INTRODUÇÃO ÀS CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

GUIA DE TRABALHOS LABORATORAIS TL1 e TL2

TL1. – TÉCNICAS DE LABORATÓRIO EM BIOQUÍMICA
Nestas duas aulas (TL1A e TL1B) pretende-se dar a conhecer aos alunos algumas técnicas
básicas em Bioquímica e introduzir o conceito de enzimas e reações enzimáticas.

TL1.A – TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE AMINOÁCIDOS

Os 20 -aminoácidos fundamentais constituem-se como as unidades que compõem as
proteínas. Cada um dos aminoácidos, ligado a um átomo de carbono central (alfa), contém
um grupo amina, -NH2, um grupo carboxilo, -COOH, um átomo de hidrogénio e um grupo R,
variável entre os 20 aminoácidos.

De um modo geral, em sistemas biológicos, o valor de pH do meio é próximo da neutralidade

(pH 7). Deste modo, um dado aminoácido apresentará o grupo amina protonado e o grupo
carboxilo desprotonado. Esta configuração representa a designada forma zwitteriónica para
o aminoácido.

Em soluções fortemente ácidas o grupo carboxilo apresentar-se-à protonado, enquanto em

soluções de elevado caracter básico (alcalinas), ambos os grupos carboxilo e amina
apresentar-se-ão na forma desprotonada.

Solução ácida Solução básica

Deste modo verifica-se que um dado aminoácido (que não contenha um grupo adicional ácido
ou básico no seu grupo R), apresenta propriedades ácido-base, comportando-se como um
ácido diprótico. A sua titulação com uma base (p. ex. NaOH) dá origem a uma curva com dois
patamares, resultado das reações abaixo indicadas:

A figura abaixo indicada representa a curva de titulação de um aminoácido (assumindo que o

mesmo não possui um grupo ionizável no seu grupo R). Para tal, avalia-se a variação do valor
de pH de uma solução do aminoácido em função da adição de equivalente de OH- (adição de
uma base forte). Na curva identificam-se dois patamares (estabilização do valor de pH para
adição de equivalentes OH-), separados por uma região em que se verifica um aumento
exponencial do valor de pH. Os vários pontos destacados ao longo da curva, bem como o seu
significado, estão de seguida indicados:

Fig. 1: Representação das várias etapas da titulação potenciométrica de um aminoácido (sem um

grupo ionizável no seu grupo R) com uma base forte. Gamas de pH em que se observa um efeito
tampão encontram-se a sombreado.
Neste caso existirão dois pK a determinar, o pKa1 e o pKa2, correspondentes à ionização do
grupo COOH e do grupo NH3+, respectivamente. No gráfico acima estes valores de pK estão
representados pelos pontos B e D. A, C e E correspondem aos pontos da titulação onde
existem 100% de cada uma das formas em equilíbrio. Os pontos de inflexão C e E são
chamados de pontos de equivalência e correspondem à desprotonação completa de cada
uma das formas protonadas do aminoácido. Se tomarmos a equação de Handerson-
Hasselbach,

a
pH p𝐾a log
Á do

então o valor de pKa é o valor de pH para o qual existe uma concentração igual das formas
base e ácido em equilíbrio. No gráfico, esta condição é verificada nos pontos B e D, no centro
dos patamares (aproximadamente 2.5 e 10, neste caso).

Para o cálculo do valor de pKa, torna-se útil calcular a derivada da curva de titulação. Na figura
abaixo encontra-se representada a curva de titulação do grupo NH3+ de um aminoácido sem
o grupo R ionizável (azul) em conjunto com a função derivada desta curva (vermelho). Como
se pode observar, os máximos da derivada coincidem com o ponto de equivalência da curva
de titulação.

Fig. 2: Curva de titulação de um aminoácido ( ) com uma base forte e primeira derivada (o).

