UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
CAMPUS VIÇOSA

PRÁTICA 2 – ELETROFORESE SDS - PAGE

BQI 305 – LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA ANALÍTICA

Bruno Henrique Sousa de Alcantara; 101981

Cíntia Soares Custódio; 101984
Davi de Souza Mendes; 101964
Júlia Gabriela Andrade de Paula; 101997
Luiza Picanço dos Santos; 101963

Prof. Orientador: Maximiller Dal Bianco Lamas Costa

Turma Prática: 2

VIÇOSA – MG
19/09/2023
INTRODUÇÃO:

A eletroforese de proteínas por SDS-PAGE (Eletroforese em Gel de

Poliacrilamida) é uma técnica amplamente utilizada para analisar a composição e a
pureza de amostras proteicas. A eletroforese é baseada na migração das proteínas
em um gel de poliacrilamida, que é submetido a uma corrente elétrica que separa
as proteínas com base em suas massas moleculares, permitindo sua identificação
e quantificação relativa.
O SDS-PAGE é um tipo de eletroforese de proteínas, onde o SDS (Dodecil
Sulfato de Sódio) é utilizado como agente desnaturante. O SDS é um detergente,
uma substância anfifílica com capacidade de desnaturalizar e conferir carga
negativa uniforme às proteínas, proporcional ao seu tamanho. Isso permite que as
proteínas migrem no gel de forma proporcional à sua massa molecular e, assim,
sejam separadas em faixas distintas.
O gel de poliacrilamida é preparado misturando um monômero de acrilamida
com um agente de reticulação e um iniciador químico em um sistema aquoso. A
proporção desses componentes é ajustada para determinar o tamanho dos poros
que compõem o gel. Géis com menor concentração de acrilamida possuem poros
maiores, permitindo a migração de proteínas de maior tamanho. Por outro lado,
géis com maior concentração de acrilamida possuem poros menores, separando
proteínas de menor tamanho.
Durante a eletroforese, a amostra proteica é preparada adicionando-se um
agente redutor e um detergente aniônico, como o SDS, no tampão de
carregamento. O agente redutor é utilizado para quebrar as pontes dissulfeto
presentes nas proteínas e desenovelar sua estrutura tridimensional, facilitando a
separação das proteínas. O SDS, por sua vez, confere a carga negativa
supracitada.
Ao aplicar a amostra no gel, uma fonte de corrente elétrica é acionada, e as
proteínas migram para o ânodo (eletrodo positivo) através do gel. O tempo de
corrida é determinado pela sua massa molecular, sendo que proteínas de tamanho
menor migram mais rapidamente. Após a corrida, o gel é corado com um corante
específico, como o Coomassie Blue, para visualizar as proteínas separadas.

OBJETIVOS:

Os objetivos desta prática experimental são:

1 - Aplicar os conceitos da técnica de eletroforese de proteínas sob condições

desnaturantes, conhecida como SDS-PAGE (Eletroforese em Gel de
Poliacrilamida).

2 - Aplicar os princípios da técnica de eletroforese de proteínas em condições não

desnaturantes.

3 - Adquirir habilidades na operação de equipamentos, incluindo cubas e fontes,

bem como na montagem das placas e na preparação dos géis.
4 - Avaliar os resultados das corridas eletroforéticas por meio da coloração das
proteínas utilizando o método do Coomassie Blue.

MATERIAIS E MÉTODOS:

Materiais para montagem da eletroforese:

- Pipetas automáticas,
- ponteiras,
- cuba eletroforética,
- água destilada
- fonte para as cubas eletroforéticas.
Reagentes para formação dos géis e concentrações de reação:
- Tampão de separação 4X - 1,5 mol de TRIS-base, 0,4% SDS - pH 6,8
- Solução Acrilamida/Bis-acrilamida 30%
- Solução 10% Persulfato de amônio
- Solução comercial de TEMED
-Tampão de corrida 10X - 0,25M TRIS-base, 1,9M Glicina, 10mM EDTA, 35mM
SDS

Reagentes usados para visualização das bandas:

- Solução corante - 0,1% Coomassie-Blue R-250, 9% ácido acético glacial, 45%
metanol ou etanol.
- Solução descolorante - 7,5% ácido acético glacial, 25% etanol ou metanol.
Reagentes usados na extração e corrida da amostra:
-Tampão de amostra 3X - glicerol 30%, SDS 9,2%, azul de bromofenol 1%, β-
mercaptoetanol 20%, 0,25M TRIS-base - pH 6,8.
- Tampão de extração de proteínas - TRIS-base 50mM pH 6,8

Modo de preparo:

