Meio NNN (para um total de 100ml - 33tubos)

Agar base 1,4g Uso de erlenmeyer estéril,

NaCl 0,6g contendo esferas de vidro em
Sangue desfibrinado 20ml (20%) seu interior, para desfibrinação
dH2O qsp 80ml do sangue (ovino).

Preparo: Dissolver o NaCl na água, adicionar o ágar e aquecer em micro-ondas até a

fusão completa (não deixar ferver). Esterilizar a 120°C/20min em autoclave sob
pressão. Aguardar o resfriamento até cerca de 50°C e adicionar o sangue (em capela).
Após a homogeneização, distribuir em tubos de ensaio um volume de 3ml. Deixar
solidificar em posição inclinada. Estocar em geladeira até o momento do uso.
*separar um tubo para teste de esterilidade: manter em estufa a 37ºC por, pelo menos,
24h.

Meio LIT p/150ml p/250ml

Liver infusion broth 35g/L 5,25g 8,75g
Tryptose 10g/L 1,5g 2,5g
Sacarose 20g/L 3,0g 5,0g
SFB 20% (15 ou 10%) 22,5ml 37,5ml
Hemoglobina (Hb) 0,2% 0,3ml 0,5ml
Antibiótico* (AB) 0,1% 0,15ml 0,25ml
127,05mL dH2O 211,75mL dH2O
*Penicilina (100U/ml) + Estreptomicina (100µg/ml)
Dissolver a infusão de fígado, a tryptose e a sacarose na água destilada. Esterilizar a
120°C/20min em autoclave sob pressão. Aguardar o resfriamento e acrescentar o soro
fetal bovino (SFB), AB e a Hb em capela.
*separar um tubo para teste de esterilidade: manter em estufa a 37ºC por, pelo menos,
24h.
Solução estoque de penicilina e estreptomicina
Preparar, na capela, a solução estoque de penicilina e estreptomicina com água para
injeção, filtrar em filtros millipore de 0,22µm, aliquotar e congelar a -20°C.
Inativação do SFB
56°C/30min, em banho maria, estocar em alíquotas de 50ml (Tubo Falcon).
Preparação da Hemoglobina
- Coletar 3ml de sangue de ovino com anticoagulante (citrato);
- Centrifugar a 2000rpm/10min;
- Desprezar o plasma;
- Acrescentar água destilada, 10x a quantidade de hemácias;
- Deixar em repouso por 15min a temperatura ambiente;
- Centrifugar por 45min a 2500rpm, usa o sobrenadante;
- Filtrar em filtro millipore de 0,22µm;
- Congelar em microtubos estéreis.

* Manter os cultivos em BOD (22ºC), com repiques (de 100 a 300µl) a cada 15 dias.

Preparação de antígeno para RIFI

- Cultivo de Leishmania infantun: 3 passagens no LIT (300µl de cultivo para 3ml de

LIT) com intervalos de 3 a 4 dias;
- Escolher um meio de cultura (LIT) com um bom crescimento (+20 leish/campo,
alongadas e bastante móveis = fase log.);
- Centrifugar o cultivo a 1500rpm/10min;
- Descartar o sobrenadante;
- Ressuspender o pellet em 2ml de PBS;
- Centrifugar novamente;
- Descartar o sobrenadante;
- Ressuspender o pellet em uma solução de formaldeído a 10% e PBS, na razão de 1:1;
- Centrifugar e descartar sobrenadante;
- Ressuspender em 2ml de PBS;
- Avaliar no microscópio (observar se as leishmanias estão mortas, porém com as
formas conservadas);
- Centrifugação e lavagem por mais 2x;
- Descartar o sobrenadante;
- Ressuspender o pellet em 1 ml de PBS;
- Homogeneizar e avaliar no microscópio (obj. 40X -> 20 a 50 formas por
campo/câmara de neubauer (106);
- Fixar o antígeno na lamina de RIFI com acetona.
Material necessário para preparação de 100mL de NNN e 150mL de LIT
-Pipetas (de 100 a 1000µl; de 10 a 100µl; e de 1 a 5mL) e ponteiras estéreis para as
respectivas pipetas (ao menos um rack de cada);
-Erlenmeyers não estéreis (um para cada meio);
-Tubos de ensaio estéreis (ao menos 40);
-Gaze para fabricação de “coelhos” para vedação do erlenmeyer;
-Cordão, papel madeira e papel alumínio para vedação do erlenmeyer;
-Fita para autoclave e para identificação dos materiais;
-Laminas e lamínulas para avaliação dos cultivos.
Material necessário para preparação de AB e Hb, inativação do SFB e preparação
de antígeno
-Erlenmeyer estéril;
-Filtros millipore de 0,22µm para seringa (em torno de 10);
-Seringas de 10 ou 20 mL (em torno de 5);
-Microtubos de 1,5ml estéreis;
-Tubos Falcon de 15 e 50 mL, estéreis e não estéreis (em torno de 10 de cada);
-Água para injeção;
-Formaldeído (10%);
-PBS (7,2pH).