UENF LBT/CBB

Uni versi dade Estadual do Norte Flumi nense Darcy Ri beiro Laboratório de Biotecnologia

Eletroforese
(PRÁTICA 2 – Biologia Molecular)

Coordenador: Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho

Colaboradores: Luciano de Souza Vespoli
Patrícia Louzada Rangel
Suzane Ariádina de Souza
INTRODUÇÃO

Eletroforese é uma técnica de separação que envolve o movimento de partículas

com cargas em solução, sob ação de um campo elétrico. Portanto, qualquer partícula ou
molécula carregada pode se mover nessas condições, e consequentemente podem ser
separadas, desde que tenham diferentes cargas.
A carga elétrica aplicada sob a solução é obtida através de eletrodos que são
colocados na solução. Um íon migra através da solução na direção ao eletrodo de carga
oposta. Portanto, uma partícula carregada positivamente (cátions) migra para o polo
negativo (catôdo), enquanto as partículas negativas (ânions) migram para o polo
positivo (anôdo).
Um dos métodos eletroforéticos mais comuns utilizados na prática diária em
biologia molecular é a do gel de agarose. Essa técnica muito simples, rápida e prática
apresenta boa resolução na separação dos fragmentos de DNA, quando comparada com
outros métodos.
O gel de agarose é facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia
instantânea ou sistema automatizado de captura de imagem, sob a luz UV.

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 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 2
Eletroforese

OBJETIVO: Preparar um gel de agarose para análise de ácidos nucléicos.

MATERIAL E MÉTODOS:

MATERIAL
- Cuba de eletroforese
- Fonte de força
- Suporte para gel
- Pentes para fazer os poços onde as amostras serão aplicadas
- Agarose
- Tampão de eletroforese (TAE)
- Tampão de amostra + gelred (1:500)
- Marcador lambda
- Transiluminador ou fotodocumentador (luz UV)

Atenção: Usar luvas e óculos de proteção para os olhos.

METODOLOGIA
- Preparação do gel:
Preparar a solução de agarose em frasco de Erlenmeyer e aquecê- la (até a fervura) em
banho- maria ou forno de microondas até a sua completa solubilização. O frasco deve ser
agitado frequentemente para homogeneização e para evitar transbordamento. Após a
solubilização, a solução de agarose deve ser resfriada (~50 ºC) por alguns minutos.
Posteriormente, agitar a solução e vertê- la sobre uma placa-molde de gel com o pente já
montado. Aguardar a gelificação a temperatura ambiente por 30 min. Retirar o pente
com cuidado.

- Preparação das amostras:

Em microtubos de 0,6 ml misturar 3 μl da amostra de DNA de interesse, 6 μl de água
ultrapura e 2 μl de tampão de amostra 6X.

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- Eletroforese:
1. Colocar o gel de agarose na cuba de eletroforese e submergi- lo em TAE 1X.
2. Aplicar as amostras no gel com uma micropipeta.
4. Submeter as amostras a eletroforese a uma voltagem de ~ 100 V (correpondente a 50-
70 mA), por aproximadamente 60 min. A corrida deve ocorrer do pólo negativo para o
pólo positivo. Observar a formação de bolhas que serão geradas no anodo e catodo,
devido a eletrólise.
5. Observar a eletroforese usando como referência a cor azul do tampão de amostra.
6. Terminada a eletroforese, desligar a fonte e retirar o gel da cuba.
7. Visualizar as amostras de DNA resolvidas eletroforeticamente em um transluminador
ou fotodocumentador, com iluminação ultravioleta.

Cuidados: 1) A luz ultravioleta é mutagênica. Não visualizar os géis sem as devidas

precauções de segurança.
2) Usar luvas em todas as etapas!

INFORMAÇÕES ADICIONAIS SOBRE REAGENTES E

METODOLOGIAS COMUMENTE UTILIZADOS EM MÉTODOS
EXPERIMENTAIS ELETROFORÉTICOS

TAMPÕES CONCENTRAÇÃO FORMULAÇÃO

Tris-acetato (TAE) 0,04M Tris-acetato (50X) 242g Tris-base

0,01M EDTA 57,1 ml ácido acético

100ml EDTA 0,5M(pH8,0)

Tris-borato (TBE) 0,089M Tris-borato (5X) 54g Tris-base

0,002M EDTA 27,5g ácido bórico

20 ml EDTA 0,5M (pH8,0)

Tris-fosfato (TPE) 0,08M Tris-fosfato (10X) 108 g Tris-base

0,002M EDTA 15,5ml de ácido fosfórico 85%

40ml EDTA 0,5M (pH8,0)

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 Tampão Aplicação e comentários
Usar quando o DNA vai ser recuperado
Usar para eletroforese de DNA de grande tamanho (> 1Kb)
TAE Baixa força iônica
Propriedades:
Baixa capacidade tamponante
Usar para eletroforese de DNA pequeno (< 1 Kb)
Melhor resolução de DNA pequeno (< 1 Kb)
Mobilidade do DNA mais restrita
TBE Alta força iônica
Propriedades:
Diminui a mobilidade do DNA.
Alta capacidade tamponante

Porcentagem de agarose Intervalo de eficiência da separação da molécula de DNA em Kb

0,3% 5 a 60
0,6% 1 a 20
0,7% 0,8 a 10
0,9% 0,5 a 7
1,2% 0,4 a 6
1,5% 0,2 a 4
2,0% 0,1 a 3