Considerando o primeiro ponto de equivalência, uma vez que corresponde ao volume

necessário para a desprotonação completa do ácido carboxílico (volume de equivalência - Veq1),
metade deste volume permitirá a desprotonação de metade da amostra de aminoácidos e
corresponderá assim ao pKa onde [Aminoácido protonado] = [Aminoácido desprotonado]. A
este volume chamamos de volume de meia-equivalência e neste ponto o pH = pKa. Para o
pKa2 (correspondente à desprotonação do NH3+), calcula-se o ponto intermédio entre dois
pontos de equivalência da curva de titulação (Veq1 e Veq2) e o pH obtido para esse volume de
equivalentes corresponderá ao pKa2.

No caso de um aminoácido sem grupos protonáveis na cadeia lateral, o ponto isoeléctrico,

onde a carga média da molécula é zero, corresponderá ao pH no volume intermédio entre
pKa1 e pKa2.

Procedimento experimental

Neste trabalho laboratorial proceder-se-á à titulação potenciométrica dos aminoácidos alanina

e ácido glutâmico.

Reagentes e material:
Solução NaOH 2M
Solução de alanina 50 mM (acertada a pH 1.8 com HCl)
Solução de ácido glutâmico 50 mM (acertada a pH 1.8 com HCl)
Medidor de pH

1. O medidor de pH terá sido previamente calibrado e estará pronto a usar.

2. Colocar 30 ml da solução 50 mM de aminoácido num copo de vidro.

3. Ler e registar o pH da solução de aminoácido (Vtitulante = 0 ml; o pH deve rondar 1.8).

4. Titular a solução de aminoácido com a solução a 2M de NaOH, adicionando as gotas

lentamente (0.1 ml em 0.1 ml). Mantenha a solução em permanente agitação usando uma
barra de agitação magnética. Para cada volume de titulante adicionado registe o valor de
pH. Considere a titulação terminada quando o pH atingir o valor de 13.
TL1.A2 – ENSAIO ENZIMÁTICO DA INVERTASE
As enzimas são, na sua grande maioria, proteínas globulares com propriedades catalíticas e que
têm como função acelerar processos reacionais. As velocidades de reação enzimáticas são
tipicamente 106-1012 vezes maiores do que as correspondentes velocidades não catalisadas.
Este aumento de velocidade é produzido pelo estabelecimento de um complexo intermediário
entre o(s) substrato e a enzima, correspondente a um estado de transição, no qual menos energia
é necessária para a continuação da reação. A reação enzimática depende da interação do
substrato com um local específico da enzima, o centro ativo. Esta estrutura corresponde a uma
organização tridimensional de aminoácidos de uma ou mais regiões da enzima. Processos de
desnaturação da enzima, ao interferir com a formação desta estrutura, resultam numa
diminuição da eficiência catalítica.

A enzima invertase (beta-fructofuranosidase; EC 3.2.1.26) catalisa a hidrólise da sacarose nos

seus dois monómeros constituintes: glucose e frutose. Existem atualmente várias aplicações
industriais desta enzima, sobretudo na indústria alimentar, onde a enzima usada tem origem na
levedura.

Fig. 3: Estrutura da enzima invertase de levedura. Vista de topo, lateral e evidenciando a posição
esperada para o substrato no centro ativo da enzima.

No presente trabalho experimental irá proceder-se à quantificação da sacarose hidrolisada pela

enzima em diferentes condições, utilizando o método do DNS. Este reagente reage com os
produtos da hidrólise da sacarose, mas não com a sacarose. A reação produz um composto
corado cuja presença pode ser detetada através de medições de absorvância. Através da
comparação dos resultados com uma recta de calibração pré-preparada pelo docente, a
quantidade de sacarose hidrolisada pode ser quantificada. Será estudado o efeito do tempo de
reação e da desnaturação da enzima na atividade enzimática.
 Procedimento experimental

Soluções fornecidas:

- Solução de substrato (sacarose) a 50 g/L. Esta solução está preparada em tampão acetato 20
mM pH 4,5, contendo 1% (p/v) de cloreto de cálcio.

- Solução enzimática de invertase (0.10 mg/ml) [grau-V, da Sigma-Aldrich Co.], em tampão

acetato a pH 4.5.

Desnaturação da enzima invertase

1. Adicionar 0.75 ml da solução de invertase para 1 microtubo. O microtubo será incubado

durante 5 minutos a 80 C. Um dos grupos realizará o ensaio com esta enzima e os outros
utilizarão a enzima intacta.

