 Separação por tamanho/peso molecular: pequenas correm mais, por isso ficam mais

embaixo; grandes ficam em cima;

 Uma banda: indica pureza e qualidade; mais bandas podem indicar que a proteína foi clivada
por proteases ou existem outras moléculas além da sua proteína;
 O movimento das proteínas no gel ocorre devido ao movimento através de campo elétrico
em função de cargas ou razão carga/massa; CORRE DO NEGATIVO PRO POSITIVO;
 O gel é polimeralizado entre as placas de vidro; em geral tem 1mm de espessura;

A forma como a concentração de poliacrilamida influencia na velocidade do gel devido a

porosidade – pouca acrilamida gera poros menores, o que facilita passagem de proteínas menores
enquanto dificulta a das menores

 Ingredientes do gel de poliacrilamida: TRIS (tris (hidroximetil)aminometano)  agente

tamponante; acrilamida e bisacrilamida polimerizam o gel, dão densidade e porosidade;
TEMED  acelera formação de persulfatos de amônio; persulfato de amônio;
 ORDEM: água, acrilamida e bis, persulfato e TEMED. Persulfato atua sobre monômeros de acr
e bis gerando a malha/polimerização do gel;
 Cadeias de acrilamida são interligadas através de bis;
 O gel é tridimensional;
 Quanto mais acr e bis, mais densa a malha do gel  mais difícil as proteínas migrarem; poros
menores; ex.: 29:1 acrilamida:bis; ex.: correr proteína pequena  utilizar acr:bis 15% p ter
malha mais densa; ex.: prot maior  acr:bis 8-10%;

*Componentes do tampão e suas funções

 Proteína + solução de tampão de amostra; SDS PAGE  LAEMMLI BUFFER 2X: 125Mm Tris pH
^6,8; 4% SDS, 20% glicerol, 10% 2-mercaptoetanol, 0,004% azul de bromofenol;
 TRIS  tampão que confere carga certa às proteínas;
 SDS  desnatura e confere razão carga/massa constante;
 Glicerol  aumenta densidade da amostra; é mais denso que a água e permite que a
amostra entre no poço facilmente;
 Mercaptoetanol  agente redutor que quebra ligações dissulfeto S-S das proteínas;
 Azul de bromofenol  corante que permite ver se o gel está correndo; ele vai na frente;

TAMPÕES UTILIZADOS NO SDS-PAGE E IMPORTÂNCIA

 No tampão há glicina; o pH dos tampões alteram sua mobilidade  mais ácido

(empilhamento), forma zwitterion com carga 0 e baixa mobilidade; mais básico (corrida),
glicina negativamente carregada e com alta mobilidade;
 Também há íons Cl- (cloro)  Cl- correm mais rápido; glicina mais devagar e proteína
também; no de empilhamento, proteína fica entre glicina e Cl-; com a mudança de pH ,
glicina muda para carga negativa e glicina acelera  forma faixa estreita das proteínas e
correm adequadamente; erros nisso geram bandas borradas e não estreitas;
 GEL DE EMPILHAMENTO  tris HCl pH 6,8; favorece que proteínas iniciem todas do mesmo
lugar; malha mais frouxa;
 GEL DE CORRIDA/RESOLUÇÃO/SEPARADOR  tris-glicina pH 8,3

*Importância de ferver a amostra depois de prepará-la.

 Garante que proteína esteja na forma desnaturada

*Diferença entre SDS-Page (desnaturante) e Gel Page (não desnaturante/sem SDS)

GEL NATIVO PAGE  PROTEÍNA ENOVELADA

 Ausência de SDS ou outros desnaturantes; teoricamente, proteína está enovelada 

mobilidade/migração no gel depende de carga (ponto isoelétrico) no pH do tampão da
corrida e tamanho (raio hidrodinâmico) para atravessar poros da malha; carga pode variar em
função do tampão;

GEL SDS-PAGE  PROTEÍNA DESENOVELADA; gel desnaturante

 Utilização de dodecil sulfato de sódio (detergente barato); desnatura proteínas e CONFERE

CARGA NEGATIVA; sds interage com cadeias laterais das proteínas gerando característica de
formato alongado; quantidade de SDS ligado a proteína é proporcional ao tamanho dela;
razão carga/massa se mantém;
 2 géis são preparados: de empilhamento e de corrida/separação

*Quais tipos de amostra podem correr? Amostras com lipídeos e carboidratos podem correr desde
que estes componentes estejam em baixa concentração. Proteínas não precisam necessariamente
estar puras, porém contaminações nela devem ser poucas.

*Métodos de corar – fixar, corar e descorar o gel

 Após corrida, ocorre fixação do gel p/ proteína precipitar e parar de correr;

 Corar: Coomassie Brilliant Blue R/G-250 (ela também fixa) + etanol, h2o e ácido acético; gel
fica azul;
 Descorar: ácido acético 20% retira excesso de corante; bandas ficam azuis pq corante se liga
às proteínas;
  COLORAÇÃO ALTERNATIVA: coloração com PRATA  10 a 1000x mais sensível que
Coomassie; mais trabalhoso, mas cora bandas menores;

*Por que a banda fica borrada às vezes:

-Tampão do gel pode estar errado

-Há muita proteína ou partes sólidas na proteína.

