Tampões

Tampões são sistemas aquosos que resistem às variações do pH quando quantidades

relativamente pequenas de ácido (H+) ou base (OH-) são adicionadas à solução.

♦Os tampões são misturas de ácidos fracos de Bronsted (doadores de H +) e suas bases
conjugadas (aceptoras de H+) os quais podem captar ou liberar H+ conforme o meio se
torne ácido ou básico.

♦A capacidade tamponante máxima de um sistema tampão ocorre no valor de pH,

equivalente ao pKa, onde a concentração do componente ácido se iguala a de sua
base conjugada. Nesta situação, o pH da solução sofrerá uma alteração mínima
quando se adicionar ao meio uma pequena quantidade de ácido ou base de Arrhenius,
pois o sistema tampão reduz o número de íons hidrogênio ou hidroxilas livres. A
eficiência de um sistema tampão está relacionada também às concentrações do ácido
e sua base conjugada.

CH3 – COOH CH3 – COO- + H+

ácido acético acetato

doador de H+ aceptor de H+

Explique o que ocorrerá se a ao sistema tampão ácido acético/acetato, com pH em

torno de 4,76 correspondente ao seu pka quando for adicionado um pequeno volume
HCl 0,1 N ou NaOH 0,1 N ao mesmo.

P
A
 Ácidos e Bases
segundo Arrhenius

Ácido: substância que, dissolvida em água, dissocia-se liberando um ou mais íons H+

HCl H+ + Cl-

H2SO4 2H+ + SO42−

Base: substância que, dissolvida em água, dissocia-se liberando um ou mais ânions OH−

NaOH Na+ + OH−

Ca (OH)2 Ca+ + 2 OH−

KOH K+ + OH−

Mg (OH)2 Mg++ + 2 OH−

Ácidos e Bases
segundo Bronsted - Lowry

Ácidos: espécies que doam H+

CH3COOH CH3COO− + H+
Ácido acético acetato

Bases: espécies que recebem H+

CH3COO− + H+.. CH3COOH

Acetato ácido acético

P
A
De acordo com a sua força ácida (pKa) ou sua tendência a doar prótons, os ácidos
são classificados em:

Ácido Forte: dissocia-se completamente em meio aquoso liberando todos os seus H+.

HCl H+ + Cl−

HNO3 H+ + NO3−

H2SO4 2H+ + SO42−

Ácido Fraco: dissocia-se parcialmente em meio aquoso e no valor de pH

correspondente ao seu pKa 50% das moléculas se dissociam liberando H+ e 50% das
moléculas permanecem na forma não-dissociada (protonada).

CH3COOH CH3COO− + H+
pka (pH= 4,76)

Ác. acético (50%) acetato (50%)

Valores de pka dos pares ácido-base conjugados

Ácido láctico/lactato pka=3,86
Ácido acético/acetato pka= 4,76
H2PO4 / H2PO42 pka=6,86
NH4+ / NH3 pka=9,25

P
A
Demonstração do efeito tampão

MATERIAL
- Becker 50 mL: 05
- Becker 15 mL: 01
- Proveta de 20 mL: 01
- Proveta de 25 mL: 01
- Balão volumétrico de 100 mL: 01
- Bastão de vidro: 01
- Estante de madeira com 1 tubo de ensaio
- pHmetro

REAGENTES
- NaOH 10%
- NaOH 0,4%
- HCl 0,1 M
- HCl 2,7 M
- Água destilada
- Tris 0,2M
- HCl 0,2 M
- Indicador universal de pH

LEITURA DO pH
Existem diversas técnicas para se aferir o pH, fitas de papel, indicadores naturais e aparelhos, o
peagâmetro.
Em nossas práticas utilizaremos a fita de papel ou de material similar.

Tris HCL (Tris: tris(hidroximetil)aminometano)

Tris – forma desprotonada Tris – forma protonada

P
A
Demonstração do efeito tampão

1. Preparo da solução tampão TRIS – HCl (pH≈ 8,3)

Colocar em um balão volumétrico de 100 mL, 25 mL (medir na proveta de 25 mL) de

Tris – Hidroximetilaminometano 0,2 M e 11 mL (medir na proveta de 20 mL) de HCl
0,2 M. Completar o volume com água destilada. Homogeneizar bem, transferir 20
mL para um Becker de 25 mL e verificar o pH.
pH do tampão Tris-HCL = ____________

