do teclado “Alt+5”.

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Movimente as lentes objetivas pressionando com o botão esquerdo do mouse sobre o


revólver e movimentando o cursor à direita ou à esquerda.

Realize o ajuste do foco pressionando o botão esquerdo do mouse sobre o parafuso


macrométrico e movimentando o cursor à direita ou à esquerda.

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Se for necessário um ajuste mais apurado do foco, gire o botão micrométrico


pressionando o botão esquerdo do mouse sobre ele e movimentando o cursor à direita
ou à esquerda.

Para movimentar a lâmina à direita ou à esquerda, gire a peça inferior do charriot


pressionando com o botão esquerdo do mouse sobre ela e movimentando o cursor à
direita ou à esquerda.

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Para movimentar a lâmina à frente ou para trás, gire a peça superior do charriot
pressionando com o botão esquerdo do mouse sobre ela e movimentando o cursor à
direita ou à esquerda.

Visualize a lâmina clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o ícone “ver ocular”
localizado abaixo do ícone da engrenagem no canto superior direito da tela.

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Visualize a lâmina em todas as objetivas pressionando com o botão esquerdo do mouse


sobre o revólver e movimentando o cursor à direita ou à esquerda.

Para análise na objetiva de 100 X coloque o óleo de imersão na lâmina clicando com o
botão esquerdo do mouse no óleo de imersão.

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Visualize o notebook clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome
“Notebook” ou através do atalho do teclado “Alt+7”.

Ligue o Notebook clicando com o botão esquerdo do mouse no botão “on/off”.

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Inicie o programa clicando com o botão esquerdo do mouse no ícone “Analisar DNA”.

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6. SELECIONANDO O EXPERIMENTO

Visualize as opções para selecionar o experimento clicando com o botão esquerdo do


mouse em “Opções”.

Selecione o “Método aCGH” clicando com o botão esquerdo do mouse.

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7. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO

Visualize a pia clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome “Pia”
localizada dentro do painel de visualização no canto superior esquerdo da tela. Se
preferir, também pode ser utilizado o atalho do teclado “Alt+1”.

Lave as mãos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a pia.

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Visualize o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o
nome “Armário de EPIs” ou através do atalho do teclado “Alt+2”.

Abra o armário de EPI clicando com o botão esquerdo do mouse sobre as portas.

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Selecione os EPIs necessários para a realização do ensaio clicando com o botão esquerdo
do mouse sobre eles. Nesse experimento, é obrigatório o uso de jaleco e luvas.

Feche as portas do armário clicando com o botão esquerdo do mouse sobre as portas.

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8. MIX DAS AMOSTRAS

Visualize a bancada clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome
“Experimento” ou através do atalho do teclado “Alt+3”.

Destampe os tubos Eppendorf clicando com o botão esquerdo do mouse na sonda.

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Pipete 10 µL da substância fluorescente clicando com o botão direito do mouse na


micropipeta e selecione a opção “Colocar em amostra DNA referência”.

Mova a micropipeta clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione


a opção “Colocar em lâmina”.

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Torque a ponteira clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione a


opção “Trocar ponteira”.

Pipete 10 µL da substância fluorescente clicando com o botão direito do mouse na


micropipeta e selecione a opção “Colocar em amostra DNA teste”.

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HIBRIDIZAÇÃO

Mova a micropipeta clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione


a opção “Colocar em lâmina”.

Torque a ponteira clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecione a


opção “Trocar ponteira”.

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9. HIBRIDIZAÇÃO

Mova a lâmina clicando com o botão esquerdo do mouse na lâmina.

Mova a lamínula clicando com o botão esquerdo do mouse na lâmina.

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Monte a braçadeira clicando com o botão esquerdo do mouse na braçadeira.

Mova a braçadeira clicando com o botão direito do mouse na braçadeira e selecione a


opção “Colocar em chapa de aquecimento”.

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HIBRIDIZAÇÃO

Ligue a chapa de aquecimento clicando com o botão esquerdo do mouse nos botões
indicados.

Mantenha a chapa em aquecimento a 20 RPM por 24 horas. Avance o tempo clicando


com o botão esquerdo do mouse em “Avançar”.

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10.REMOVENDO O EXCESSO DA AMOSTRA

Retire a braçadeira clicando com o botão direito do mouse na braçadeira e selecione a


opção “Colocar na bancada”.

Desmonte a braçadeira clicando com o botão esquerdo do mouse na braçadeira.

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Retire a lâmina clicando com o botão direito do mouse na lâmina e selecione a opção
“Retirar lâmina”.

Coloque a lâmina na braçadeira clicando com o botão esquerdo do mouse na lâmina.

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Mova o berço clicando com o botão esquerdo do mouse na lâmina.

Mova a cuba clicando com o botão direito do mouse na cuba e selecione a opção
“Colocar em agitador”.

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Ligue a chapa de aquecimento clicando com o botão esquerdo do mouse nos botões
indicados.

Mantenha a chapa de aquecimento ligada por 5 minutos. Avance o tempo clicando cm


o botão esquerdo do mouse em “Avançar”.

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Mova a cuba clicando com o botão direito do mouse na cuba e selecione a opção
“Colocar na bancada”.

Mova o berço clicando com o botão esquerdo do mouse no berço.

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Mova a cuba clicando com o botão direito do mouse na cuba e selecione a opção
“Colocar em agitador”.

Ligue a chapa de aquecimento clicando com o botão esquerdo do mouse nos botões
indicados.

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Mantenha a chapa de aquecimento ligada por 5 minutos. Avance o tempo clicando cm


o botão esquerdo do mouse em “Avançar”.

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11. DETECÇÃO DE FLUORESCÊNCIA

Mova a cuba clicando com o botão direito do mouse na cuba e selecione a opção
“Colocar na bancada”.

Mova o berço clicando com o botão direito do mouse na cuba e selecione a opção
“Colocar na bancada”.

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Retire a lâmina clicando com o botão direito do mouse no berço.

Mantenha a lâmina secando por 1 minuto. Avance o tempo clicando com o botão
esquerdo do mouse em “Avançar”.

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Mova a lâmina clicando com o botão esquerdo do mouse na lâmina.

Feche a tampa do scanner clicando com o botão esquerdo do mouse no scanner.

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Visualize o notebook clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome
“Notebook” ou através do atalho do teclado “Alt+6”.

Ligue o notebook clicando com o botão esquerdo do mouse no botão “on/off”.

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Inicialize o sistema do scanner clicando com o botão esquerdo do mouse no ícone do


programa.

Analise o resultado clicando com o botão esquerdo do mouse em “Analisar”.

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12. AVALIANDO OS RESULTADOS

Siga para a seção “Avaliação dos Resultados”, neste roteiro, e responda de acordo com
o que foi observado nos experimentos.

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