Bioquímica

Exame de Bioquímica Laboratorial https://doi.org/8059/114820

Preparação de soluções tampão de fosfatos a

diferentes phs e avaliação das suas capacidades
tampão
Madalena Nunes1,
1
Instituto Universitário Egas Moniz, Campus Universitário – Quinta da Granja, Monte de Caparica, 2825-
084 Caparica, Portugal

E-mail: madalena.nena2002@gmail.com

Resumo
A maior parte das reações químicas a nível celular ocorrem a temperatura e pH constantes. O pH da água pura no seu estado
líquido é muito sensível à adição de ácidos ou bases, logo são utilizadas soluções tampão para o estabilizar. As soluções tampão
são soluções constituídas por um ácido fraco e pela sua base conjugada e cujo pH irá depender não só do pKa do ácido como
também da concentração relativa de ácido e da sua base conjugada. Esta atividade experimental tem como objetivo a preparação
de soluções tampão de fosfatos a diferentes phs. Estas soluções são as mais comumente utilizadas no laboratório de bioquímica
para mimetizar condições fisiológicas. Adicionalmente pretende-se avaliar a capacidade tampão destas mesmas soluções, ou
seja, a sua capacidade para resistir à variação de ph após a adição de ácido (HCl) e base (NaOH) fortes, sendo que pelo menos
umas das soluções deverá apresentar o valor de pH igual ao de pKa. Como tal, preparar-se-ão 3 soluções (A, B e C) a ph de
6,2; 7,2 e 8,2 respetivamente com volumes finais de 40 ml. Para se medir o pH utilizou-se o potenciómetro verificando-se assim
a ocorrência ou não de variações do pH. Para preparar as soluções tampão recorreu-se à equação de Hendersen-Hasselbalch e
utilizaram-se as soluções de 𝑵𝒂𝑯𝟐 𝑃𝑂4 e 𝑁𝑎2 𝐻𝑃𝑂4 . Os resultados evidenciaram que quanto mais próximo o valor inicial de
ph de uma solução tampão está do pKa do par HPO42-/H2PO4- maior é a sua capacidade de resistência às variações de pH perante
a adição de um ácido e de uma base forte.

Palavras-Chave: solução tampão, pH, ácidos, bases, tampão de fosfatos, bioquímica, potenciómetro.

1. Introdução adicionar à solução. Como tal, uma solução contendo o ácido

As reações químicas, nas células, ocorrem a valores de
temperatura e pH constantes [1]. Porém, a água pura no seu
estado líquido é pouco resistente às mudanças de pH quando
na presença de ácidos ou bases [2]. Uma solução tampão é
uma solução aquosa capaz de resistir ás variações de pH
quando se adicionam ácidos ou bases [3]. Os tampões são
substâncias químicas que mantêm o valor de pH relativamente
estável, perante a adição de ácidos ou bases fortes ao meio
celular. Estes são formados pela combinação de ácidos fracos
com as suas bases conjugadas em uma solução de pH próximo
ao pKa do ácido. A equação de Hendersen-Hasselbalch (pH =
pKa + log ([A-] / [HA])), define a relação entre o pH e as
concentrações do ácido e da sua base conjugada. Esta pode ser
usada na determinação do pH de uma solução, conhecendo-se
a razão molar do par ácido/base conjugada que se encontra a
tamponar a solução e o pKa do ácido. Quando se pretende
preparar um tampão para um determinado valor de pH, apenas
é necessário conhecer o pKa de um determinado ácido para
determinar as quantidades de ácido e base conjugada a
e a sua base conjugada, tem a capacidade de resistir a
variações de pH, o que significa que atua como tampão.
Ao adicionar-se ácido (H3O+) à solução tampão, este será
neutralizado pela base conjugada (A-) em solução. Da mesma
forma, a adição de base (OH-) à solução tampão é neutralizada
pela reação com a forma ácida (HA):
H3O+ + A- → H2O OH- + HA → A- + H2O
Os sistemas tampão mais eficazes contêm concentrações
iguais da forma ácida e da sua base conjugada. Segundo a
equação de Hendersen-Hasselbalch, quando [HA]=[A-], o
valor de pH é igual ao valor de pKa. Desta forma, o valor de
pKa representa o valor de pH para o qual a capacidade tampão
é máxima. O valor de pH do meio pode assim, ter impacto nas
reações químicas e a difusão de moléculas pelas membranas
biológicas, havendo variadas aplicações laboratoriais,
biológicas, bioquímicas, químicas, farmacêuticas, médicas e
industriais das soluções tampão.