2. Observar o comportamento do tampão de acordo com o seguinte

procedimento:

a) Transferir para um Becker de 25 mL, 20 mL de tampão Tris-HCl + 0,2 mL de

NaOH 0,4% Misturar bem e verificar o pH pH = _________

b) Transferir para um Becker de 25 mL, 20 mL de tampão Tris-HCl + 0,2 mL de

NaOH 10%. Misturar bem e verificar o pH. PH = _________

c) Transferir para um Becker de 25 mL, 20 mL de tampão Tris-HCl + 0,2 mL de HCl

0,1 M. Misturar bem e verificar o pH. pH = _________

d) Transferir para um Becker de 25 mL, 20 mL de tampão Tris-HCl + 0,2 mL de HCl

2,7 M. Misturar bem e verificar o pH. pH = _________

e) Transferir para um Becker de 25 mL, 20 mL de tampão Tris-HCl + 0,2 mL de

água. Misturar bem e verificar o pH. PH = _________

P
A
 CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

OBJETIVOS:
 Fazer reações que evidenciem a presença de proteínas, peptídios ou aminoácidos em
uma amostra.
 Observar os resultados de reações de caracterização de alguns aminoácidos.

As proteínas reagem com uma variedade de reagentes formando produtos coloridos, o que
se deve às suas ligações peptídicas e à presença de diferentes aminoácidos. Algumas
reações de coloração são específicas para aminoácidos encontrados na composição das
proteínas como reação xantoproteica (aminoácidos aromáticos – Phe, Tyr, Trp), reação
de Millon (Tyr), reação de Sakaguchi (Arg), reação do enxofre (Cys). As reações gerais
de caracterização de proteínas, aminoácidos e peptídios incluem a reação da ninidrina e do
biureto, que permitem caracterizar e grupos comuns a estes compostos incluindo o grupo α-
amino e as ligações peptídicas.

1. Reação da Ninhidrina

Colocar em um tubo de ensaio 3 mL de solução

protéica e 1mL de ninhidrina 0,1%. Agitar e
aquecer prolongadamente até o aparecimento de
uma coloração azul-arroxeada.

A ninhidrina reage com grupo amino livre

localizado nos aminoácidos, peptídeos ou
proteínas dando origem ao produto chamado
Púrpura de Ruhemann de cor azul-arroxeada.

2. Reação de Biureto

Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de solução protéica, 5 gotas de NaOH 10% e 5

gotas de CuSO4 1%. Agitar e observar o aparecimento de uma coloração lilás ou violeta
cuja intensidade será proporcional à concentração de proteínas ou peptídios presentes na
amostra.

O produto lilás é resultante do complexo formado entre as ligações peptídicas das

proteínas ou dos peptídios que possuem 3 ou mais aminoácidos, com o cobre do reativo
de biureto. Aminoácidos e dipeptídios não originam complexos coloridos com o reativo
de biureto porque não possuem ligações peptídicas. Esta reação é útil para
demonstração e quantificação de proteínas e peptídios em uma amostra.

1
Biureto é o nome dado à estrutura originada a partir da decomposição da uréia, quando esta
é submetida ao aquecimento. Em meio alcalino que contenha sulfato de cobre (CuSO4), o
biureto reage com o íon Cu2+ originando um produto roxo.

As ligações amídicas do biureto são

semelhantes às ligações peptídicas Interação entre as ligações peptídicas
dos peptídeos e das proteínas. e o cobre do reativo de biureto.

3. Reação de Pauly

Colocar em um tubo de ensaio 5 mL de solução protéica, 1 mL de carbonato de

sódio 10% e 1 mL do diazo-reagente de Ehrlich. Agitar. O aparecimento de cor
alaranjada indica a presença dos aminoácidos tirosina e histidina na amostra. A
presença de histidina é evidenciada pelo aparecimento de cor amarela e a presença
de tirosina pelo aparecimento de cor vermelha.

4. Reação xantoproteica

Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de solução protéica e 10 gotas de HNO3

concentrado. Aquecer até o aparecimento de uma coloração amarelo-clara. Juntar
cerca de 0,8 mL de amoníaco concentrado ou hidróxido de amônio. Agitar e
observar o aparecimento de cor alaranjada resultante da formação de nitrocompostos
derivados dos aminoácidos aromáticos presentes na amostra.

2
5. Reação de Sakaguchi

Misturar em um tubo de ensaio 2 mL de solução protéica, 4 gotas de NaOH 10%, 4

gotas de solução alcoólica de α-naftol 5% e 2 mL de hipoclorito de sódio. O
aparecimento de cor vermelha intensa indica a presença de arginina na amostra.

6. Reação de Millon

Aquecer em um tubo de ensaio 2 mL de solução protéica juntamente com 8 gotas do

reativo de Millon. O aparecimento de um precipitado avermelhado, após
aquecimento prolongado, indica a presença de tirosina na amostra. Esta reação é
positiva apenas para as proteínas que possuem tirosina – o único aminoácido que
por possuir hidroxila fenólica reage com sais de mercúrio transformando-se em
compostos que sofrem nitração transformando-se em produtos de cor avermelhada.

