CURSO: MEDICINA – DISCIPLINA: GENÉTICA (BEV712) – PROFESSORA: Patrícia de Abreu Moreira

MONITOR: Vítor Barcelos Fagundes – 2º período/MEDICINA – Contato: (vitorbarcelos01@gmail.com)

RESOLUÇÃO DA LISTA DE EXERCÍCIOS PARA PROVA PRÁTICA – (1) Extração do DNA plasmidial; (2) Eletroforese
horizontal em gel de agarose; (3) Mutação induzida por luz UV

RESPOSTAS DAS QUESTÕES RELACIONADAS À PRÁTICA 1

1) Qual a importância de centrifugar os tubos com a cultura de bactérias mais de uma vez?

R: para conseguir maior quantidade de células e também de DNA plasmidial (que é importante
para oferecer um melhor resultado na eletroforese, quando será analisado o movimento das
moléculas de DNA.)

2) Qual a função da adição do(a):

GLICOSE  Elevar a pressão osmótica no meio extracelular (para que a lise da
parede celular ocorra de forma menos brusca)

TRIS  Age como um tampão para manter o pH constante

EDTA  Inibe a atividade de desoxirribonucleases (DNases) pois atua como

agente quelante de íons essenciais para a atividade destas enzimas
(Mg2+)

SOLUÇÃO DE NaOH  Favorece o rompimento celular e a dupla fita de DNA (por favorecer
um ambiente alcalino)

SDS  É um agente detergente que solubiliza lipídeos. Também é utilizado

para se certificar que nenhuma nuclease que não depende de Mg2+,
cause qualquer degradação

ÁCIDO ACÉTICO  Viabiliza a renaturação do DNA por meio da neutralização do pH

ACETATO DE  Precipita o SDS junto do debri celular

POTÁSSIO
ETANOL  Precipita os ácidos nucleicos

ETANOL 70%  Auxilia na remoção do excesso de sal e SDS da solução

QUESTÕES RELACIONADAS À PRÁTICA 2

3) Qual a finalidade da imersão do gel de agarose em solução de brometo de etídio?

R: Esse corante fluorescente se intercala entre os pares de bases empilhados da molécula de
DNA/RNA, sendo então importante para a visualização dos ácidos nucleicos pela emissão de
fluorescência sob radiação ultavioleta .

4) A mobilidade eletroforética do DNA através do gel de agarose é influenciada por vários

fatores, cite 2.
R:

 Tamanho dos fragmentos de DNA: fragmento menor é mais rápido.

 Conformação do DNA: o formato do fragmento de DNA de um determinado tamanho
influencia a velocidade de migração.
 Corrente aplicada: maior voltagem resulta em migração mais rápida. (voltagens
muito altas ou muito baixas não são recomendadas).
 Direção do campo elétrico: DNA migra em direção ao ânodo (carga positiva) devido
aos grupos fosfatos de carga negativa.
 Composição do tampão de eletroforese: Na ausência de íons a condutância elétrica é
mínima e o DNA migra bem devagar.

5) Cite qual seria uma provável conformação do DNA plasmidial para as regiões
identificadas pelas letras A, B e C (considerando a presença da forma circular relaxada,
forma linear e forma superenovelada).

A mobilidade das formas do DNA no gel não depende somente do tamanho da molécula,
mas da densidade, torção do DNA e de outros fatores. Assim, como nem sempre o DNA está
na forma linear e descondensada, podem ser causadas diferenças na migração do
fragmento no gel. É válido lembrar que tal forma de migração não é idêntica para todas as
moléculas e que existem outros fatores que interferem nesse quesito.
O DNA superenrolado é capaz de migrar mais rapidamente porque passa pelos poros com
menor dificuldade devido, por exemplo, a sua “pequena área ocupada”. O DNA circular é o
mais lento, pois por ocupar maior área acaba se “prendendo” aos poros e encontrando
maior dificuldade para a migração.

6- Marina estava realizando uma eletroforese horizontal em gel de agarose. Após realizar
todos os passos anteriores corretamente, aplicou a mistura da amostra + tampão nas
canaletas e iniciou a eletroforese. Cite dois sinais que indicam que a corrente elétrica
realmente está passando pela cuba.

R.:

 Visualização dos produtos da eletrólise da água (ou melhor, formação de bolhas de

hidrogênio no eletrodo negativo e gás oxigênio surge a partir do eletrodo positivo)
 Visualização dos corantes do tampão migrando através do gel em direção ao polo
positivo.

7- César esqueceu de misturar azul de bromofenol nas amostras de DNA a serem

analisadas pela eletroforese horizontal em gel de agarose. Qual será a consequência desse
descuido?

R.: Ele não terá o controle necessário de quanto ainda resta para completar a corrida do
DNA pelo gel, pois não visualizará a posição do fragmento, além de que enfrentará maior
dificuldade na deposição da amostra nas canaletas, uma vez que essa substância facilita a
aplicação da amostra no gel (acrescentam cor na amostra) .

8- Normalmente adiciona-se glicose junto ao DNA nas canaletas do gel de agarose. Por
qual motivo?
R.: A glicose auxilia na manutenção do DNA no fundo da canaleta do gel de agarose, uma
vez que eleva a densidade da amostra e faz com que ela afunde rapidamente no poço,
importante para que o fragmento possa penetrar corretamente na matriz.

9- Após realizar todo o preparo, corretamente, da amostra de DNA e do gel de agarose,

Ana ligou a cuba de eletroforese, e após 30 minutos percebeu que a amostra não correu
pelo gel. Onde Ana errou? (Considerando o esquema abaixo).

R.: O erro foi ligar de forma invertida o ânodo e o cátodo. Uma vez que o fragmento de DNA
corre em direção ao polo positivo, este deve estar do lado mais distante das canaletas onde
se aplica o gel. Logo, a forma correta seria:
QUESTÕES RELACIONADAS À PRÁTICA 3

10- Luísa fez todo o procedimento, seguindo o roteiro corretamente. No entanto, após
incubar a placa pelo tempo determinado percebeu que as colônias haviam crescido quase
normalmente. Sabendo que Paulo esteve no laboratório durante o processo, o que pode
ter ocorrido?

R: Paulo provavelmente abriu a incubadora, fazendo com que o reparo dependente de luz ou
fotorreativação do DNA ocorresse. Esse mecanismo viabiliza o reparo de lesões pelas
bactérias, revertendo a mutação causada por luz UV. A enzima fotoliase remove os dímeros
de timina- reconhece os dímeros e se liga a eles, utilizando energia da luz para clivar as
ligações cruzadas. Caso não houvesse a abertura da incubadora, a enzima DNA fotoliase
reconhecia os dímeros mas não seria capaz de se ligar a eles.

11- A luz UV é absorvida por purinas e pirimidinas, sendo que a absorção pelas pirimidinas
é consideravelmente maior. Essa absorção é capaz de gerar dois produtos, no caso das
pirimidinas: dímeros de pirimidina e hidratos de pirimidina. Por quais mecanismos os
dímeros de pirimidina causam mutação?

R.: Esses dímeros são capazes de:

 perturbar a estrutura das duplas hélices de DNA (causam distorção)

 Interferir na replicação precisa do DNA