Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
PCR
PCR
PCR
PCR
Uniqueness
- Deve existir somente um stio de pareamento no DNA molde onde ocorra a ligao do primer, o que significa que a seqncia dos primers nica na seqncia do DNA molde. - No devem existir stios de anelamento em possveis fontes de contaminao, tais como o ser humano, rato, cobaia, etc. (busca BLAST no genoma correspondente). Template DNA
5...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3 A TGCT AGTTG CAGTCAACTGCTAC TGCTAAGTTG
5-TGCTAAGTTG-3 5-CAGTCAACTGCTAC-3
Comprimento
- O comprimento do primer influencia a uniqueness e as temperaturas de melting e anelamento. - Quanto maior o comprimento do primer, maior a possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que maiores sero as temperaturas de melting e anelamento. - De uma forma geral, o comprimento do primer no deve ser inferior a 15 bases para assegurar a uniqueness. Geralmente, ns sintetizamos primers com 17-28 bases de comprimento. - A existncia desta faixa est baseada no fato de se buscar unique primers que apresentem temperatura de anelamento dentro da faixa considerada como a mais adequada.
Composio de Bases
- A composio de bases afeta a especificidade da hibridizao, as temperaturas de melting e anelamento, e a estabilidade interna. - Composio de bases randmica prefervel. Sempre que possvel devem ser evitadas longas regies ricas em (A+T) e (G+C).
Template DNA 5...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3
TGCCCG ATCATGC GCCCG T
- Geralmente, a quantidade de (G+C) deve estar em torno de 50-60% para assegurar-nos as temperaturas de melting e anelamento adequadas reao de PCR, e, desta forma, fornecer estabilidade na hibridizao. Porm, as temperaturas de melting e anelamento e a estabilidade na hibridizao so afetadas por outros fatores, os quais ns discutiremos mais tarde. Therefore, (G+C) content is allowed to change.
TGCCCG GCCCGATCATGCT
Temperatura de Melting
-Temperatura de Melting, Tm a temperatura na qual metade das fitas de DNA est na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hlice. - Tm dependente da composio do DNA, de modo que aumento do contedo de G+C no DNA gera um incremento na Tm ocasionado pelo maior nmero de ligaes de H. Determinao (Composio de Base): Tm = 59.9 + 0.41*(%GC) - 600/comprimento Outros mtodos mais precisos so disponveis.
Temperatura de Anelamento
Temperatura de anelamento, Tanneal a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde. Ela pode ser calculada a partir da Tm .
Tanneal = Tm_primer 4C
Para assegurar que o pareamento dos primers ao DNA molde ocorra antes que as duas fitas se liguem uma a outra, necessrio que: Tm_product Tanneal 30 C .
Outros fatores: GC%: pares de GC so mais estringntes que pares de AT. Concentrao de sais & tampo.
Estrutura Interna
Se os primers puderem parear com eles mesmos, ou parearem um com o outro mais facilmente do que com o DNA molde, ento a eficincia do PCR ir ser reduzida significativamente. Primers com estas caractersticas devem ser evitados.
Entretanto, s vezes estas duas estruturas no so problemticas, uma vez que a ocorrncia destas pode ser restringida atravs da determinao da temperatura de anelamento. Por exemplo, alguns dmeros ou grampos so formados a 30 C, enquanto que durante o ciclo do PCR a temperatura mais baixa seja de 60 C.
3 3
4.
5. 6.
7.
Task
Desenhar um par de primers para a seqncia NM_203378 no NCBI GenBank, ento a seqncia que codifica a human myoglobin ser amplificada usando PCR. Entre 156..620
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
Primers Universais
Primers podem ser desenhados para amplificarem apenas um produto. Primers tambm podem ser desenhados para amplificarem mltiplos produtos. Ns chamamos tais primers de primers universais. Por exemplo, os primers desenhados para amplificarem todos os genes HPV. Estratgia: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Alinhar grupos de seqncias que voc quer amplificar. Encontrar a regio mais conservada entre as extremidades 5 e 3. Desenhar o forward primer na regio conservada na poro 5. Desenhar o reverse primer na regio conservada na poro 3. Matching forward e reverse primers para encontrar o melhor par. Garantir uniqueness em todas as seqncias molde. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.
Primers Semi-Universais
Primers podem ser desenhados para amplificarem apenas um subgrupo de seqncias-molde pertencentes a um grande grupo de seqncias similares. Por exemplo, desenhar um primer para amplificar o gene HPV tipos 1e 6, e no amplicar os demais. Estratgia: 1. Alinhar todos os tipos de genes HPV. 2. Identificar um subgrupo de genes que so mais similares entre si que em relao a outros subgrupos. Neste caso, os tipos 1 e 6. 3. Encontrar as regies 5 e 3 que so mais conservadas entre o tipo 1 e o tipo 6, mas que sejam variveis nos outros tipos. 4. Desenhar forward primers na regio 5 e reverse primers na regio 3. 5. 6. 7. Matching forward e reverse primers para encontrar o melhor par. Garantir uniqueness em todas as seqncias molde. Ensure uniqueness in possible contaminant sources.
Guessmer
Estratgia: Transcrever protenas em nucleotdeos usando o cdigo correspondente da tabela de cdons. Identificar regies 5 e 3 que apresentem a menor variabilidade possvel. Design e match forward/reverse primers como visto anteriormente. Os primers devero possuir em torno de 30 bases de comprimento em contrapartida das bases mismatched reduzirem a especificidade na hibridizao. Utilize elevada temperatura de anelamento para aumentar a estringncia do primer durante o pareamento.