7. Reação de enxofre

Aquecer durante 2 minutos uma mistura de 2 mL de solução protéica e 1 mL de

NaOH 10%. Juntar, após o aquecimento, 4 gotas de acetato de chumbo 10%. O
aparecimento de uma cor escura deve-se à formação de sulfeto de chumbo a partir
de aminoácidos sulfurados, principalmente cisteína.

8. Solubilização de proteína (Salting in)

Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de

solução protéica e adicionar lentamente
2 mL de NaCl 1M. Agite o tubo
suavemente. Observar que a solução fica
mais clara devido a solubilização da
proteína.

9. Precipitação de proteínas (Salting out)

Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de solução protéica e adicionar lentamente 2

mL de Sulfato de Amônio saturado - (NH4)2SO4 70%. Agite o tubo suavemente.
Observar a formação de precipitado proteico.

3
 Material:
 Pipetas:
1 mL: 8
2 mL: 9
5 mL: 6
 1 Becker de 50 mL
 Bico de Bunsen
 Estante de madeira com 13 tubos de ensaio

Reagentes:

 Solução protéica
 HNO3 concentrado
 Amoníaco concentrado ou hidróxido de amônio
 Reativo de Millon
 NaOH 10%
 Acetato de chumbo 10%
 Sulfato de cobre 1%
 Ninhidrina 0,1%
 Carbonato de sódio 10%
 Diazo-reagente de Erlich
 Solução alcoólica de α-naftol 5%
 Hipoclorito de sódio
 NaCl 1M
 (NH4)2SO4 70%
 Água destilada

4
 PROPRIEDADES DAS ENZIMAS – INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

EXPERIMENTO 1. INIBICAÇÃO NÃO-COMPETITIVA

1o Prepare os tubos de acordo com a tabela abaixo.

Reagentes Tubo 1 Tubo 2

Água destilada 2 mL 2 mL
Urease 2 gotas 2 gotas
Ureia 1% em tampão fosfato 1 mM pH 7 3 mL 3 mL
HgCl2 0,01% 2 gotas -- ( 0 )
Vermelho de fenol 2 gotas 2 gotas

2o Incubar todos os tubos em banho-maria 37o C por 10 minutos

3o Devolver os tubos para a estante e identificar e avaliar a cor.

Tubo Cor observada Conclusão

Tubo 1

Tubo 2

Fonte: Marzzoco, Torres, 2007.

Para pensar:

– Qual princípio da inibição enzimática não competitiva?

– Um inibidor enzimático competitivo altera KM e Vmax? Explique o porquê.

1
Saiba mais em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3537586/

2
 EXPERIMENTO 2. INIBICAÇÃO COMPETITIVA

1o Prepare os tubos de acordo com a tabela abaixo.

Reagentes Tubo 1 Tubo 2

Tiouréia 1 % em tampão fosfato 1 mM pH 7 3 mL --
Urease 2 gotas 2 gotas
Vermelho de fenol 2 gotas 2 gotas
Água destilada -- 3 mL

2o Incubar todos os tubos em banho-maria 37oC por 10 minutos;

3o Inserir 3 mL de Uréia 1% em tampão fosfato 1 mM pH 7 nos Tubos 1 e 2;

4o Incubar todos os tubos em banho-maria 37oC por mais 10 minutos;

5o Devolver os tubos para a estante e identificar e avaliar a cor.

Tubo Cor observada Conclusão

Tubo 1

Tubo 2

Fonte: Marzzoco, Torres, 2007.

Para pensar:
– Qual princípio da inibição enzimática competitiva?
– Um inibidor enzimático não competitivo altera KM e Vmax? Explique o porquê.

3
 CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS

1. Reação de Molish (caracterização de açúcares em geral)

1. Colocar em tubo de ensaio 2 mL de solução de sacarose 1% e 5 gotas de

solução alcoólica de alfa-naftol 5%. Agitar.
2. Juntar lentamente, pelas paredes do tubo de ensaio INCLINADO, 2 mL de
H2SO4 concentrado, SEM AGITAR.
3. O aparecimento de anel violeta na superfície de separação entre os dois
líquidos, evidencia a presença de açúcares na amostra analisada.

O teste de Molish é utilizado para verificar a presença de açúcares numa solução,

incluindo polissacarídios, oligossacarídeos e monossacarídios. O ácido sulfúrico
desidrata as pentoses em furfural e as hexoses em hidroximetilfurfural. O furfural e o
hidroximetilfurfural combinam-se com fenóis (alfa-naftol, timol ou resorcinol)
originando compostos coloridos, como os responsáveis pela formação do anel violeta
ou roxo.