Preparação do reator e dos tubos de reacção

2. Medir 25ml de solução de sacarose para o reator, e termostatizá-la a 30 ou 40ºC

(dependendo do grupo) com agitação (basta esperar cerca de 5 minutos).

3. Preparar o número de tubos de ensaio requeridos para cada ensaio (4), marcando os
tubos com B e min tos de reacção e colocando em cada 0.5 ml do
reagente de DNS.

4. Adicionar ao tubo B ml de tampão Este t bo corresponde ao branco da reacção

5. Retirar uma amostra de 0.5 ml do reator, correspondente ao tempo zero, para o t bo

6. Retirar amostras de 0.5 ml do reator aos 5 e 10 minutos de reação. As amostras devem

ser colocadas imediatamente nos tubos de ensaio e que já contêm reagente de
DNS, garantindo que todo e qualquer elemento de volume da amostra se mistura com o
reagente (para paragem da reação enzimática, devido ao simultâneo aumento do valor
de pH da solução).
7. Após a colheita e preparação das 3 amostras e do branco, colocar os respetivos tubos no
banho de água a 100ºC durante 5 minutos (para que se dê a reação dos açúcares com o
DNS).

8. Ao fim dos 5 minutos os tubos devem ser arrefecidos em água fria.

10. Adicionar 5 ml de água destilada a cada tubo arrefecido. Agitar cada tubo no vórtice.

11. Ler a absorvência de cada solução a =540 nm, contra o branco de tampão acetato pH
4.5 que sofreu o mesmo tratamento.
12. Lavar o reator.
13. Calcular a concentração de sacarose hidrolisada para cada condição.

Reta de calibração (DNS)

A reta de calibração do DNS será fornecida pelo docente. Esta reta foi obtida através da
aplicação do método do DNS[1] a soluções de glucose com concentração conhecida. Este
método consiste na aplicação do protocolo acima indicado substituindo as amostras pelas
soluções de glucose. A reta de calibração pode também ser construída com soluções de
qualquer outro açúcar redutor ou com misturas destes, pois o produto que é detetado a =
540nm resulta da reação com qualquer açúcar redutor.

BIBLIOGRAFIA
[1] Miller, G.L. (1959). Use of dinitrosalic lic acid reagent for determination of red cing s gar
Analytical Chemistry, 31:426-428.

[2] Bahar, T. e Tuncel, A. (2004). Concana alin A carr ing reacti e beads for east in ertase
p rification Reactive & Functional Polymers, 61: 203-210.
TL2 – EXTRAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO SEGUIDO DE DIGESTÃO COM ENZIMA
DE RESTRIÇÃO E VISUALIZAÇÃO POR ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

Os cromossomas de procariotas são geralmente moléculas circulares covalentemente

fechadas, embora em alguns casos se tenham observado cromossomas lineares. O
tamanho de um cromossoma bacteriano varia entre algumas centenas de kb (1 kb = 1000
pares de base) a aproximadamente 10000 kb. Algumas bactérias possuem apenas um
cromossoma, enquanto outras têm vários, apesar de terem apenas uma cópia de cada
cromossoma. Os cromossomas bacterianos contêm genes essenciais para as diversas
funções celulares e ainda genes específicos da espécie. Para além do cromossoma, as
células bacterianas podem apresentar ainda outros elementos genéticos tais como
plasmídeos, transposões, elementos de inserção e vírus (bacteriófagos).

