REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE – PCR

• A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas cópias
de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio).
• A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq polimerase, e requer
primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse do DNA .
• Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de
temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse.
• A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada em
clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de DNA.

Taq POLIMERASE
• Fazer novas fitas de DNA, usando as existentes como moldes;
• DNA polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa à 70 °(temperatura em que
as DNA polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais);
• Altas temperaturas é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde,
isto é, separar suas fitas;
• Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer

Primers de PCR
• Primers - sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a
síntese de DNA.
• Pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta de 20 nucleotídeos de
comprimento;
• Dois primers são usados para cada reação de PCR, projetados para englobar a região
de interesse;

Ambos os primers, quando ligados, apontam "para dentro" – isso é, na direção 5' para 3' rumo à região a ser

copiada. Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase só consegue sintetizar DNA na direção 5' para 3'.

Quando os primers são estendidos, a região que está entre eles será, assim, copiada.

ETAPAS
 • Desnaturação (96° C ): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as
fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.
• Anelamento (55º c): Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas
sequências complementares no DNA molde de fita simples.
• Extensão (72 °C): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda
os primers, sintetizando novas fitas de DNA.

Este ciclo se repete 25 - 35 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 2 -

4 horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente
(funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões.

• Não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez;
• O novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde;
• Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela
reação, isso faz que ocorra um crescimento exponencial;

ELETROFORESE EM GEL – VISUALIZAR OS RESULTADOS DO PCR

• É uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica
através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo com
o tamanho;
• Padrão ou escada de DNA – Determina o tamanho dos fragmentos;
• Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda no gel;
• Pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao
DNA;
• Band de DNA - contém muitas cópias da região de interesse do DNA;

Uma reação de PCR produzindo um fragmento de 400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no
gel;