Monossacarídio
Hexose H2SO4

Monossacarídio
Pentose H2SO4 Furfural

2. Reação de coloração com o iodo (caracterização de polissacarídios)

1. Colocar em um tubo de ensaio 3 mL da solução de amido 1% e 2 gotas de
lugol. Agitar e observar a coloração azul-escuro (turvo)
2. Colocar em um tubo de ensaio 3 mL da solução de sacarose 1% e 2 gotas de
lugol. Agitar e observar a coloração amarela.

O teste de iodo serve para diferenciar os polissacarídeos, como o amido, de

oligossacarídeos e monossacarídeos. Devido ao tamanho da cadeia, os
monossacarídios e os oligossacarídeos não reagem com o iodo, enquanto os
polissacarídios se complexam com o iodo originando produtos coloridos. O amido
origina um complexo azul e o glicogênio marrom-avermelhado.

1
3. Reação de Benedict (diferenciação entre açúcares redutores e não-redutores)
1. Colocar em um tubo de ensaio 2 mL do reativo de Benedict e 0,5 mL de
glicose 1%. Aquecer em chama direta até a mudança de cor da solução que
torna-se avermelhada devido ao caráter redutor da glicose.
2. Colocar em um tubo de ensaio 2 mL do reativo de Benedict e 0,5 mL de
sacarose 1%. Aquecer em chama direta e observar a manutenção da coloração
azul característica do reagente, pois, a sacarose não apresenta caráter redutor.

Todos os monossacarídios e a maioria dos dissacarídeos reduzem o íon cúprico

(azul) derivado do Reativo de Benedict em óxido cuproso vermelho. Os
carboidratos que apresentam este comportamento são considerados açúcares
redutores. Os polissacarídios e a sacarose são considerados não-redutores pois não
apresentam carbono livre que possa sofrer oxidação e provocar a redução do íon
cúprico.
Glicose Ácido glicônico

4. Reação de hidrólise da sacarose e reação de Benedict com os produtos da hidrólise.

1. Colocar em um tubo de ensaio 5mL de solução de sacarose 1%. Juntar 0,5
mL de HCl concentrado e aquecer durante 2 minutos em chama direta, para que
ocorra a reação de hidrólise da sacarose.
2. Transferir 1 mL do açúcar hidrolisado para um outro tubo de ensaio. Juntar 2
mL do reativo de Benedict, aquecer até que a solução torna-se avermelhada,
confirmando que ocorreu a hidrólise ácida da sacarose.

Oligo e polissacarídios são hidrolisados em suas unidades monossacarídicas pelo

aquecimento com ácido forte. Assim, a sacarose que é um açúcar não redutor, sofre
hidrólise originando os monossacarídios glicose e frutose, os quais provocam a
redução do hidróxido cúprico azul em óxido cuproso vermelho.

2
5 - Reação de TOLLENS (diferenciação entre açúcares redutores e não-redutores)

1. Colocar em tubo de ensaio 2 mL do reativo de Tollens (ou nitrato de prata

amoniacal) e 1mL de solução de glicose 5%.
2. Aquecer SEM AGITAR e sem deixar entrar em ebulição, observando que
os açúcares redutores reduzem o complexo de prata amoniacal a prata metálica
que adere às paredes do tubo de ensaio originando o espelho de prata.

Glicose Ácido glicônico

6. Reação de SELIWANOFF (diferenciação entre aldoses e cetoses)

1. Colocar 4mL do reativo de Selivanoff em dois tubos de ensaio.
2. Adicionar 0,5mL de frutose 5% no primeiro tubo.
3. Adicionar 0,5mL de glicose 5% no segundo tubo.
4. Levar os 2 tubos para aquecer em banho-maria fervente durante 5
minutos, observar o aparecimento de uma coloração avermelhada no tubo que
contem solução de frutose., e uma coloração amarelada no tubo que contem
solução de glicose.

O teste de Seliwanoff permite diferenciar monossacarídios, oligo e polissacarídios que

cetoses em sua estrutura. Sob aquecimento na presença de HCl os oligo e
polissacarídios são hidrolisados em monossacarídios, sendo as cetoses rapidamente
desidratadas em derivados do furfural que reagem com resorcinol originando um
complexo avermelhada.

3
7. Reação de BARFOED (diferenciação entre mossacarídios e oligossacarídios)
1. Colocar 2,5 mL do reativo de Barfoed em 2 tubos de ensaio.
2. Adicionar 0,5 mL de glicose 5% no primeiro tubo e 0,5 mL de lactose 5% no
segundo tubo. Agitar e levar os dois tubos ao banho-maria fervente.
3. Observar que o aparecimento de precipitado vermelho tijolo no tubo 1 contendo
glicose ocorre mais rapidamente que no tubo 2 que contem lactose.