Plasmídeos de ocorrência natural apresentam uma variação de tamanho entre 1 kb e

algumas centenas de kb. Possuem replicação autónoma e a maioria deles são circulares,
embora algumas espécies bacterianas possuam plasmídeos lineares. Os plasmídeos
contêm genes essenciais para a sua manutenção na célula (iniciação e controlo da
replicação) e ainda genes que em determinados ambientes, conferem vantagem seletiva
à célula hospedeira que o alberga. Assim, os plasmídeos podem ter genes que codificam
para resistências a antibióticos, fatores de virulência, toxinas, produção de antibióticos,
sistemas de modificação/restrição, vias metabólicas degradativas, indução de tumores em
plantas ou a fixação de azoto. Pode-se afirmar que os plasmídeos de ocorrência natural
são os responsáveis pela grande variedade fisiológica em bactérias. A partir destes
elementos genéticos naturais, é possível, por manipulação genética, construir no
laboratório vetores de clonagem, os quais são depois utilizados como veículos para
clonagem de genes. Estes elementos genéticos contêm, de um modo geral, um local de
clonagem com diversos locais únicos para determinadas enzimas de restrição, um ou mais
genes que codificam para enzimas que conferem resistência a antibióticos e regiões
promotoras, entre outros.

Neste trabalho laboratorial pretende-se extrair dois plasmídeos (o vetor de clonagem

pUC19 e o plasmídeo recombinado pLM73-2) recorrendo ao método da lise alcalina com
purificação em coluna de afinidade (trabalho TL2.A). Os plasmídeos extraídos neste
procedimento serão em seguida sujeitos a digestão com uma endonuclease de restrição
do tipo II (trabalho TL2.B) e visualização após separação dos fragmentos de restrição em
gel de agarose (trabalho TL2.C) onde será estimado o seu peso molecular aproximado.

O plasmídeo recombinado pLM73-2 tem como base o plasmídeo pUC19 onde foi clonado
um fragmento de 1911 pb relativo a um gene que codifica para uma adesina trimérica
autotransportada (BCAM2418) presente no cromossoma da bactéria Burkholderia
cenocepacia.

TL2.A – Extração do DNA plasmídico de Escherichia coli recorrendo a

lise alcalina e purificação em coluna de afinidade (Kit comercial)
O procedimento básico de qualquer protocolo de extração de DNA envolve lise celular,
com libertação de todo o material intracelular, seguida da purificação do DNA. O processo
de rompimento das células depende do sistema biológico em estudo: bactéria, célula
vegetal ou célula animal. No entanto, por norma, utiliza-se um primeiro passo executado
por ação enzimática para destruir as paredes celulares, como a lisozima para bactérias,
liticase para leveduras ou celulase para células vegetais. A lise enzimática é normalmente
complementada com utilização de um detergente, que destrói o resto das membranas.
Um processo alternativo é o rompimento mecânico, por agitação forte das células
misturadas com esferas de vidro. Após a lise celular, todos os componentes intracelulares,
como as proteínas, lípidos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, e outras moléculas orgânicas
e iões, vão ficar em solução. É, portanto, necessário no final purificar o DNA plasmídico.

Existem vários métodos de extração de DNA plasmídico. Todavia, o mais frequente é o da

lise alcalina. O método utilizado neste trabalho consiste numa modificação do método de
Birmboin & Doly (1979). A lise alcalina é feita por adição de uma solução de hidróxido de
sódio e do detergente SDS (dodecil sulfato de sódio). O detergente desnatura as proteínas
e promove a dissolução da membrana plasmática enquanto o hidróxido de sódio
promove, a pH alcalino, a desnaturação de macromoléculas (proteínas e DNA) e hidrólise
do RNA. Adiciona-se então uma solução de acetato de potássio 3 M (pH 4,5) que neutraliza
o pH do lisado e promove a precipitação do complexo SDS-proteínas. Este reequilíbrio do
pH leva à renaturação do DNA plasmídico, restabelecendo a sua conformação original.
Contudo, o DNA cromossómico, devido às suas grandes dimensões, não consegue voltar
à sua forma nativa, permanecendo sob a forma de agregados complexos.

Estes precipitados são removidos por centrifugação permitindo separar um sedimento

constituído por membranas, proteínas e DNA cromossómico de um sobrenadante onde o
DNA plasmídico se encontra dissolvido. A recuperação do DNA plasmídico pode ser feita
recorrendo à sua insolubilidade em isopropanol. No entanto, a pureza deste DNA poderá
não ser adequada para certas técnicas de Biologia Molecular. Assim sendo, neste trabalho,
iremos utilizar um kit comercial em que a solução de DNA plasmídico é transferida para
uma coluna de afinidade contendo uma resina de sílica com sais de guanidina que tem a
propriedade de fixar seletivamente o DNA. A coluna de afinidade em microtubo é depois
lavada com uma solução contendo etanol para manter o DNA insolubilizado e por fim o
DNA plasmídico é eluído com água ou tampão TE.

