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Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

Mecanismo de polimerizao Gis de Poliacrilamida so formados pela co-polimerizao de acrilamida e bisacrilamida (NN-methylene-bis-acrylamide). A reao iniciada atravs de um sistema de gerao de um radical livre. A polimerizao iniciada pelo TEMED (tetramethylethylenediamine) e persulfato de amnio. O TEMED acelera a velocidade de formao de radicais livres do persulfato e este cataliza a polimerizao. Radicais livres do persulfato convertem os monmeros de acrilamida a radicais livres os quais reagem com monmeros inativos em crescimento iniciando a reao de polimerizao em cadeia. As cadeias do polmero so ligadas ao acaso pela bis-acrilamida, resultando em laos fechados e uma complexa rede de polmero com porosidade caracterstica, a qual depende da condio de polimerizao e concentrao de monmero.

Determinao de peso molecular A determinao do peso molecular de protenas por SDS-PAGE um procedimento amplamente empregado. A mobilidade da protena em gel de SDS_PAGE est relacionada com seu peso molecular. A curva padro construda com protenas de peso molecular conhecido plotando-se os logaritmos de seu peso molecular versus a mobilidade relativa da protena. A mobilidade relativa da protena de peso molecular desconhecido ento ajustada na curva para determinar seu peso molecular.

A figura 1 mostra uma curva tpica plotando log de peso molecular versus mobilidade relativa para um grupo de padres de protenas de SDSPAGE. O valor do intercepto y marcado 115.000, anlise determinada por regresso linear. A excluso limite aproximada do gel de 115.000 daltons. O valor do intercepto y deve ser considerado aproximado porque depende da molibidade relativa dos padres de protenas usados.

Figura1 Determinao em gel de excluso. Padres de protenas corridos sobre um gel de poliacrilamida a 12% (12% T*, 2.6%C**,

sistema tampo de Laemmli). As propriedades das protenas foram determinadas em relao ao azul de bromofernol.

Embora o valor do intercepto y possa ser diferente para toda porcentagem do gel, e um pouco diferente para todos padres ajustados, o valor deveria ser altamente reproduzvel de gel para gel se a mesma porcentagem de gel e os mesmos padres forem usados. Deste modo, monitorando o intercepto y e o log do peso molecular/mobilidade relativa uma excelente avaliao de reprodutividade e tcnica de polimerizao.

PROCEDIMENTO:

1. Preparao das Amostras de msculo do peixe:


Adicionar 250uL de tampo Laemmli em cada microtubo rotulado com o nome dos respectivos pescados. Cortar com tesoura um pedao de cada msculo do pescado com cerca de 0,25 x 0,25 x 0,25 cm3 Colocar o msculo no microtubo com o tampo Laemmli, agitando por 15 vezes intensamente. Incubar p 5 minutos a temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente o tampo homogeneizado de msculo com ajuda de pipeta pauster para outro microtubo com rosca e rotulado. Colocar os microtubos dos pescados para incubar durante 5 minutos a 95C.

2. Preparao do GEL DE SEPARAO 0.375M Tris, pH 8,8

OBS: (Preparao para 2 mini gis)

gua deionizada 1.5M Tris-HCl, pH 8.8 SDS 10% - estoque Acrilamida/Bis (estoque 30%) Persulfato de amnio 10% TEMED *Para protenas tratadas com aproximadamente 10-100Kd.

12%* 3.35 ml 2.5 ml 100 l 4.0 ml 50 l 5 l SDS de peso molecular de

3. Preparao do GEL DE EMPILHAMENTO 0.125M Tris, pH 6.8

OBS: (Preparao para 2 mini gis) 4% 3,04 mL 1,25 mL 50 L 664 L 25 L 5 L

gua deionizada 0.5M Tris-HCl, pH 6.8 SDS 10% - estoque Acrilamida/Bis (estoque 30%) Persulfato de amnio 10% TEMED

4. Procedimento: 4.1 Aps preparar o gel segundo o item 2, transfira o gel rapidamente para a placa de corrida, com o auxlio de uma pipeta. Aguarde alguns instantes e vede com lcool Butanol 80%; 4.2. Aguarde a solidificao e retire o lcool Butanol 80%; com um papel de filtro; 4.3. Com uma pipeta adicione o gel (item 3) at o final da placa e introduza o "pente"; 4.4. Aguarde 45 minutos para solidificao; 4.5. Retire o "pente para aplicao da amostras.

5. Aplicao das amostras e corrida eletrofortica Em cada cavidade formada pelo pente, no gel, aplicado 5 uL da amostra de pescado e o padro de peso molecular conhecido 5 uL. Imediatamente realizada a corrida no aparelho eletrofortico mantendo-se a voltagem constante (200V por 45 minutos) . As corridas eletroforticas so realizadas a temperatura ambiente. 6. Colorao dos gis Os gis, aps a corrida eletrofortica so retirados das placas e imersos imediatamente na soluo corante.

Soluo Corante: Coomassie blue R-250 0,1% em soluo contendo metanol 40% e cido actico 10%. Soluo Descorante: Soluo contendo metanol 40% e cido actico 10%.