A reação baseia-se na redução do íon cúprico pelos açúcares com carbono anomérico
livre, sendo que os monossacarídios reagem mais rapidamente que os
oligossacarídeos.

4
 (MARCHA ANALÍTICA) AMOSTRA

Reação de Molish

Negativa Positiva

Reação com Lugol

Positiva Negativa

Hidrólise ácida Benedict

Benedict
Negativa Positiva

Selivanoff
Hidrólise ácida Barfoed

Benedict Selivanoff

Selivanoff

5
 PROPRIEDADES DAS ENZIMAS

A enzima utilizada na aula de hoje será a amilase salivar, para fazer a coleta é necessário
lavar bem a boca e coletar cerca de 5mL de saliva no becker. Depois fazer a diluição da
saliva (1:1), colocando em um becker 3 mL de saliva e 3 mL de água destilada. Agitar com
bastão de vidro.

EXPERIMENTO 1. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Teste a atividade da amilase em diferentes condições de temperatura, para tanto:

Tubos 1, 2, 3 e 4 3 mL de amido 1% por tubo

2o. Insira um tubo de ensaio em cada condição e mantenha por 10 minutos;

i. Ambiente natural (na própria estante)

ii. Banho de gelo
iii. Banho-Maria 37oC
iv. banho-Maria fervente

3o. Após 5 minutos nas diferentes condições, adicione 0,4 ml de saliva diluída (1:1) e agite.

4o. Retorne os tubos as condições de temperatura de cada um por mais 5 minutos;

5o. Insira 2 gotas de Lugol em cada tubo e avalie os resultados.

Tubo Condições Resultado visual na reação com Lugol

1 Ambiente natural
2 Banho de gelo
3 Banho Maria – 37 ºC
4 Banho Maria – Fervente

 Houve diferença nos resultados? Explique o que ocorreu e desenhe um esboço do

gráfico da atividade em função da temperatura.
 Como a temperatura interfere na atividade enzimática?
 EXPERIMENTO 2. INFLUÊNCIA DO PH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Teste a atividade da amilase em diferentes valores de pH, para tanto:

1o. Prepare os tubos de acordo com a indicação abaixo:

Adicionar primeiro os ácidos e bases nos tubos 2 e 3 (ver tabela abaixo);
Adicionar 3 mL de amido 1% em cada tubo
Adicionar 0,4 mL de saliva diluída (1:1) em cada tubo
Agitar bem;

2o. Insira todos os tubos no banho-Maria 37o C por 5 minutos;

3o. Após 5 minutos, insira 2 gotas de Lugol em cada tubo e avalie os resultados.

Tubo Reagentes Resultado visual

com Lugol
1 --- 3 mL de amido 1% 0,4 mL de amilase
2 3 gotas de NaOH 1 M 3 mL de amido 1% 0,4 mL de amilase
3 3 gotas de Ácido acético 1 M 3 mL de amido 1% 0,4 mL de amilase

 Houve diferença nos resultados? Explique o que ocorreu e desenhe um esboço do gráfico
da atividade em função do pH.
 Como o pH interfere na atividade enzimática?
 PROPRIEDADES DAS ENZIMAS

As enzimas são importantes moléculas, constituídas de cadeias polipeptídicas em sua

maioria, as quais apresentam alta especificidade, relacionadas com a catálise de reações
biológicas.
Diversos fatores interferem na atividade enzima, entre eles o pH, a temperatura, a
concentração de substrato, além da presença de inibidores.

Experimento 1. Especificidade enzimática

Nesse experimento testaremos diferentes substratos (amido e sacarose) e enzima

(sacarase). Para tanto, numere 2 tubos e adicione os reagentes conforme a tabela:
Tubo Reagentes Resultado após 10 minutos
1 1 mL de sacarase + 1 mL de sacarose 1%
2 1 mL de sacarase + 1 mL de amido 1%

Agitar os tubos e levá-los ao banho maria (37º C) por 10 minutos.

Após 10 minutos de incubação, adicionar a cada um dos tubos 1 mL do reativo de
Benedict. Aquecê-los até ebulição. Observar e interpretar o resultado.
 Em que consiste a reação de Benedict e o que ela indica no experimento?
 O que é sitio ativo?
 Como um substrato se liga à uma enzima?
 Uma enzima poderá ter mais de um ligante?
 O que são: amido e sacarose.

Vidraria: 4 tubos de ensaio, 5 pipetas de 1 mL, 1 béquer 30 mL.