Procedimento experimental

1. Inocular a estirpe E. coli DH contendo os plasmídeos pUC o pLM -2 em 5 mL

de meio LB (composição em anexo) contendo 150 mg/L de ampicilina. Incubar durante
a noite a 37°C, com agitação 250rpm.
2. Recolher 1,5 mL da cultura para um microtubo e centrifugar 2 min a 8000g.
3. Remover completamente o sobrenadante e adicionar mais 1,5 mL da cultura. Voltar a
centrifugar 2 min a 8000g.
4. Remover completamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 µL de
solução A1 (solução comercial contendo lisozima).
5. Adicionar 250 µL de solução A2 (solução comercial contendo hidróxido de sódio e
detergente SDS) e misturar por inversão do microtubo.
6. Adicionar 300 µL de solução A3 (solução comercial de acetato de potássio) e misturar
por inversão do microtubo.
7. Centrifugar 10 min a 16000g.
 8. Recolher o sobrenadante do microtubo, com cuidado para não levar nenhum
sedimento e colocar na coluna contendo um tubo de recolha por baixo.
9. Centrifugar 1 min a 16000g e descartar o líquido do tubo de recolha.
10. Adicionar 500 µL de tampão AY (tampão de lavagem comercial) à coluna, centrifugar
1 min a 16000g e descartar o líquido do tubo de recolha.
11. Adicionar 600 µL de tampão A4 (tampão de lavagem comercial contendo etanol) à
coluna, centrifugar 1 min a 16000g e descartar o tubo de recolha.
12. Colocar um tubo de recolha novo e centrifugar 2 min à velocidade máxima para secar
a coluna.
13. Transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL adicionar 50 µL de água
desmineralizada aguardar alguns minutos à temperatura ambiente e centrifugar 1 min
a 16000g.
14. Remover a coluna e guardar o microtubo contendo a solução do plasmídeo.

TL2.B – Digestão de DNA plasmídico por ação de uma endonuclease de

restrição
Endonucleases de restrição do tipo II são enzimas que reconhecem sequências específicas
de bases no DNA e são capazes de hidrolisar as cadeias do mesmo. Uma vez que essa
hidrólise ocorre em ambas as cadeias, os sistemas de reparação celular não funcionam,
permitindo dessa forma a destruição de ácidos nucleicos invasores (e.g., vírus). Para além
da sua função protetora na célula, as enzimas de restrição têm também extrema
importância em investigação científica, nomeadamente em processos de clonagem de
genes, execução de mapas de restrição ou a determinação do tamanho de moléculas de
DNA. Neste trabalho utilizaremos a endonuclease HindIII para linearizar os plasmídeos
pUC19 e pLM73-2 e a endonuclease PstI que permitirá remover o fragmento do gene
BCAM2418 clonado no vetor pUC19, obtendo-se dois fragmentos de restrição um com
1911 pb e outro com 2686 pb.
 Procedimento experimental

1. Preparar três microtubos, um para o plamídeo pUC19 e dois com o plasmídeo

pLM73-2. Adicionar a cada microtubo os volumes indicados na tabela (seguir a
ordem indicada).
pUC19 + HindIII pLM73-2 + HindIII pLM73-2 + PstI
H2O L L L
Tampão L Tampão L Tampão L Tampão
enzima 10x HindIII HindIII PstI
Enzima de
L HindIII L HindIII L PstI
restrição
DNA L pUC19 L pLM73-2 L pLM73-2

2. Preparar mais dois microtubos com 5 µL de cada plasmídeo (pUC19 ou PLM73-2)

e 15 µL de água, que correspondem às amostras não digeridas.
3. Misturar cuidadosamente e incubar a 37oC durante 1h.