8059/114820 1
Preparação de uma Solução Tampão
Esta atividade experimental tem como objetivo a
preparação de soluções tampão de fosfatos a diferentes phs e
a avaliação da capacidade tampão destas mesmas soluções, ou
seja, a sua capacidade para resistir à variação de ph após a
adição de ácidos e bases fortes, sendo que pelo menos umas
das soluções deverá apresentar o valor de pH igual ao de pKa.
O valor de pKa da solução tampão deve estar na faixa do pH
ótimo para o sistema em estudo, isto é, a capacidade tampão
da solução é maior quanto mais próximo o valor de pH da
solução estiver do pKa do par ácido/base, uma vez que a
quantidade de ácido relativamente à sua base conjugada em
solução está aproximadamente em igualdade. Como tal,
preparar-se-ão 3 soluções (A, B e C) a ph de 6,2; 7,2 e 8,2
respetivamente com volumes finais de 40 ml. Para a medição
de pH utilizou-se o potenciómetro verificando-se assim a
ocorrência ou não de variações do pH. Para preparar as
soluções tampão recorreu-se à equação de Hendersen-
Hasselbalch e utilizou-se as soluções de 𝑁𝑎𝐻2 𝑃𝑂4 e
𝑁𝑎2 𝐻𝑃𝑂4 .
2. Procedimento experimental
Reagentes
Soluções-padrão de pH 4 e 7 para a calibração do
potenciómetro que foram fornecidas pela Merck, KGaA,
Darmstadt, Germany; 𝑁𝑎2 𝐻𝑃𝑂4 a 0,1M e 𝑁𝑎𝐻2 𝑃𝑂4 a 0,1M
ambos fornecidos pela empresa Sigma Aldrich (Company
3050, Spruce saint Louis, MO 63103 USA), HCl 0,1 M e
NaOH 0,1 M.
Materiais:
Foram utilizadas 2 buretas de 25 ml (erro de 0,03ml), 2 pipetas
graduadas de 20 ml (erro de 0,02 ml), 12 gobelets de 100 ml,
1 placa de agitação Agimatic-N, 1 magnete, 1 potenciómetro
de ph M21 da METRIA e 1 pompete.
Cálculos:
Para se prepararem as 3 soluções (A, B e C) a ph de 6,2; 7,2 e
8,2 respetivamente com volumes finais de 40 ml é necessário
inicialmente calcular-se a concentração final de ácido e da
base conjugada tendo em conta que concentração total de
fosfatos deve ser de 0,1M e o pka do ácido a utilizar é de 7,2.
[A−]
Sabendo que 𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log ([𝐻𝐴]) e que a concentração
total é igual à soma entre a concentração de ácido e
concentração de base (CT = [A-] + [HA]), pode-se resolver a
primeira equação em função da concentração de base.
Conclui-se assim que [A-] = [HA] * 10 pH-pKa. Substituindo a
segunda equação passa-se a ter que CT = [HA] * 10 pH-pKa +
[HA]. Resolvendo esta equação em função da concentração de
ácido chega-se à conclusão de que esta é igual a [HA] = CT /
1 + 10 pH-pKa. A concentração de base pode agora ser calculada
a partir da fórmula inicial que diz que a concentração total é
igual ao somatório da concentração do ácido e base conjugada.
Desta forma, [A-] = CT - [HA].
Utilizando estas fórmulas pode-se assim calcular a
concentração de ácido para cada uma das soluções, obtendo-
se os seguintes resultados:
2
Madalena Nunes
A: [HA] = CT / 1 + 10 pH-pKa = 0,1/1 + 10 6,2 – 7,2 = 0,09 mol/L
B: [HA] = CT / 1 + 10 pH-pKa = 0,1/1 + 10 7,2 – 7,2 = 0,05 mol/L
C: [HA] = CT / 1 + 10 pH-pKa = 0,1/1 + 10 8,2 – 7,2 = 0,01 mol/L
Sabendo-se as concentrações de ácido é possível calcular-se
as concentrações de base através da fórmula [A-] = CT - [HA].
Assim,
A: [A-] = CT - [HA] = 0,1 – 0,09 = 0,01 mol/L
B: [A-] = CT - [HA] = 0,1 – 0,05 = 0,05 mol/L
C: [A-] = CT - [HA] = 0,1 – 0,01 = 0,09 mol/L
Para calcular o volume a utilizar das soluções “stock” de ácido
ou base conjugada a 0,1M pode-se recorrer à equação que diz
que vi*c i= vf*cf, o que é equivalente a dizer que o volume da
solução inicial a utilizar (Vi) = Vf*Cf / Ci. Assim,
A: Vi = Vf*Cf/Ci = 40 * 0,09/0,1 = 36 ml de ácido
B: Vi = Vf*Cf/Ci = 40 * 0,05/0,1 = 20 ml de ácido
C: Vi = Vf*Cf/Ci = 40 * 0,01/0,1 = 4 ml de ácido
Para se calcular o volume de base conjugada de cada solução
retira-se ao volume final (40 ml) o volume de ácido calculado,
assim:
A: Vf-Vi = 40-36 = 4 ml de base conjugada
B: Vf-Vi = 40-20 = 20 ml de base conjugada
A: Vf-Vi = 40-4 = 36 ml de base conjugada
Tabela 1 - Resultados dos cálculos para a resolução da atividade
laboratorial
Solução pH Vf [HA] [A-] V V
[HA] [A-]
A 6,2 40 0,09 0,01 36 4
B 7,2 40 0,05 0,05 20 20
C 8,2 40 0,01 0,09 4 36
Protocolo:
Após a realização de todos os cálculos organiza-se todo o
material e reagentes devidamente identificados necessários
para a elaboração da atividade laboratorial. Faz-se a lavagem
das buretas com água destilada e de seguida com HCl e NaOH
respetivamente. Na hotte preparam-se as 6 soluções (duas de
cada uma) A, B e C uma vez que se vão realizar 2 titulações
diferentes, de acordo com os volumes calculados
anteriormente e que estão presentes na tabela anterior,
pipetando-se com pipetas graduadas de 20 ml o respetivo
volume de 𝑁𝑎𝐻2 𝑃𝑂4 e 𝑁𝑎2 𝐻𝑃𝑂4 para cada gobelet. Calibra-
se o potenciómetro de pH com as soluções padrão de pH 4 e
7. De seguida, coloca-se a solução A em cima da placa de
agitação com o magnete e o elétrodo de pH no seu interior e
inicia-se a titulação com HCL a 0,1M. Mede-se o valor de pH
inicial da solução A. Adiciona-se 1 gota de HCl a 0,1M,
homogeneíza-se a solução e determina-se o valor de pH. De
seguida adiciona-se HCl a 0,1M até o volume total adicionado
ser de 1ml, homogeneíza-se e determina-se novamente o valor
de ph. Adiciona-se HCL a 0,1M até o volume total adicionado
ser de 5ml, homogeneíza-se e determina-se mais uma vez o
valor de pH. Finalizando-se a solução A repetem-se os
mesmos passos para as soluções B e C tendo-se o cuidado de
Preparação de uma Solução Tampão Madalena Nunes