Equipamentos: Banho-maria, bico de bunsen, estante para tubos.
Reagente: Sacarose 1%, Amido 1%, Sacarase, reativo de Benedict.

Figura: Reação catalizada pela sacarase ou invertase.

Experimento 2. Influência da concentração do substrato

Colocar em 3 tubos de ensaio enumerados:

Tubo Reagentes Resultado após 5 minutos

Sacarose Água Sacarase
1 0,1 mL 0,9 mL 1 mL
2 0,5 mL 0,5 mL 1 mL
3 1,0 mL - 1 mL
Agitar os tubos e levá-los ao banho maria (37º C) por 5 minutos.

Após 5 minutos de incubação, adicionar a cada um dos tubos 1 mL do reativo de Benedict.

Aquecê-los juntos até a viragem da cor. Observar e interpretar o resultado.
 Houve diferença nos resultados? Explique o que ocorreu e desenhe um esboço do gráfico
da velocidade em função da concentração de substrato.
 Como a concentração do subtrato interfere na atividade enzimática?

Vidraria: 3 tubos de ensaio, 3 pipetas de 1 mL, 1 pipeta de 5 mL, béquer 30 mL, conta-gotas (ou pipeta 1mL).
Equipamentos: Banho-maria, bico de bunsen, tripé, manta de amianto, estante para tubos.
Reagente: Sacarose 1%, sacarase, água destilada, reativo de Benedict.

Figura c: Esquema ilustrando efeito da concentração do subtrato na velocidade da reação.

Fonte: Marzzoco, Torres, 2007

Reflexões sobre a aula prática:

 O que KM representa?
 Qual a consequência de um KM menor para a afinidade da enzima pelo seu substrato?
 Qual a consequência de um K M maior para a afinidade da enzima pelo seu substrato?
 A partir dos experimentos da aula prática, procure estabelecer conexões com os processos
biológicos envolvendo enzimas.
 Como, naturalmente, esses fatores que interferem na atividade enzimática podem alterar
nos organismos.
 PROPRIEDADES DAS ENZIMAS

A enzima utilizada na aula de hoje será a amilase salivar, para fazer a coleta é necessário
lavar bem a boca e coletar cerca de 5mL de saliva no becker. Depois fazer a diluição da
saliva (1:1), colocando em um becker 3 mL de saliva e 3 mL de água destilada. Agitar com
bastão de vidro.

EXPERIMENTO 1. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Teste a atividade da amilase em diferentes condições de temperatura, para tanto:

Tubos 1, 2, 3 e 4 3 mL de amido 1% por tubo

2o. Insira um tubo de ensaio em cada condição e mantenha por 10 minutos;

i. Ambiente natural (na própria estante)

ii. Banho de gelo
iii. Banho-Maria 37oC
iv. banho-Maria fervente

3o. Após 5 minutos nas diferentes condições, adicione 0,4 ml de saliva diluída (1:1) e agite.

4o. Retorne os tubos as condições de temperatura de cada um por mais 5 minutos;

5o. Insira 2 gotas de Lugol em cada tubo e avalie os resultados.

Tubo Condições Resultado visual na reação com Lugol

1 Ambiente natural
2 Banho de gelo
3 Banho Maria – 37 ºC
4 Banho Maria – Fervente

 Houve diferença nos resultados? Explique o que ocorreu e desenhe um esboço do

gráfico da atividade em função da temperatura.
 Como a temperatura interfere na atividade enzimática?
 EXPERIMENTO 2. INFLUÊNCIA DO PH NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Teste a atividade da amilase em diferentes valores de pH, para tanto:

1o. Prepare os tubos de acordo com a indicação abaixo:

Adicionar primeiro os ácidos e bases nos tubos 2 e 3 (ver tabela abaixo);
Adicionar 3 mL de amido 1% em cada tubo
Adicionar 0,4 mL de saliva diluída (1:1) em cada tubo
Agitar bem;

2o. Insira todos os tubos no banho-Maria 37o C por 5 minutos;

3o. Após 5 minutos, insira 2 gotas de Lugol em cada tubo e avalie os resultados.

