Aula de

Termodinâmica de Sistemas Biomoleculares

Tema:
Eletroforese

Prof. Dr. Júlio César Borges
Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br
Eletroforese
 Movimento de partículas carregadas num campo elétrico externo.
- Técnica que se baseia no uso das cargas elétricas das biomoléculas (DNA, RNA e
Proteínas) para separar e analisar as suas propriedades físico-químicas.
 Alta resolução de separação – depende do meio e da partícula

Introdução
 Uma partícula de carga Z em um campo elétrico E experimenta a força F


 A partícula carregada no campo elétrico sofre a ação contrária da fricção (f = coeficiente
friccional), que é proporcional à velocidade v da partícula no meio.
 No estado-estacionário  movimento constante

Logo 
ZE F =
f
ZE
v vf ZE = =
vf ZE F ÷ = = 0
Eletroforese
 A Mobilidade Eletroforética de partículas carregadas num campo elétrico externo e
constante, definido como μ, é a velocidade da molécula por unidade de campo elétrico.



- Princípio teórico de todos os métodos eletroforéticos
 μ é proporcional à razão z/f
z  depende da relação pI da molécula versus pH da solução
f = coeficiente friccional  depende das condições experimentais




 Portanto, a migração de uma partícula num campo elétrico é dependente:
da carga Z e coeficiente f , portanto depende também da Massa molecular M

/V.sec) (cm
2
f
Z
E
v
= = µ
q t q t
H
R r f 6 6 = =
H A
πηR N
RT
f
kT
D
6
= =
3 / 1
4
3
|
|
.
|

\
|
=
A
bar
sph
N
V M
R
t
f
ZE
v =
Eletroforese de Proteínas
 Fase estacionária – Gel de poliacrilamida
- Forma polímero com uma rede entrelaçada ou entrecruzada
- Formado pela reação radicalar entra Acrilamida-Metilenobisacrilamida
- Necessita de Persulfato de amônio e TEMED
Eletroforese de Proteínas
 Gel de poliacrilamida  Montado entre duas placas de vidro
- Solução estoque de Acrilamida/Bisacrilamida 30%/2,7%
Acrilamida é tóxico para o Sistema Nervoso Central e Cancerígeno
- Gel de corrida  fase de separação das proteínas
- Gel de concentração  fase de aplicação das amostras  “pente”
Qualidade do Gel depende
- Qualidade da Acrilamida/Bisacrilamida
(Pureza);
- Água deionizada (sem metais pesados);
- Armazenamento da solução em vidro Âmbar
(evitar reação Fotoradicalar);
- Deaeração;
- Tempo de armazenamento do gel;
- Temperatura;
- Etc.
Eletroforese de Proteínas
 Em condições não-desnaturantes, a separação depende da Z da proteína
 Dependendo da relação do pI versus pH, a Z proteína pode ser + ou –
- pI  pH no qual o somatório das cargas é igual a 0
- Funciona para DNA/RNA  Z total negativo independente do pH
 Proteína + migra para o pólo –  Proteína – migra para o pólo +
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
pH
No net
charge
Increasing
cationic
Increasing
anionic
Net positive charge
Net negative charge
+ –
Eletroforese de Proteínas
 Importância do gel de empacotamento
- Evitar a difusão das amostras de proteínas
 Concentração de Acrilamida/Bisacrilamida
- Gel de Empacotamento  5% em Tris-HCl pH 6,8 (mais poroso)
- Gel de separação  8-15% em Tris-HCl pH 8,8
Alta concentração de íons cloreto
Tampão de Corrida  Tris-Glicina (sistema tampão descontínuo)
 Os íons cloreto tem maior mobilidade do que a Glicina no pH 8.5
- Formação de uma banda tênue na zona de transição entre os géis de # [acrilamida]
Eletroforese de Proteínas
Eletroforese de Proteínas
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida na presença de SDS
SDS-PAGE – Sodium dodecyl sulfate poliacrylamide gel electrophoresis
 Interação da proteína com SDS deixa a proteína com Z total Negativa
SDS
 Molécula anfipática
 Desnatura a proteína na formação de complexo
SDS:Proteína
 1,4g SDS/1g de proteína
 Z total negativa será proporcional ao tamanho da
proteína
 Rateio Z/M será aproximadamente constante (ou f)
para proteínas de M diferentes
- Densidade de carga Z constante
 SDS interage mais com a parte hidrofóbica da
proteína
SDS-PAGE
 Permite separação baseada na filtração molecular da proteína na peneira formada pelo
polímero entrecruzado de Acrilamida-Bisacrilamida
SDS-PAGE
 Permite análise direta da M em função do mobilidade eletroforética (RF)
SDS normaliza efeitos devido ao formato da partícula, pois desnatura a proteína
 Curva padrão deve ser corrida nas mesmas condições experimentais
- mesmo gel preferencialmente
SDS-PAGE
- Log da M versus RF
b RF a M + ÷ = ) ( log
b x a y + ÷ = ) (
b RF a
e M
+ ÷
=
) (

