QUANTIFICAÇÃO SOD (MARKLUND; MARKLUND, 1974)

Fazer o experimento em cubeta de quartzo.

Leituras à 25 C e 420 nm

Leitura do controle (pirogalol)

- Tampão Tris 50 mM + EDTA 1 mM  990 uL
- Pirogalol 20 mM diluído em HCl 10 mM  10 uL
- ler por 2 min, a cada 10 s. ( obs.: descartar o primeiro minuto, ler o minuto 2 e
3)

Amostra
- Tampão Tris 50 mM + EDTA 1 mM  qsp 1000 uL
- Lisado celular (o mesmo da CAT)  equivalente a 50 ug de proteína
- Pirogalol 20 mM diluído em HCl 10 mM  10 uL
- ler por 2 min, a cada 10 s.

Reagentes

Tampão Tris-HCl 50 mM + EDTA 1 mM pH 8,2

Tampão Tris

uM = ug/mL x 1000
peso molar

50.000 uM = X x 1000
121,14 g/mL

X = 6.057 ug/mL = 6 mg/mL

Para preparar 80 mL: 6 x 80 = 480 mg + 80 mL água destilada.

EDTA

1000 = X x 1000
372,24

X = 372,24 ug/mL = 0,372 mg/mL

Para preparar 80 mL: 30 mg + 80 mL água destilada.
Pirogalol 20 mM (Pyrogallol, Sigma, PM: 126,11)

20000 = X x 1000
126,11

X =2.522,2 ug/mL = 2,5 mg/mL

Para preparar 2 mL= 5 mg pirogalol dissolvido em 2,5 mL HCl 10 mM

HCl 10 mM

Molaridade (M) = Normalidade (N)

10 mM = 0,01 M = 0,01 N

Para preparar 80 mL:

M= m
Mm/V
m= M.mm.V
m= 0,01M . 36,5g/mol . 0,08L
m= 0,0292 g HCl

O HCl é apresentado em solução à 36,5%, então:

0,0292 --- 36,5%
x------------- 100%
x=0,08g

d=m/v
1,19=0,08/v
V=0,0672 mL = 67,2 uL + 79.932,8 uL água destilada
Obs.: Adicionar em béquer primeiro a agua e então lentamente adicionar sob a agua o
ácido.
 CURVA PADRÃO SOD
SOD from bovine liver – sigma S8160 – ≥1500 units/mg protein

As diluições devem ser mantidas no gelo;

Fiz diluições de 32 a 0,25 U/mL. Preparei em tampão tris + EDTA pH=8,2

Pesei 1 mg de SOD e dilui em 1000 uL de tampão

Quantifiquei proteína por Bradford (solução à 25%) – 200uL Bradford + 10uL amostras
Em 1 mg/mL CAT  0,133 mg proteína
Considerando que em 1 mg prot = 1500 Unidades
1 mg prot – 1500 U
0,133 – X
X= 199,5 U
Entao:
199,5 U – 1 mL  199,5 U/mL
C1V1=C2V2
199,5.V1 = 64. 1000
V1= 320,8 uL + 679,2 uL tampão para se obter a primeira diluição de 64 U/mL
Depois dilui 1/1 até chegar na diluição de 0,25 U/mL.
Mantive os eppendorfs no gelo enquanto realizei as leituras.
Pipetei na cubeta: 950 uL tampão + 40 uL SOD + 10 uL pirogalol
Li por 3 min., descartando o primeiro minuto.
Para fazer os cálculos: Subtrair os resultados das amostras na curva padrão de SOD, depois
corrigir por prot. total. Entao se obtem o resultado final como: U SOD/mg of protein