Tubo Reagentes Resultado visual

com Lugol
1 --- 3 mL de amido 1% 0,4 mL de amilase
2 3 gotas de NaOH 1 M 3 mL de amido 1% 0,4 mL de amilase
3 3 gotas de Ácido acético 1 M 3 mL de amido 1% 0,4 mL de amilase

 Houve diferença nos resultados? Explique o que ocorreu e desenhe um esboço do gráfico
da atividade em função do pH.
 Como o pH interfere na atividade enzimática?
 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES

a) Colocar em dois Erlenmeyer de 125 ml, 10 ml de Reativo de Benedict.

b) Montar uma bureta e zerar com solução padrão de lactose 1%.

c) Testar reativo de Benedict, aquecendo-o até ebulição para observar se ocorre a alteração da cor (use
um tripé com tela de amianto para o aquecimento).

d) A seguir titular o Reativo de Benedict com solução de lactose 1% contida na bureta. Após a adição
de lactose, a solução deve ser aquecida até ebulição, para que ocorra a oxidação do açúcar e a redução
do Benedict, antes que a nova porção seja adicionada.

e) Observar a mudança de cor e o aparecimento de precipitado vermelho tijolo, resultante do Reativo de

Benedict.

f) Quando chegar próximo da viragem final, diminuir a quantidade de lactose adicionada e observar com
atenção o desaparecimento por completo da coloração azul do reativo de Benedict.

g) Anotar a quantidade de solução de lactose 1% (padrão) gasta para reduzir os 10 ml do reativo de

Benedict.

h) Repetir a mesma operação utilizando soro de leite desnatado obtido pelo seguinte procedimento: 25
ml de leite, 70 ml de água, 5 ml de ácido acético. Agitar vagarosamente e observar a floculação da
caseína. Deixar em repouso para decantar a caseína e filtrar o sobrenadante em algodão para obtenção
de um soro límpido.
OBS: AS DUAS TITULAÇÕES DEVEM SER EXECUTADAS DA MESMA MANEIRA

i) Anotar a quantidade de soro necessária para reduzir os 10 ml do reativo de Benedict e fazer os

cálculos.

CÁLCULOS

PADRÃO PROBLEMA

1g --------------100 ml ml gastos --------------x g

x g---------------- ml gastos 100 ml ---------------- Y g

Xg = massa de lactose necessária para Yg = ....% x diluição do leite

reduzir 10 ml do reativo de Benedict. (concentração de lactose no soro)

1
 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES

REAGENTES:

Reativo de Benedict
Solução padrão de lactose 1%
Soro de leite desnatado

MATERIAL:

Erlenmeyer de 125 ml – 2
Bureta de 25 ml e garra dupla
Garra com mufa pequena
Tripé
Tela de amianto
Bico de Bunsen
Azulejo branco
Becker de 50 ml - 2

PIPETAS:

10 ml - 1

2
 CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDIOS

1. SOLUBILIDADE

Compare a solubilidade dos lipídios em cada um dos tubos:

i. Separar 3 tubos de ensaio e colocar três gotas de óleo em cada.

ii. Acrescentar os diferentes solventes em cada tubo e observar o resultado.

Tubo Resultado observado

Tubo 1 – 5 mL de água + 3
gotas de óleo
Tubo 2 – 5 mL de acetona+ 3
gotas de óleo
Tubo 3 – 5 mL de álcool+ 3
gotas de óleo

2. REAÇÃO DE HIDRÓLISE ALCALINA OU SAPONIFICAÇÃO

i) Colocar em um tubo de ensaio grande 0,5 g de gordura vegetal hidrogenada.

ii) Adicionar 5 mL de solução alcoólica de KOH 10%.
iii) Levar o tubo ao banho-maria fervente por 3 minutos.
iv) Acrescentar 10 mL de água e manter o tubo em banho-maria fervente por 2 minutos.
v) Observar a formação abundante de espuma ao agitar.

A hidrólise alcalina dos triacilgliceróis produz uma mistura de glicerol e sais de ácidos
graxos (sabões de sódio ou sabões de potássio). Os sabões são moléculas anfipáticas que
apresentam uma longa cadeia hidrocarbonada ou cauda apolar e um grupo carboxílico polar. Ao
contrário dos ácidos graxos de cadeia longa, os sabões formam soluções coloidais estáveis em
água, porque suas moléculas se associam através de interações hidrofóbicas entre as caudas
apolares formando micelas. Na superfície externa das micelas ficam os grupos carboxílicos,
carregados negativamente, em contato com a água. A interação com a água e a repulsão
eletrostática entre suas cargas negativas, permitem que as micelas se mantenham em solução. Na
superfície da água, as moléculas de sabão se orientam em uma camada onde as cabeças polares
interagem com a água, enquanto as caudas apolares permanecem fora do líquido.
Os sabões apresentam poder emulsificante porque possibilitam a dispersão das gorduras
em meio aquoso. Quando agitados com óleo ou gordura, em meio aquoso, eles interagem com as
gotículas de gordura através de suas caudas apolares, enquanto seus grupos carboxílicos ficarão
expostos em contato com a água.
3. SEPARAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS

i) Colocar no tubo de ensaio em que se processou a saponificação (item 2) um pedaço de papel de

tornassol azul.
ii) Adicionar 1,0 mL de ácido clorídrico concentrado e agitar fortemente até que o papel azul se
torne rosa e ao mesmo tempo sejam formados ácidos graxos insolúveis que abandonam a fase
aquosa e flutuam originando um anel alaranjado na superfície.
iii) Depois de separados os ácidos graxos, mergulhar o tubo em água gelada sem agitar e esperar a
solidificação do anel de ácidos graxos.

