UNIVERSIDADE DOS AÇORES

UNIDADE CURRICULAR DE BIOQUÍMICA - AULAS PRÁTICAS

- TRABALHO 4 -

Preparação e eficácia
de soluções tampão
 Preparação e eficácia de
soluções tampão

- BREVE INTRODUÇÃO –

Os SERES VIVOS mantêm valores de pH praticamente constantes por ação de sistemas tampão
(mistura de um par ácido-base conjugado que é capaz de resistir a elevadas mudanças de pH quando
lhe são adicionadas pequenas quantidades de um ácido ou base fortes).

PODEM ASSIM RESISTIR a variações de pH devidas à produção metabólica de ácidos (e.g. ácido láctico) e
de bases (e.g. amónia). Os principais sistemas tampão encontrados nos fluidos celulares envolvem
fosfatos, bicarbonato, aminoácidos e proteínas.

A relação entre:
- o pH de uma solução tampão
- e as concentrações do par ácido/base que a compõe é dada pela equação de Henderson-
Hasselbach.

Pode-se preparar uma solução tampão de duas formas:

(1) pesar separadamente os dois componentes, de maneira a obter-se a razão desejada entre eles, e
dissolvê-los num volume adequado de água;
(2) obter ambos os componentes da mistura a partir de uma dada quantidade de um dos componentes
da mistura, sendo o segundo formado pela adição de uma quantidade especificada de um ácido ou base
forte.
Nesta aula vamos utilizar o método indicado em (1).
 - PROTOCOLO -

A. Prepare a seguinte solução tampão:

25 mL de tampão fosfato 0.25 mol/dm3, pH 7.5

A.1. Utilize os dados da Tabela 1 para escolher as substâncias a partir das quais preparará a solução
pretendida.

A.2. Siga os passos sugeridos abaixo.

(a) A partir da equação de Henderson-Hasselbach calcule a molaridade de cada um dos
componentes do tampão (ácido e base conjugada), tendo em conta que a concentração indicada
refere-se à soma das moles dos dois componentes da solução por litro.

(b) Calcule as quantidades a pesar dos reagentes escolhidos (para os cálculos procure, nos frascos dos
reagentes apresentados no anexo do protocolo, os valores das massas moleculares):

Tampão fosfato:
componente ácido:____________ M.M.:__________g/mole; g/25mL:___________

componente básico:____________ M.M.:__________g/mole; g/25mL:___________

(c) Pese os reagentes e dissolva-os num copo graduado de 25 mL usando um agitador magnético.
Acerte o volume num balão volumétrico, homogenize bem e volte a deitar no copo graduado.

(d) Confirme o pH da solução tampão utilizando o papel indicador e o medidor de pH (elétrodo de

vidro).
B. Verifique a eficácia do tampão que preparou

B.1. Pretende avaliar a variação de pH sofrida pela solução tampão preparada, em comparação com
outras soluções fornecidas (água destilada, solução de sacarose e solução de um aminoácido),
depois da adição de diferentes quantidades de HCl 1 mol dm-3 a cada uma delas.

B.2. Avalie ainda as alterações de pH que as soluções sofrem quando lhes adiciona NaOH 1mol dm-3.

Sugestão: use volumes pequenos de cada uma das soluções (10 mL) e quantidade de HCl e NaOH que
se possa medir às gotas.
Não se esqueça: após a adição da(s) gota(s), e antes de medir o pH (utilizando o papel indicador),
agite muito bem (com uma vareta de vidro) a solução.

-3
pH após a adição de n gotas de HCl 1mol dm

Solução (10 mL)

n= 0 n= 1 n= 2 n= 5 n= 10 n= 15

Água destilada

Tampão fosfato

Solução de sacarose

Solução de aminoácido
(arginina)

(n=0 gotas, ou seja, o pH antes de qualquer adição)

-3
pH após a adição de n gotas de NaOH 1mol dm

Solução (10 mL)

n= 0 n= 1 n= 2 n= 5 n= 10 n= 15

Água destilada
Tampão fosfato

Solução de sacarose

Solução de aminoácido
(arginina)

(n=0 gotas, ou seja, o pH antes de qualquer adição)

Bibliografia
- Beynon, R.J. & Easterby, J.S. 1996. Buffer solutions. The basics, IRL Press, Oxford.
- Bohinski, R.C. 1979. Modern Concepts in Biochemistry, 3rd edition, Allyn and Bacon, Boston.
- Gilbert, H.F. 1991. Basic Concepts in Biochemistry. A Student´s Survival Guide, Ed. Mc Graw-Hill
Inc., New York.
- Simpkins, I. 1995. General Principles of Biochemical Investigations. In Wilson, K. & Walker, J.
(Eds.), Principles and Techniques in Practical Biochemistry, Cambridge University Press, Cambridge,
pp. 10-14.

Questionário
1. A solução que preparou tinha o pH pretendido? No caso de a resposta ser negativa, pense em
explicações para esse facto.

2. Qual (ou quais) das soluções que testou apresentava poder tampão? No caso das que apresentavam,
explique porque possuem esse poder tampão.

3. Sabendo que a eficácia de um tampão (capacidade tampão) é máxima sempre que a relação entre a
concentração das espécies envolvidas é inferior ou igual a um fator de 10 vezes, estará o tampão
preparado em situação de capacidade máxima?
Anexo do protocolo: reagentes Na2HPO4 (à esquerda) e NaH2PO4.H2O (à direita)
- ANEXO –
 A. REVISÃO DE ALGUNS CONCEITOS

A.1. Massa atómica. Massa molecular.