Para o gel de separação foram colocados em um béquer 3,044 µL de água,

1,875 mL do tampão de separação 4X (concentração final de 1X), 2,500 mL de bis-
acrilamida 30% (concentração final de 10%), em seguida foram adicionados e
homogeneizados os catalisadores persulfato de amônia 10% e Temed que
rapidamente foram vertidos entre os vidros da cuba eletroforética, também foi
adicionado 500 µL de n-butanol para nivelamento do gel, que foi descartado após a
polimerização do gel de separação
Em seguida foi preparado o gel de empilhamento, contendo 1,778 mL de água,
800 µL do tampão de empilhamento 4X (concentração final de 1X), 560 µL de bis-
acrilamida 30% (concentração final de 5%) e em seguida os catalisadores com 80
µL de persulfato de amônio 10% e 5 µL de Temed, que foram homogeneizados e
adicionados ao sanduíche na cuba eletroforética junto com o pente responsável
pela marcação das canaletas.
A amostra de BSA e o extrato de proteína foram fervidos para garantir total
desnaturação e foram adicionados o tampão de amostra 3X. Assim, as proteínas
foram colocadas nas canaletas, junto com o marcador e a cuba foi completada
com tampão de corrida. Os eletrodos foram conectados em seus respectivos polos
e a corrida foi iniciada com uma duração de uma hora.
Após a corrida o gel foi colocado em placa de Petri com solução corante e
agitação overnight. Em seguida o corante foi retirado e foi adicionada solução
descolorante com agitação overnight, o que permitiu uma melhor visualização das
bandas.

RESULTADOS E DISCUSSÕES:

Resultados:

Figura 1: Gel de Eletroforese de Proteínas

Na figura acima, apresentamos o gel de eletroforese de proteínas com quatro

canaletas diferentes. Aqui estão os resultados observados:

• Canaleta 1 - Marcador de Peso Molecular:

Surpreendentemente, a canaleta que continha o marcador de peso molecular
não mostrou nenhuma banda visível neste gel.

• Canaleta 2 - Amostra 1: BSA Padrão (Purificado):

A amostra BSA padrão purificada apresentou um arraste ao longo do gel.
• Canaleta 3 - Tripsina 1:
A canaleta contendo o extrato de proteína de planta exibiu banda levemente
corada, muito clara e fraca.

• Canaleta 4 - Tripsina 2:
A canaleta contendo o extrato de proteína de planta 2 mostrou duas bandas
grossas e visíveis no início do gel, sendo a banda inferior mais intensa e mais
larga.

Discussões:

A ausência de bandas na canaleta do marcador de peso molecular é uma

preocupação, pois dificulta a estimativa do tamanho molecular das proteínas nas
outras canaletas, ela pode indicar que o marcador pode não ter funcionado
corretamente ou que houve algum problema técnico durante a pipetagem ou a
corrida eletroforética.
O arraste na banda da BSA purificada sugere uma possível degradação ou
contaminação durante o processo de purificação ou também problemas com a
qualidade da amostra. Problemas na fonte também podem explicar o ocorrido,
indicando que as proteínas não se separaram adequadamente.
A presença de uma banda levemente corada na canaleta de extrato de proteína
de planta 1 indica a presença de proteínas, embora em concentrações baixas ou
uma dificuldade na separação das proteínas presentes no extrato.
A presença de duas bandas grossas na canaleta de extrato de proteína de
planta 2 sugere heterogeneidade na amostra e a presença de proteínas de
diferentes tamanhos moleculares, com duas proteínas de alto peso molecular em
maior quantidade. A banda mais intensa e larga sugere que uma proteína de
menor tamanho molecular está presente em maior quantidade.

CONCLUSÃO:

Este experimento de eletroforese SDS-PAGE forneceu informações valiosas

sobre a composição das proteínas presentes nas amostras testadas. No entanto, é
importante destacar que a ausência de bandas na canaleta do marcador de peso
molecular é uma preocupação significativa, pois limita nossa capacidade de
estimar o tamanho molecular das proteínas nas outras canaletas. Isso pode ser
devido a problemas técnicos durante a preparação do gel ou na corrida
eletroforética, e recomenda-se uma revisão cuidadosa dos procedimentos
experimentais para identificar e corrigir qualquer erro potencial.
O arraste observado na banda da BSA purificada sugere possíveis problemas
relacionados à degradação ou contaminação durante o processo de purificação,
além disso erros de pipetagem devem ser considerados.
No que diz respeito a Tripsina, os resultados indicam que ambas as amostras
contêm proteínas. A canaleta 1 revelou uma banda fraca, sugerindo concentrações
relativamente baixas de proteínas ou desafios na separação das proteínas
presentes. Por outro lado, a canaleta com o Tripsina 2 revelou uma
heterogeneidade significativa, com duas bandas de proteínas distintas, sendo uma
delas mais intensa e larga, indicando uma maior concentração de uma proteína de
menor tamanho molecular.
Além disso, deve-se destacar que, devido ao tempo curto de aula, as
proteínas não tiveram o tempo necessário de corrida no gel, por isso a separação
não obteve resultados bons.