R-COO¯K+ + HCl R-COOH + KCl

Sabão de potássio Ácido graxo
solúvel insolúvel

4. NEUTRALIZAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS

i) Com o auxílio de um bastão, decantar a parte líquida do tubo de ensaio da experiência anterior,
deixando o anel de ácidos graxos solidificado.
ii) Acrescentar 10 mL de água e manter o tubo em banho-maria fervente por 2 minutos.
iii) Juntar 0,5 mL de solução de NaOH 10% e agitar fortemente para obter uma solução clara de
sabão.

R-COOH + NaOH R-COO¯Na+ + H2O

Ácido graxo Sabão de sódio
Insolúvel solúvel

5. CARACTERIZAÇÃO DE COLESTEROL - REAÇÃO DE LIEBERMANN-BURCHARD

i) Colocar em um tubo de ensaio 2 mL de colesterol 1%.

ii) Acrescentar 1 mL de anidrido acético e agitar.
iii) Juntar pelas paredes do tubo inclinado 0,5 mL de ácido sulfúrico concentrado.
iv) Agitar lentamente observando a mudança de coloração até o aparecimento de cor verde.

6. TESTE DE KREIS

Baseia-se no desenvolvimento de coloração rósea ou avermelhada quando amostras de

óleo ou gorduras são submetidas a floroglucina, um derivado fenólico que se complexa com
produtos gerados pela rancificação por auto-oxidação.

i) Em um tubo de ensaio coloque 1 mL de amostra de óleo novo e em outro tubo 1 mL de amostra

de óleo velho.
ii) Adicione aos dois tubos 5 mL de ácido clorídrico concentrado e 0,5 mL de floroglucina.
iii) Agite vigorosamente por alguns segundos. A intensidade de cor desenvolvida é proporcional à
rancidez.
 PRECIPITAÇÃO DA CASEÍNA DO SORO DO LEITE

Experimento 1: precipitação da caseína do soro do leite

a) Adicionar a um becker de 150 mL, 80 mL de água destilada;

b) Acrescentar 20 mL de leite desnatado medido em proveta;
c) Transferir 2 mL de ácido acético 4%;
d) Agitar vagarosamente com bastão de vidro e observar a floculação da caseína. Deixar
em repouso;
d) Filtrar em pano, comprimindo levemente o resíduo constituído de caseína;
e) Transferir a caseína com auxílio de uma espátula para um vidro de relógio.

Experimento 2: Avaliação da solubilidade da caseína

a) Testar a solubilidade da caseína em água, adicionando a um tubo de ensaio uma porção

de caseína e 3 mL de água destilada. Agitar e observar a insolubilidade da caseína.
b) Testar a solubilidade da caseína em etanol, adicionando a um tubo de ensaio uma
porção de caseína e 3 mL de etanol. Agitar e observar a insolubilidade da caseína.
c) Testar a solubilidade da caseína em NaOH 0,5 M, adicionando a um tubo de ensaio,
uma porção de caseína e 3 mL de NaOH 0,5M. Agitar prolongadamente e observar a
solubilização da caseína.
d) Utilizando a caseína solubilizada com NaOH (item c), transferir a metade da mistura
contida no tubo de ensaio no 3 para o tubo de ensaio no 4. Juntar 2 mL de cloreto de
cálcio 10% ao conteúdo do tubo de ensaio no 3 e 2 ml de ácido acético 5% ao tubo de
ensaio no 4. Agitar e observar a precipitação de caseinato de cálcio insolúvel no tubo de
ensaio no 3 e a precipitação da caseína insolúvel no tubo de ensaio no 4.

Experimento 2: Pesquisa de açúcar no soro do leite

a) Reação de Molish: Colocar em um tubo de ensaio, de 3 mL de filtrado e 6 gotas de

alfa naftol 5%. Agitar. Adicionar lentamente pelas paredes do tubo de ensaio inclinado
2 mL de ácido sulfúrico concentrado, sem agitar. Observar o aparecimento de
um anel violeta.
b) Reação de Benedict: Colocar em tubo de ensaio, 2 mL do Reativo de Benedict.
Adicionar 1 mL do soro do leite, agitar e aquecer em banho maria fervente até o
aparecimento de um precipitado vermelho tijolo.