Bioinformática - NP3

01. Quais são os principais parâmetros que devem ser observados durante o desenho de um
primer?
Regras gerais para o desenho de um primer:
1. deve ter de 17-28 bases de comprimento
2. composição básica deve ser de 50 a 60% (G+C)
3. região terminal 3’, deve ser um G ou C, ou CG ou GC (isso evita a “respiração” das
extremidades e aumenta a eficiência do anelamento)
4. Tms entre 55-80ºC são preferidos (ótimo perto de 60ºC)
5. as extremidades 3’ dos iniciadores não devem ser complementares, pois de outro
modo os dímeros de iniciadores serão sintetizados e formarão outro produto
6. auto-complementaridade dos primer deve ser evitadas
7. as execuções de três ou mais Cs ou Gs nas extremidades 3’ dos iniciadores podem
promover o anelamento errôneo em sequências ricas em G ou C

02. O que é especificidade do primer quais as características que podem levar um primer a ser
menos ou mais específico?
Temperatura de melting: onde 50% das fitas são desnaturadas, importante para encontrar a
temperatura de anelamento.
Especificidade do primer: é a ligação apenas à sequência alvo, relacionado com o tamanho
do primer. Quanto maior o tamanho do primer, maior a possibilidade de ser específico e
quanto menor tem mais chances de semelhança com sequências diferentes.

03. Quais fatores influenciam na temperatura de anelamento primer?

- tamanho do primer
- sequência do primer
- concentração de sais
- concentração do primer
- presença de desnaturantes

04. O que é hairpin e dímero de primer? Como o dímero é observado em uma corrida
eletroforética ou curva de melting?
- Hairpin (primer auto complementar): quando parte de um primer é complementar a
outra parte de si mesmo, o primer pode dobrar-se ao meio e formar uma estrutura
denominada de hairpin, que é estabilizada pelo emparelhamento de bases
complementares. A estrutura é um problema para a PCR porque o primer está
interagindo consigo mesmo e não está disponível para a reação desejada.
- Dímeros de Primers: semelhante a estrutura em grampo, se não for cuidadosamente
projetado, uma molécula de primer pode hibridizar com outra molécula de primer e
atuar como modelo para o outro, resultando em dímeros de primers. A formação do
dímero de primers causa os mesmos problemas à reação de PCR que a estrutura de
hairpin. Pode também atuar como um concorrente para amplificação do DNA alvo.
- Por conta que o dímero vai se amplificar, ele vai descer até a região inferior a 100pb
do gel na corrida eletroforética, onde é visualizado como “mancha de moderada
intensidade”.
05. Como é a construção de um primer degenerado? Dê exemplo de situações nas quais podemos
utilizá-los.
- uma sequência de iniciadores de PCR é chamada degenerada se algumas das suas
posições tiverem várias bases possíveis - ex: no primer GG{C,G}A{C,G,T}A, a
terceira posição é o C ou G, e a quinta é C,G ou T
- a degeneração do primer é o número de combinações de sequências que ele contém
- apresentam diversidade de nucleotídeos em vários pontos da sequência
- utilizado para amplificar genes de uma mesma família ou genes homólogos

06. A imagem abaixo representa uma eletroforese em gel de agarose realizada após amplificação
de DNA de amostras através da PCR. O teste teve que ser refeito utilizando novos primers.
Explique por que o resultado abaixo não está adequado.

Pois nas amostras 2,3 e 4 observa-se a formação de mais de

um produto, o que é indicador de ligação do primer em mais
de um local, ou seja, primer inespecífico. Devido a formação
de dímeros visualizados na região abaixo de 100pb.

07. Quais as diferenças entre a PCR convencional e a qPCR?

PCR convencional: utiliza-se gel de agarose para corrida eletroforética
qPCR: é mais rápido pelo uso de Fluoróforo durante o processo.