*OUTRO TIPO DE GEL: 2D (bidimensional)  focalização isoelétrica (separação por ponto

isoelétrico  horizontal) e por massa (seta p baixo; vertical);

*GEL DE AGAROSE (DNA)

 Polímero de polissacarídeo + água  esquenta e bota na forma; “dissolva a agarose em

tampão, esquente e coloque na forma”; concentração maior é menos quebradiço; corado
usualmente com BROMETO DE ETÍDIO; gel corre deitado; CORRE DO NEGATIVO PRO
POSITIVO TAMBÉM; DNA tratado com enzimas de restrição -- > cliva DNA; brometo se liga ao
DNA e fluoresce em luz ultravioleta;

PCR (reação em cadeia de polimerase)

 Amplificação seletiva de uma seq/região específica de DNA; amplificação exponencial (n° de

cópias geradas);
 REAGENTES NECESSÁRIOS: fita/DNA molde, h2o, tampão, iniciadores (primers); nucleotídeos
(dNTPs  dATP, dTTP, dCTP, dGTP)  solução estoque de 10 mM, em concentrações iguais,
concentração final entre 20-200 microM, altas conc afetam especificidade dos iniciadores;
cofator enzimático Mg++ (MgCl2) essencial p/ atv da taq  quantidade pode variar (0,5-3
microM) – mt pouco taq não trabalha, e mt ela perde a sensibilidade; enzima DNA Pol (Taq);
 REAGENTES – TAQ: termoestável; isolada de Thermus aquaticus; incorporação de
nucleotídeos na terminação 3’OH; 72°C; taxa de erro: 1 em 10^4 bases; fornecidas com
solução tampão específica  Tris – HCl (pH 8,4) e KCl – facilitam anelamento; outras enzimas;
 REAGENTES – PRIMERS: desenho primers; tamanho de 15-30 nucleotídeos; conteúdo de GC
45-55%; primer dimer: n ter mais de 3 bases complementares (primers tem bases
complementares que acabam se juntando); terminar em G ou C; Tm;
 ETAPAS DA PCR: DESNATURAÇÃO DO DNA, HIBRIDAÇÃO DOS INICIADORES/ANELAMENTO
DOS PRIMERS e EXTENSÃO.
 ETAPA 1 – DESNATURAÇÃO/MELTING: separação da dupla fita de DNA em fitas simples; 92-
98°C; quebra pontes de H;
 ETAPA 2 – HIBRIDAÇÃO OU ANELAMENTO DOS PRIMERS: ligação do iniciador/primers à fita
molde a regiões específicas; temperatura de anelamento (37-65°C); alta especificidade; 3’-5’
fita molde e 5’-3’ fita amplificada;
 ETAPA 3 – EXTENSÃO: atuação da polimerase (72°C temp ótima da enzima); incorpora
nucleotídeos nas novas fitas; 30s-1min/kb; tempo proporcional ao tamanho do amplicon
(fragmento amplificado); N° DE CÓPIAS = 2^n, n = n° de ciclos; 25 – 30 ciclos;
 ETAPA 4 – DETECÇÃO: termociclador e eletroforese em gel de agarose; visualização com luz
UV
 SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS DA PCR: fonte do DNA – tecidos em parafina e fixadores; reagentes
– detergentes iônicos, proteinase K, fenol, sais;
 LIMITES: necessário conhecer a seq de DNA a amplificar; padronização; precisa de controles;
realização em espaço específico; contaminação da amostra; brometo de etídio; extensão
limitada da seq a amplificar; taxa de erro; n automatizado; n quantitativa;
 TIPOS DE PCR: multiplex (mais de um fragmento é amplificado numa única reação, cada um
com seu par de primers específico. Vários pares de primers na mesma reação); RFLP (análise
de polimorfismos de sequências específicas, tratamento com enzimas de restrição);
COMPETITIVA (adicionado outro segmento de DNA, de sequência, tamanho e concentração
conhecidos; deve conter sequências para os mesmos primers; carga viral (HPV));
TOUCHDOWN (modificação da temp de anelamento da PCR convencional); RT-PCR (reverse
transcriptase chain reaction)  RNA é convertido em cDNA;

PCR EM TEMPO REAL, QUANTITATIVO E SEQUENCIAMENTO DE DNA

 Não há eletroforese ao final da qPCR; o fragmento não é utilizado posteriormente; detecção

do produto é imediata após cada ciclo e é quantitativa;
 Aplicações: diagnósticos, genotipagem, análise da expressão gênica (RT-qPCR), quantificação
de numero de cópias de genes, análise do n° de cópias de uma construção heteróloga
(plasmídeos ou integração genômica);
 Detecção: corante fluorescente (fita dupla de DNA – SYBR green); sondas Taqman (seqs
específicas  reporter dye e quencher dye);
 Resultados:


 SEQUÊNCIAMENTO: métodos baseados em síntese de DNA (Sanger, pirosequenciamento,
pacbio, ilumina, ion torrent); baseados em ligação (SOLiD); baseados em poros proteicos e
condutividade elétrica (nanopore);
 SANGER: síntese de uma nova fita de DNA a partir de primer, polimerase e dNTPs; ddNTP
interrompe a síntese  nucleotídeo com OH faltante; separação dos fragmentos sintetizados
por tamanho; gel de eletroforese; marcação por fluorescência (4 marcações coloridas, 1
reação); leitura automatizada, 700pb/reação;
 PIROSEQUENCIAMENTO: 1 nucleotídeo por vez; se for complementar, pirofosfato é liberado
 *****Ct value = quanto menor, maior a quantidade de ácido nucleico na amostra; Alto
valor indica que há pouco material para amplificação!!!!
 *****Tm (temperatura de melting) = temperatura em que as moléculas de DNA estão na
transição entre a forma nativa e desnaturada;