lavar com água destilada o elétrodo de pH e o magnete antes caso verifica-se um desvio entre os valores experimentais e os
de mudar de solução. No fim de realizada a titulação com HCl valores teóricos.
(ácido forte) realiza-se a titulação com NaOH (base forte). O
procedimento é todo igual. Titulação das soluções tampão a 0,1 M:

Análise de dados: Nas tabelas seguintes (tabela 4 e 5) encontram-se os valores

Os resultados foram analisados através do software Excel da de pH das soluções tampão antes e após a adição dos volumes
Microsoft. de HCl a 0,1 M e de NaOH a 0,1 M.
Tabela 4 - Variação do pH das soluções tampão com a adição de
HCl
3. Resultados
Solução C pH pH 0,1 1 5
Valores de pH das soluções-tampão a 0,1 M preparadas com (Fosfatos) Calculado inicial ml ml ml
diferentes relações entre o ácido e a base conjugada:
A 0,1 6,2 5,82 5,80 5,70 3,67
Na tabela 2 encontram-se os valores de pH pretendidos para
as soluções, obtidos através da equação Henderson- B 0,1 7,2 6,81 6,80 6,77 6,61
Hasselbach e os valores de pH determinados C 0,1 8,2 7,82 7,81 7,67 7,23
experimentalmente com recurso ao potenciómetro.
  A variação do valor de pH das soluções tampão após a adição
Tabela 2 - Valores de pH pretendidos, utilizando a equação de HCl foi diferente nas três soluções, tendo sido maior na
HendersonHasselbach e os valores de pH determinados solução tampão com o valor de pH inicial de 5,82 e menor na
experimentalmente solução tampão com valor de pH inicial de 6,81.