08. O RT-PCR quantitativo (tempo real), ou RT-qPCR, permite a quantificação (absoluta ou

relativa) dos níveis de expressão de genes isolados de uma amostra. Em relação ao qPCR,
explique o que significa:
a) Sonda de hidrólise (dê exemplo): sondas específicas para o segmento gênico cuja
expressão se deseja estudar, apresentam uma substância (fluoróforo na posição 5' da
sonda) capaz de absorver a energia luminosa emitida pelo equipamento e dissipá-la na
forma de luz e calor, em comprimento de onda diferente do original. Essas sondas não
permitem a análise da curva de melting, porque a hidrólise da sonda impede sua
reutilização. Um exemplo é a sonda Taqman.
b) Intercalante (dê exemplo): SYBR green, usado em coloração de DNA para análise
por eletroforese de produtos de PCR, ou como um meio de visualização direta dos
produtos de PCR em tempo real.
c) Controle interno: usado para comparar os resultados
d) Ciclo do limiar de detecção (Ct): ciclo no qual a fluorescência ultrapassa o limiar de
detecção. Este ciclo é utilizado para a quantificação relativa da expressão gênica.
09. Atualmente, a RT-qPCR é a principal técnica utilizada no diagnóstico de vírus de RNA.
Explique a importância dessa técnica nesse tipo de diagnóstico.
O método de PCR em tempo real teve grande importância no diagnóstico de SAR/COV2
, agente etiológico da COVID19, sendo estabelecido como padrão-ouro de diagnóstico
devido a rapidez na expressão dos resultados e alta especificidade e sensibilidade.

10. O que é curva de melting? Para que finalidade ela é realizada após o término dos ciclos de
amplificação?
Curva de melting: sua análise é necessária para detectar problemas de ligação não específicas
do SYBR Green ao DNA. A comparação das curvas de melting permite uma interpretação dos
produtos amplificados em PCR. A comparação das curvas de melting permite uma
interpretação dos produtos amplificados em PCR. Diferentes produtos têm temperaturas
diferentes porque a temperatura de melting depende do tamanho do amplicon, do conteúdo de
GC e das estruturas secundárias e terciárias.

11. Ao realizar uma análise de curva de melting de diferentes amostras contendo um vírus, o
seguinte resultado foi obtido:
Levando em consideração que as amostras
apresentavam a mesma espécie viral. Explique o
resultado obtido.

Pela curva podemos constatar que há sequências

inespecíficas que foram ampliadas, demonstradas pelo
segundo pico. Isso significa que há mais de um tipo de
DNA sendo amplificado.

12. Observe as alterações nas sequências proteicas abaixo. Explique qual o tipo de mutação que
aconteceu na sequência do DNA que codifica essas proteínas.
a) Ala-Gln-Cys-Asp-Leu → Ala-Gln - mutação sem sentido (nonsense): ocorre quando
troca de uma base de DNA altera o códon de um aminoácido para um códon de
parada, fazendo com que a tradução para antes da proteína está completa.
b) Ala-Gln-Cys-Asp-Leu → Ala-Gln-Cys-His-Leu - mutação missense: troca de uma
única base de DNA que resulta na troca de um aminoácido na proteína.
c) Ala-Gln-Cys-Asp-Leu → Ala-Gln-Cys-His-Lys - mutação de troca de fase de
leitura (frameshift): resulta na adição ou remoção de uma base de DNA que altera a
sequência do DNA e a sequência de aminoácidos correspondentes.
d) Ala-Gln-Cys-Asp-Leu → Ala-Gln-Cys-Asp-Leu - mutação silenciosa: quando há a
troca de base no DNA mas o aminoácido codificado continua o mesmo.

13. O que é perda de heterozigosidade e como essa alteração está relacionada com o
desenvolvimento de câncer?
A perda de heterozigosidade decorre do silenciamento de um dos alelos daquele gene,
causado pela perda de um dos genes em um cromossomo. A perda da heterozigosidade é
comum no câncer, indicando a ausência de um gene supressor de tumor funcional na região
perdida.
14. Quais os tipos de dados epigenéticos podemos analisar em células cancerígenas e quais
técnicas podem ser empregadas para essa análise?
Os dados epigenéticos são utilizados para examinar padrões de marcas epigenéticas no DNA
(metilação) e nas histonas (modificação). Dentre as técnicas temos: Enriquecimento de DNA
metilado; Sequenciamento por bissulfito; Imunoprecipitação de cromatina seguido por
sequenciamento

15. O que é modificação em caldas de histonas e como isso influencia na expressão gênica? Quais
técnicas podem ser usadas em sua análise?
As histonas sofrem modificações para permitir (ou não) a transcrição dos genes. A acetilação
das histona (adição de um radical acetil em resíduos de lisina) é feita pela por enzimas
chamadas Histonas Acetiltransferase (HATs- descompactação da cromatina, permitindo a
expressão do gene naquela região), a metilação das histonas é feita pela enzima Histona
Metiltransferase (HMTs - pode tanto silenciar quanto ativar genes, dependendo de qual
resíduo de aminoácido esteja ocorrendo a modificação). Essas modificações regulam os
principais processos celulares, como transcrição, replicação e reparo. Uma das técnicas
utilizadas é a Imunoprecipitação de cromatina seguido por sequenciamento.