TL2.C – Visualização do DNA plasmídico por eletroforese em gel de agarose

Eletroforese é uma técnica onde moléculas com carga migram por aplicação de um campo
elétrico. A separação de ácidos nucleicos que se encontram carregados negativamente
(grupos fosfato) é efetuada geralmente em géis de agarose. A agarose forma uma matriz
porosa (cujo tamanho do poro pode ser controlado) e através do qual as moléculas de
ácidos nucleicos migram a uma velocidade principalmente dependente do tamanho (pb)
e conformação das moléculas. A velocidade de migração depende ainda da sua
composição nucleotídica, da concentração da matriz de agarose utilizada, do campo
elétrico aplicado ao sistema (V/cm) e ainda da composição do tampão utilizado na
eletroforese.

Para visualizar os ácidos nucleicos no gel, podemos usar um composto fluorescente que
se intercala nas suas cadeias e é fluorescente quando irradiado com radiação ultravioleta,
permitindo a sua deteção. Este composto pode ser adicionado ao gel aquando da sua
preparação ou imergindo o gel numa solução do composto antes de visualização.
 Procedimento experimental

1. Preparar um gel de agarose com concentração de 0,8% em tampão TAE (1x) (ver
composição em anexo): pesar 0,8 g de agarose e misturar com 100 mL de tampão TAE,
aquecer no micro-ondas até dissolver, mas sem ferver.
2. Enquanto a agarose arrefece preparar um molde com um pente de 8 dentes de modo
a formar 8 câmaras com a possibilidade de aplicação de 20 µL da solução de DNA em
cada um deles.
3. Quando a solução de agarose arrefecer para valores de temperatura próxima dos
50oC, adicionar 1 µL de Green Safe a 50 mL da solução de agarose e misturar. Este
composto permitirá a posterior visualização dos ácidos-nucleicos no gel. Deitar a
mistura líquida dentro do molde e deixar solidificar o gel durante ~15 min.
4. Remover cuidadosamente o pente e as borrachas do topo do molde do gel. Colocar o
gel (ainda sobre o molde) na tina horizontal de eletroforese e encher a unidade com
tampão TAE (1x) até que o nível do tampão cubra e ultrapasse em 1 mm a superfície
do gel.
5. A cada amostra de DNA plasmídico, adicionar 2 µL de loading buffer com elevada
densidade (40% sacarose; 0,25% azul de bromofenol; 0,25% xilenocianol). Aplicar em
cada uma das câmaras presentes no gel cada uma das amostras.
6. Como referência, aplicar 5 µL de uma amostra contendo uma mistura de fragmentos
de DNA com tamanho conhecido (entre 200 e 10000 pares de bases) ver NZYDNA
ladder III em anexo.
7. Fechar a tina e ligar os eléctrodos à fonte de alimentação, tendo atenção às cores e
não esquecendo que os ácidos nucleicos migram para o ânodo. Iniciar a eletroforese
por aplicação de um campo elétrico (100 V), durante 45 min.
8. Após separação eletroforética, retirar o molde com o gel do tampão usando luvas e
remover o líquido em excesso.
9. Visualizar o DNA pela fluorescência emitida pelo Green Safe quando irradiado com
radiação UV, utilizando um equipamento Gel Doc. Fotografar o gel.
BIBLIOGRAFIA

Birnboin, H.C., & Doly, J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombunant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1523.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd
edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
 ANEXOS
Tampão TAE (50x)
242 g TRIS base
57,1 mL ácido acético glacial
100 mL de solução de EDTA 0,5 M (pH 8.0)
H2O até 1 litro
Ajustar o pH a 8,0

Kit comercial
NZYMiniprep MB010
https://www.nzytech.com/products-services/molecular-biology/dnarna-
purification/plasmid-dna-purification/miniprep/mb010/

Mistura de fragmentos padrão de DNA

NZYDNA ladder III
https://www.nzytech.com/products-services/molecular-biology/ladders-markers/dna-
ladders/mb044/

GreenSafe Premium (Nztech)

https://www.nzytech.com/products-services/dna-loading-staining/mb13201/
Mapa de restrição do plasmídeo – vetor de clonagem pUC19