Tabela 5 - Variação do pH das soluções tampão com a adição de

PH pretendido PH experimental Diferença
NaOH

Solução C pH pH 0,1 1 5
6,2 5,82 0,38
(Fosfatos) Calculado inicial ml ml ml

7,2 6,81 0,39 A 0,1 6,2 5,84 5,89 5,92 6,21

B 0,1 7,2 6,83 6,84 6,86 7,00
8,2 7,82 0,38
C 0,1 8,2 7,86 7,87 7,96 9,45
Os valores de pH iniciais antes de se adicionar HCl variam
entre 0,38 e 0,39 unidades de pH e apresentam um erro médio
A variação do valor de pH das soluções tampão após a adição
de 0,38. Numa situação ideal o erro deveria ser zero, mas neste
de NaOH foi diferente nas três soluções, tendo sido maior na
caso verifica-se um desvio entre os valores experimentais e os
solução tampão com o valor de pH inicial de 7,86 e menor na
valores teóricos.
solução tampão com valor de pH inicial de 6,83.

10
Tabela 3-Valores de pH pretendidos e valores de pH determinados
experimentalmente para a adição de NaOH
8 y = -0,1171x + 7,8112

PH pretendido PH experimental Diferença

6
y = -0,0395x + 6,8077
6,2 5,84 0,36
4
y = -0,4417x + 5,9211
7,2 6,83 0,37
2

8,2 7,86 0,34

0
0 1 2 3 4 5 6
Os valores de pH iniciais antes de se adicionar NaOH variam Solução A Solução B
entre 0,34 e 0,37 unidades de pH e apresentam um erro médio Solução C Linear (Solução A)
Linear (Solução B) Linear (Solução C)
de 0,36. Numa situação ideal o erro deveria ser zero, mas neste
Figura 1 – Gráfico da variação do valor de pH da titulação das
soluções tampão A, B e C com HCl a 0,1 M

3
Preparação de uma Solução Tampão Madalena Nunes

10 [2] Ben-Chioma, AE, Jack, AS and Philipokeere, GK (2015)

International Journal of Applied Chemistry Vol. 1 No.3
8 y = 0,3267x + 7,7868
y = 0,0336x + 6,8313 [3] Chandra Mohan (2006) Buffers. A Guide for the
6 Preparation and Use of Buffers in Biological Systems; EMD,
y = 0,0702x + 5,858 San Diego, California, USA.
4

0
0 1 2 3 4 5 6

Solução A Solução B
Solução C Linear (Solução A)
Linear (Solução B) Linear (Solução C)

Figura 2 – Gráfico da variação do valor de pH da titulação das

soluções tampão A, B e C com NaOH a 0,1 M

4. Discussão
Esta atividade laboratorial teve como objetivo a preparação de
soluções tampão de fosfatos a diferentes phs e a avaliação da
capacidade tampão destas mesmas soluções, ou seja, a sua
capacidade para resistir à variação de ph após a adição de
ácidos e bases fortes. Como a capacidade de um solução
tampão depende da proximidade entre o valor de pH da
solução e o valor de pKa do par ácido/base, foram realizadas
três soluções tampão A, B e C com três valores teóricos
iniciais de pH 6,2; 7,2 e 8,2 respetivamente sendo que uma
delas apresentava o valor de ph inicial igual ao de pKa. Foi
determinado o valor experimental de pH obtido para cada uma
das três soluções e concluiu-se que apesar da existência de
diferenças entre os valores teóricos e experimentais, estas
sugerem uma preparação talvez imprecisa das soluções stock
2-
de HPO /H PO -, ou também um erro na calibração do
4 2 4
potenciómetro que poderá́ ter influenciado os resultados
finais. A acrescentar, existem sempre os erros do material
utilizado e dos arredondamentos feitos nos cálculos.

5. Conclusões
Com esta atividade laboratorial conclui-se que quanto mais
próximo está o valor de pH de uma solução tampão do pKa do
par ácido/base que a compõe, maior é a sua capacidade para
resistir a variações de pH perante a adição de um ácido ou de
uma base forte.

Referências
[1] Quintas, A (2008) Bioquímica: Organização Molecular da
Vida 2008; 1ª Edição, LIDEL, Lisboa, Portugal.