MTODO ORAC

1. PREPARAO DOS REAGENTES QUE PODEM SER CONSERVADOS

1.1.PREPARAO DO TAMPO PBS 0.075 M (pH 7.4)
Soluo de K2HPO4 13,06 g de K2HPO4 para 1 L de gua destilada (SOLUO A)
Soluo de NaH2PO4.H2O 2,59 g NaH2PO4.H2O em 250 mL de gua destilada (SOLUO B)
Misturar 810 mL da SOLUO A com 190 mL da SOLUO B at pH 7.4
Conservar no frigorfico a 4 C
1.2. PREPARAO DA FLUORESCENA DISODIO (1166,1 M)
Pesar 0,01097 g de FL e completar com tampo PBS at 25 mL
Conservar a 4 C durante um perodo mximo de 1 ms

2. PREPARAO DOS REAGENTES DIRIOS

2.1. PREPARAO DA SOLUO DE FLUORESCENA
Adicionar a 100 L da soluo stock preparada e completar com PBS at 10 mL
Da soluo obtida anteriormente, retirar 250 L e completar com PBS at 25 mL (esta soluo a usada
para as anlises dirias) (116,66 nM)
2.2. PREPARAO DO TROLOX

Pesar 0,0125 g de Trolox para um recipiente, adicionar 1 mL de metanol e completar com PBS at 50 mL
Da soluo obtida anteriormente, retirar 1 mL e completar com PBS at 10 mL (Soluo T0):
- 800 L T0 + 200 L PBS (T8)

- 400 L T0 + 600 L PBS (T4)

- 700 L T0 + 300 L PBS (T7)

- 300 L T0 + 700 L PBS (T3)

- 600 L T0 + 400 L PBS (T6)

- 200 L T0 + 800 L PBS (T2)

- 500 L T0 + 500 L PBS (T5)

- 100 L T0 + 900 L PBS (T1)

2.3. PREPARAO DO AAPH

 Pesar 0,13018 g de AAPH e completar com 10 mL de PBS

3. DETERMINAO DA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE

Controlo: 80 L de PBS + 120 L de FL

Branco: 20 L de PBS + 120 L de FL + 60 L de AAPH
Trolox: 20 L de Trolox ( concentraes) + 120 L de FL + 60 L de AAPH (padres)
Amostras: 20 L da Amostra ( concentraes) + 120 L de FL + 60 L de AAPH (amostras em duplicado,
seis diluies)
As amostras devem preparar-se em vrias concentraes para que a sua curva de AUC esteja dentro do
intervalo de Trolox, aproximadamente entre 8 e 45
1. Trabalhar com o fluormetro
a) Acender o fluormetro
b) Abrir o programa. Programar a temperatura do mtodo (40C)

c) Preparar a placa com PBS, Trolox ou amostra e o volume de FL, deixar incubar a placa 10 min, fazendo
correr o mtodo. necessrio controlar a ganncia (Gain adjustment), que deve estar entre 30 e 34.
(1750 quando novo)
d) Adicionar aos poos o AAPH e voltar a fazer correr o mtodo, controlando igualmente a ganncia da
mesma forma. O mtodo dura 1:40 aproximadamente.
REAGENTES MTODO ORAC:
TAMPO PBS:
K2HPO4
NaH2PO4.H2O
Fluorescena(sigma) F-6377 100 g, Sodium Salt 376.3.
Trolox (Aldrich) 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylbroman-2-carboxylic acid 97% C4H8O9 EC 258-422-8 PM:
250,29 g/mol, 5 g, 97 %.
metanol
AAPH (Aldrich) 2,2-azo-bis-(2-methylpropionamidine)-dihydrochloride, 97%, 100 g, Cas 2997.92.4
Microplacas
Aparelho Fluostar ptima BMG LABTECH

TRATAMENTO DE RESULTADOS:
Abrir pgina de resultados
Seleccionar s os valores, sem a linha da temperatura e copiar
Abrir uma pasta de Excel (modelo) nova e copiar os valores na primeira folha
Copiar a primeira coluna para a segunda folha e fazer com que todas as colunas dessa folha sejam iguais
Ver resultados folha 3

Em Madrid:
Copiar a segunda tabela da primeira folha para a folha do programa inicial
Copiar tudo, agora com a linha da temperatura tambm para o programa novo Fluorstar galaxy
Abrir programa
No smbolo Excel abrir e seleccionar . Stat
Copiar a pag do programa anterior para esta pgina
Limitar o Cal Range State 1-104
Abrir pgina evaluation 96
Copiar a tabela 2 para a pgina 3 da folha de Excel (modelo)
Ajustar o branco
Tirar o declive das curvas padro e das amostras
O valor da actividade antioxidante a razo entre elas
Valores expressos em mol de Trolox / mg de protena