PREPARATION OF PROTEIN SAMPLES FOR SDS-POLYACRYLAMIDE GEL

ELECTROPHORESIS: PROCEDURES AND TIPS

Anthony C. Grabski1 And Richard R. Burgess2 —1 Novagen, Inc. And 2 Mcardle Laboratory
For Cancer Research, University Of Wisconsin-Madison, Madison, Wi 53706

Preparação de amostras de proteínas

A preparação das amostras é fundamental para uma resolução clara e precisa das
bandas proteicas. Resultados de qualidade fotográfica são rotineiramente possíveis se as
amostras forem cuidadosamente preparadas. Erros comuns durante a preparação da amostra
incluem a utilização de uma relação proteína-tampão de amostras incorreta, aquecimento
atrasado, sobreaquecimento, falha na remoção de material insolúvel, e sobrecarga e subcarga
de proteína. Para evitar proporções inadequadas de tampão da amostra de proteínas,
sobrecarga e subcarga de amostras, a concentração proteica da amostra deve ser determinada
utilizando um ensaio padrão de proteína como o CB-Protein Assay™, Non-Interfering Proteína
Assay™, ou ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) antes da adição da amostra tampão.

O carregamento de demasiadas proteínas resultará em bandas distorcidas, mal

resolvidas na pista sobrecarregada e padrões eletroforéticos distorcidos nas pistas adjacentes.
A subcarga impede simplesmente a detecção de componentes menores, enquanto que as
bandas maiores serão demasiadamente fracas para a reprodução fotográfica do gel.
Dependendo do tamanho do poço e da espessura do gel, a quantidade de proteína carregada
deve variar entre 0,5 - 4,0 µg para amostras purificadas e entre 40 - 60 µg para amostras
brutas se for utilizada uma mancha azul Coomassie (por exemplo, RAPIDstain™). Os métodos
de coloração com prata (como o Kit FASTsilver™) são aproximadamente 100 vezes mais
sensíveis, e por isso requerem menos proteínas por amostra.

O tratamento com tampão de amostra SDS-PAGE foi concebido para dissociar

completamente todas as proteínas nas suas subunidades polipeptídicas. As proteínas
aquecidas na presença de SDS são desnaturadas e transmitidas com uma forte carga
negativa. Os reagentes de tiol no tampão de amostra reduzem as ligações de dissulfeto. É
importante utilizar um tampão de amostra suficiente para manter um excesso de SDS. A
maioria dos polipeptídios ligam SDS numa razão de massa constante de 1,4 µg SDS por 1,0 µg
de polipeptídio, mas recomenda-se uma razão de 3:1 (15). O tampão de amostra 2x preparado
como mostra a Tabela 1 contém 40 µg/µl de SDS.
 A redução mantida de sulfídricos proteicos é essencial para evitar a formação de
ligação intramolecular de dissulfueto através de cisteinas oxidadas. Se a heterogeneidade da
banda artefatual ou os duplos anormais forem observados nos resultados de SDS-PAGE a
partir de amostras contendo sulfídricos, o agente redutor foi insuficiente durante o tratamento
da amostra ou a oxidação das cisteínas pode ter ocorrido durante a fase de empilhamento da
eletroforese. Estes artefatos podem ser evitados se as amostras forem tratadas com
iodoacetamida (IAA) após o aquecimento na concentração apropriada de tampão da amostra.O
tratamento com IAA bloqueia irreversivelmente as sulfidrinas e destrói o agente redutor em
excesso (16).

O aquecimento tardio das amostras após a adição de tampão de amostra ou o

aquecimento excessivo podem causar artefatos eletroforéticos devido à degradação proteica e
clivagem da ligação peptídeo, respectivamente. Após adição de tampão de amostra SDS, as
amostras devem ser imediatamente misturadas e aquecidas a 85°C durante três minutos. Este
tratamento é geralmente suficiente para reduzir os dissulfetos, solubilizar e dissociar proteínas
sem clivagem da ligação do peptídeo.

A adição de tampão de amostras de SDS começará a desnaturar a maioria das

proteínas. No entanto, sabe-se que as proteases são resistentes apenas à desnaturação da
SDS (15, 17). Amostras parcialmente desnaturadas (particularmente extratos brutos) são,
portanto, extremamente sensíveis à degradação proteolítica à medida que os sítios ativos de
protease dentro dos polipeptídios ficam expostos pelo tratamento da SDS. O aquecimento
imediato limita a degradação ao desnaturar completamente todas as proteínas, incluindo
proteases resistentes através da combinação de calor, SDS, e redutor. Os inibidores da
protease também podem ser utilizados durante a preparação da amostra para limitar a
proteólise. Aquecimento excessivo, por exemplo, 100°C durante períodos prolongados, pode
quebrar ligações peptídeas ou causar agregação selectiva e esfregaço de banda (18). Foi
demonstrado que as ligações Asp-Pro são sensíveis à clivagem térmica.
 Em alguns casos pode ser necessário um aquecimento mais extremo para desnaturar
completamente a proteína (19, 20). Portanto, se for necessário um aquecimento prolongado a
100°C para a dissociação completa de uma proteína termicamente estável, os efeitos de tal
tratamento sobre a clivagem da ligação do peptídeo devem ser considerados (21). Algumas
proteínas, tais como histonas e proteínas de membrana, podem não se dissolver
completamente por aquecimento apenas em tampão de amostra SDS e podem requerer a
adição de 6-8 M de ureia ou um detergente não iónico como o Triton X-100 (22, 23). Após
tratamento térmico em tampão de amostra SDS, o material insolúvel deve ser removido por
breve centrifugação. Isto é facilmente conseguido por uma centrifugação de dois minutos numa
microcentrifugadora a 17.000 × g. A não remoção do material insolúvel precipitado da amostra
provocará estrias no interior do gel. O sobrenadante da amostra tratada está agora pronto a ser
carregado. A amostra pode ser armazenada a 4°C durante a noite ou congelada a -20°C por
períodos mais longos. Amostras quentes armazenadas brevemente a 37°C para redissolver o
SDS e a recém-combustão para remover o material insolúvel antes do carregamento.