A unidade do Sistema Internacional (SI) para quantidade de matéria é a mole (mol).

A MASSA MOLAR de qualquer elemento é a massa em gramas de número igual à massa atómica desse
elemento.
Para calcular a massa molecular de um composto basta somar as massas atómicas de todos os átomos
de uma molécula.

Por exemplo, a massa atómica do oxigénio é 16 u.m.a., logo:

1 mole de oxigénio pesa precisamente 16 g e contém 6.022 × 1023 átomos de oxigénio.

Diz-se então que a MASSA MOLAR do oxigénio é 16 g mol-1.

P.e., a MASSA MOLAR do ácido fosfórico (H3PO4) é: 3 × 1.008 + 30.97 + 4 × 16 = 98 g mol-1.

NOTA: Pode-se calcular o número de moles, n, existentes numa dada massa m duma amostra de uma
substância de MASSA MOLAR M, pela relação mássica:

A.2. Unidades de concentração. Molaridade.

Para exprimir a quantidade de soluto em soluções utilizam-se unidades de concentração. A

concentração de uma solução é a quantidade de soluto numa dada quantidade de solução. Existem
várias unidades de concentração, como p.e. a molaridade.

Molaridade ou concentração molar (M ou mol dm-3 ou mol/dm3):

- nº de moles de soluto por litro (dm3) de solução.

A.3. Ácidos e bases. Equação de Henderson-Hasselbach.

Recordemos o conceito de par ácido-base conjugado:

a constante de dissociação desse par será:

e o logaritmo dessa constante:

Rearranjando a expressão [l] do equilíbrio de

dissociação de um ácido e aplicando logaritmos,
chega-se à equação de Henderson-Hasselbach
[equação 3].

B. SOLUÇÕES TAMPÃO

B.1. Importância

Os processos bioquímicos são extremamente sensíveis ao pH. Este facto pode dever-se a várias razões:

(a) o processo pode envolver iões H+ como reagente ou produto; (b) o pH do meio pode alterar as
ionizações de reagentes e produtos, e (c) o pH pode também influenciar o estado de ionização de
grupos constituintes de certas moléculas (ex.: aminoácidos de proteínas), conferindo-lhes uma
conformação molecular que vai condicionar a sua atividade biológica.

Os seres vivos mantêm valores de pH praticamente constantes por ação de sistemas tampão. Podem
assim resistir a variações de pH devidas à produção metabólica de ácidos como o ácido láctico e de
bases como a amónia. Os principais sistemas tampão encontrados nos fluidos celulares envolvem
fosfatos, bicarbonato, aminoácidos e proteínas.

Em estudos bioquímicos é quase sempre indispensável a utilização de soluções tampão para o controlo
do pH. Estas soluções devem: (a) possuir capacidade de tamponização efetiva na gama de pH
necessária ao estudo em causa, (b) ser inertes enzimática e hidroliticamente, (c) não ser inibidores
biológicos, (d) não absorver a luz na região visível ou do ultravioleta, caso a investigação inclua, por
exemplo, ensaios espectrofotométricos.

B.2. Solução tampão: definição, exemplo e capacidade tamponante.

Tampão: mistura de um par ácido-base conjugado que é capaz de resistir a elevadas mudanças de pH
quando lhe são adicionadas pequenas quantidades de um ácido ou base fortes.

Exemplo de um tampão:
Tampão fosfato (pKa 7.2)

1. Tamponização de um ácido:

2. Tamponização de uma base:

Este esquema realça outro facto: uma solução tampão mais concentrada resiste melhor a variações de
pH que uma mais diluída (conforme abaixo ilustrado).
Se adicionarmos uma pequena quantidade de um ácido forte, por exemplo 10 -3 moles de HCl, a 1 litro
de água destilada, a variação de pH é muito elevada:

A adição da mesma quantidade de ácido a 1 litro de solução tampão provoca uma variação de pH

desprezável:

Portanto: como se vê, a variação de pH resultante da adição de uma quantidade de ácido ou base será

tanto menor quanto maiores forem [HA] e [A -], isto é, quanto mais concentrada for a solução tampão.
Por outras palavras: a capacidade de tamponização depende, entre outros, da concentração molar do
ácido fraco e sua base conjugada.

A equação de Henderson-Hasselbach (recordada na Fig. ao lado) permite-nos

concluir que a eficiência máxima como tampão de uma solução de um par ácido-
base conjugado ocorre quando o ácido e a base estão presentes numa razão
equimolar (nesse caso o pH da solução é igual ao pKa).

Substituindo valores na equação, e traçando uma curva de titulação, como na Fig. 1, verificamos que a
solução só tem poder tamponizante numa gama de pH entre pKa+1 e pKa-1. Fora dessa região,
uma pequena adição de ácido ou base leva a uma grande variação de pH.
Fig 1. Curva de titulação de uma solução tampão de um ácido-base conjugado. Quanto mais próximo do pK a, menor a

variação de pH causada por adição de ácido ou base. Entre pK a +1 e pKa -1, a variação de pH é reduzida (menor declive da
curva).

A Fig. 2 representa as curvas de titulação de um ácido diprótico e de um ácido triprótico

Fig.2. Curvas de titulação de um ácido diprótico (A) e de um ácido triprótico (B).