UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS - CAMPUS DE CURITIBANOS

Disciplina: CNS7111 – BIOTECNOLOGIA VEGETAL
Professor: Kelen Haygert Lencina – Semestre 2023/1
Acadêmicas: Gabrielly Andrade Duarte, Taise Teixeira e Thainá Elisa de Souza
Fernandes
Matrículas: 19101940, 19202815 e 17102059

RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA 11: ELETROFORESE E ANÁLISE

1 INTRODUÇÃO

Em laboratórios de biologia molecular, a eletroforese em gel de agarose é usada,

rotineiramente, para separar moléculas de ácidos nucléicos. A agarose é um polímero extraído
de algas marinhas que apresenta custo elevado. (REINIGER, 2004)
A análise de DNA por eletroforese é uma das técnicas fundamentais nos laboratórios
de pesquisa e de diagnóstico. O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir
carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou
imerso em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo
positivo (ânodo). A velocidade da migração depende do tamanho da molécula. Por isso em
um dado momento da eletroforese moléculas de tamanhos distintos se encontram em
diferentes pontos da matriz. (POSSIK, 2016)
Para a execução da eletroforese em gel de agarose, inicialmente o gel é preparado
utilizando uma solução tampão e uma quantidade de agarose (que depende da concentração
desejada). Antes do gel se solidificar, uma quantidade de corante é adicionada ao líquido.
Esse corante irá se ligar às bases do DNA, permitindo a visualização por fluorescência dos
fragmentos na presença da luz ultravioleta. (BRANDÃO, 2016)
2 JUSTIFICATIVA

Os métodos de manipulação dos ácidos nucleicos baseiam-se em suas propriedades

intrínsecas, ou seja, o fato de serem naturalmente carregados negativamente devido à
presença dos grupos fosfatos. Em sua maioria, as separações são realizadas com um gel de
agarose submerso por tampão em uma câmara. A agarose, comumente utilizada para
confeccionar o gel, é extraída de diversos gêneros e espécies de algas marinhas vermelhas que
consistem em uma mistura heterogênea de dois polissacarídeos: agarose e agaropectina. Neste
estudo, teve por objetivo utilizar da técnica para avaliar sequências homólogas para o primer
de interesse em PCR de Feijoa sellowiana.

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Análise do Gel de agarose por eletroforese, da amplificação por meio de PCR de

Feijoa sellowiana.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

● Coleta de folhas juvenis de indivíduos em minijardim clonal de Feijoa sellowiana.;

● Extração de DNA de Feijoa sellowiana. de boa qualidade;
● Amplificação por meio de PCR;
● A avaliação da qualidade do DNA extraído por meio da análise do Gel de agarose por
eletroforese.
4 MATERIAIS E MÉTODOS

● Plástico parafilme
● Placa molde
● Pipeta P200 ou P100
● Ponteiras P100, P200
● Descarte para ponteiras
● Cuba e demais acessórios para eletroforese
● Fonte para eletroforese
● Transluminador com luz UV

Reagentes:

● Azul de bromofenol 1 µl
● Corante para DNA GelRed

Na aula prática do dia 15 de junho de 2023, a PCR ficou no equipamento próprio e

foi retirada no outro dia (16), pelo técnico Gabriel, ficando armazenada para que
posteriormente na aula prática do dia 22 de junho pudéssemos aplicá-la em gel, que é uma
estrutura parecida como uma peneira em que as moléculas vão migrando do negativo para o
positivo, pois a molécula do DNA tem carga negativa e consequentemente será puxada pela
carga positiva e vai migrando pelo gel. Moléculas maiores vão esticando pelo caminho, pois
não conseguem passar e as menores vão migrando livremente e conseguem percorrer no gel.

Uma pessoa por grupo fez a aplicação de uma molécula de PCR. Nós usamos um
pedaço de plástico parafilme, onde colaboradora Camila nos emprestou o azul de bromofenol
que é uma substância que tem a capacidade de dar um pouco mais de densidade na amostra
para ela ficar bem ao fundo do pocinho e também para dar coloração, porque quando ela está
migrando no gel eu preciso ver. Na solução já tem o GelRed (corante) que é uma substância
que tem a capacidade de fixar-se no DNA e em contato com luz ultravioleta é excitado e
enxergamos na fotodocumentação.
 Na sequência, a professora Kelen pipetou a sua amostra e as amostras de todos os
grupos, então uma pessoa de cada grupo aplicou 5 µl de PCR em cada amostra no intuito de
mistura-se, pegando novamente toda a amostra com a pipeta, em seguida levamos ao pocinho
e ejetamos. Após todos aplicarem em suas amostras, foi fechada a tampa e feita a conexão
com a fonte para que a corrida eletroforese inicie e definido a corrente elétrica que ela vai
migrar, quanto maior a voltagem, mais rápido vai migrar. A importância da voltagem é que se
minha molécula é muito grande ou pesada, e eu colocar uma voltagem muito rápida, é como
se tivesse forçando a molécula a passar e minha banda pode ficar toda torta.

Após 1 hora, ao menos um integrante de cada grupo voltou e fez uma foto, para no final
realizar uma análise.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 A única PCR que deu certo que a quantidade de DNA que foi colocada e foi
amplificada inúmeras vezes, que conseguimos enxergar e achou uma sequência homóloga
para o primer que usamos, foi a PCR 6 que era da Goiabeira Serrana. A PCR em si, é uma
técnica muito delicada, porque se trabalha com DNA, estrutura celular, precisa de reagentes
novos e funcionais e muita coisa pode dar errado nesse processo e que de fato deu. O mix a
mais foi algo que pensamos que daria certo, mas sabemos que não devemos mais colocar,
talvez a concentração de DNA foi tão pequena que não deu para fazer a amplificação em
comparação ao volume total da PCR.

Como só temos duas amostras feitas para a mesma espécie, ela não tem validade
para avaliarmos, mas o certo seria olhar as bandas. Então temos o Letter na imagem que é o
marcador de bandas conhecidas e os indivíduos de 1 a 5, usando o marcador ISSRO8, tendo
mais 5 indivíduos usando outro primer, ou seja, outra sequência para fazer a PCR, ou ainda
um terceiro primer.

Então o mesmo conjunto de primer que é a técnica em si, serve para achar uma
sequência homóloga no DNA, anelar e fazer cópias em quantidades imensas que a gente
consiga enxergar e para que a gente enxergue tem que ser uma quantidade que eu adicionando
o meu corante GelRed, ele se associa à molécula e em contato a luz ultravioleta fica excitado
e conseguimos enxergar a imagem. Essas bandas indicam o tamanho que essa sequência tem,
onde sequências maiores vão ficando e menores vão migrando, ou seja temos 3.000, 2.500,
2.000, 1.500, 1.200, 1.000, até chegar em 200 pares de bases que são a quantidade de
nucleotídeos que tem na minha sequência.

As maiores ficam presas mais próximas de onde aplicamos o gel, já as menores vão
migrando com mais facilidade até que elas param, na hora que termina a eletroforese e a
minha molécula de DNA que foi replicada inúmeras vezes pelo ciclo de amplificação para.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRANDÃO, W. Q. Membranas compósitas de poliestireno/polianilina para extração de

dna em meios aquosos. Universidade Federal de Pernambuco, 2016.

POSSIK, P. A. A análise de DNA por eletroforese. http://www.ciencianews.com.

br/arquivos/ACET/IMAGENS/biologia_molecular/testesgeneticos.pdf. Acesso em 06 jul
2023.

Reiniger et al. Reciclagem de agarrose em laboratórios de biologia molecular. Ciência Rural,

v. 34, n.5, set-out, 2004.