16. Como a metilação de DNA em ilhas CpG estão relacionadas com a formação de tumor?
A metilação de DNA ocorre principalmente pela modificação covalente de resíduos de
citosina em que dinucleotídeos CpG - esses dinucleotídeos CpG não estão distribuídos
uniformemente através do genoma humano, mas estão concentrados em pequenos trechos de
DNA ricos em CpG chamados “ilhas CpG” (regiões de grandes sequências repetitivas).
Alguns promotores de ilhas CpG tornam-se metilados durante o desenvolvimento, o que
resulta em silenciamento transcricional a longo prazo. A inativação do cromossomo X e os
genes impressos são exemplos clássicos dessa metilação de ilhas CpG de ocorrência natural
durante o desenvolvimento. A metilação do DNA pode levar ao silenciamento de genes
prevenindo ou promovendo o recrutamento de proteínas reguladoras para o DNA.

17. Explique o que é modelagem in silico de proteínas, descrevendo os principais métodos de

modelagem existentes.
A previsão da estrutura computacional de proteínas fornece estruturas tridimensionais de
proteínas que são previstas por técnicas in silico. Essa modelagem de proteínas baseia-se em
princípios de estruturas de proteínas conhecidas obtidas por meio de cristalografia de raios X,
ressonância nuclear magnética, bem como de funções de energia física. Os principais métodos
de modelagem computacional de proteínas são a modelagem por homologia, o
reconhecimento de dobras e a modelagem ab initio.
- método de modelagem de novo ou ab initio: tentam predizer a estrutura da proteína a
partir somente da sequência, quando uma estrutura similar não é disponível.
- método de reconhecimento de encadeamento/dobras: pode-se prever as estruturas de
proteínas de sua proteína alvo usando dobras de proteínas conhecidas de proteínas
similares encontradas em diferentes bancos de dados.
- modelagem por homologia (ou modelagem comparativa): só é utilizada quando se
tem uma sequência proteica estruturalmente desconhecida e uma proteína semelhante
estruturalmente conhecida.
18. O que é modelagem ab initio ou modelagem de novo?
É uma método que tenta predizer a estrutura da proteína a partir somente da sequência,
quando uma estrutura similar não é disponível. As estruturas de proteínas são construídas a
partir do zero, calculando as conformações de energia mais favoráveis e baseia-se em
princípios físicos e coevolução observada em várias proteínas diferentes.

19. O que podemos avaliar em uma proteína 3D para considerá-la um bom template na
modelagem comparativa?
Os seguintes parâmetros devem ser seguidos:
1. Escolha da sequência alvo (a sequência de proteína que você quer modelar);
2. Busca por proteínas templates (proteína alvo é alinhada com todas as sequências de
proteínas de estruturas conhecidas que estão presentes nos bancos de dados);
3. O uso de um algoritmo de alinhamento apropriado, requisito para o modelo correto da
proteína. O alinhamento compara as proteínas e apresenta as áreas idênticas nas
proteínas;
4. Previsão de estrutura secundária;
5. Com uma proteína modelo, pode-se agora construir um modelo da proteína alvo.
Esses modelos, após construção, serão analisados e sua estrutura 3-D verificada;
6. Ferramentas de validação de modelo de proteína e servidores de verificação.

20. O que é a docagem molecular?

Análise da proteína quanto sua interação com outras proteínas ou com a proteína e pequenas
moléculas. A docagem molecular tradicional vai visar observar a interação entre uma proteína
e uma molécula menor.

21. Explique por que temos que utilizar a grid box para delimitar a área onde haverá a ligação
entre ligante (droga) e alvo (proteína).
A grid box vai delimitar o local em que haverá o docking, que deve ser em um Bolso
fundo e bem definido, muitas interações entre cargas e ligações de hidrogênio e cadeias
laterais bem ordenadas.

22. Para um resultado de docagem ser considerado bom, quais as características devemos
observar?
Bolso fundo e bem definido, muitas interações entre cargas e ligações de hidrogênio e
cadeias laterais bem ordenadas.

23. Na frase “havendo modificações no resíduo do sítio ativo de uma determinada proteína, a
ligação de fármacos a essa proteína pode sofrer modificação” pode ser considerada uma
afirmativa correta? Justifique.

24. A imagem a seguir mostra o resultado de uma docagem. Descreva quais ligações
intermoleculares ocorreram entre ligante e receptor, apontando os resíduos e suas cargas.