SDS-PAGE
 Padrões de M
 Porosidade do gel depende da concentração de acrilamida-bisacrilamida

Gradient gel maker
SDS-PAGE
Interferências na determinação da M

 Resistência à desnaturação química e térmica
-Efeitos da forma da partícula  Menor interação com SDS
- Menor densidade de carga Z  Reduz “força Motriz”
- Migração anormal  aumenta M
App

 Degradação devido à desnaturação térmica (principalmente)
 Necessidade de agentes redutores
 Presença de glicosídeos
 Presença de grupos PO
4
3-
 Proteína muito carregada negativamente (pI ácido)
- Reduz o número de moléculas de SDS por proteína  repulsão entre cargas –
- Menor densidade de carga Z  Reduz “força Motriz”
- Migração anormal  aumenta M
App
 Proteína muito carregada positivamente (pI básico)
- Grupos positivos agem como fator de resistência  Reduz “força Motriz”
- Migração anormal  aumenta M
App
Sistemas de SDS-PAGE
- BioRad
Eletroforese
Métodos de detecção/visualização

 Colorimétricos
 Coloração com Comassie Brilliant Blue RG-250
- Limite de detecção  ~0,1-1,0 μg de proteína
 Impregnação por Prata (2000 x mais sensível)
- Limite de detecção  ~10-100 ng de proteína

Comassie Brilliant Blue
Impregnação por Prata
Eletroforese
Métodos de detecção/visualização
 Radiométricos
- Proteínas ou DNA/RNA marcadas com radioisótopos
- Uso de sondas de DNA/RNA marcadas com radioisótopos
 Requer:
1) Transferência da amostra do gel
2) Imobilização das moléculas numa membrana
de nitro-celulose
3) Incubação com a Sonda
4) Exposição ao filme fotográfico
 Southern Blot - DNA
 Northern Blot - RNA
 Western Blot - Proteínas
Eletroforese
Métodos de detecção/visualização
 Imunológicos
- Detecção intermediada por um anticorpo ou outra sonda específica
- Detecção do anticorpo que interagiu especificamente com a proteína de interesse
- Anticorpos marcados com radioisótopos ou um fluoróforo/cromóforo
 Métodos Imunológicos requerem transferência do gel de poliacrilamida
Eletroforese
Métodos de detecção/visualização
 Fluorescência
- Necessita de um fluoróforo ligado à molécula
Proteína:
corante cianina
DNA:
Brometo de Etídio
- Intercalação na dupla hélice
Eletroforese
Métodos de detecção/visualização
 Fluorescência – Necessita de um fluoróforo ligado à molécula
 Seqüenciamento de DNA – método de dideóxi-ribonucleotídeos
 Fluoriceínas ligadas aos diferentes ddNTP
Eletroforese
Seqüenciamento de DNA – método de dideóxi-ribonucleotídeos
 Fluoriceínas específicas ligadas aos diferentes ddNTP que emitem luz em λ diferentes
Eletroforese
Métodos de detecção/visualização

 Quantificação
A quantidade de uma determinada banda em uma eletroforese pode ser estimada
- Análise das bandas por densitometria
 Uso de padrões quantitativos
- Curva padrão
Área sob a curva densitométrica é proporcional à quantidade

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