Exame prático de bioquímica

2º experiência: Proteoma do soro por eletroforese 1D (SDS-PAGE)

O que é a eletroforese?
- Uma técnica de separação de misturas de moléculas biológicas, baseada no facto de que
moléculas com carga, em solução aquosa, migrarem diferencialmente sob ação de um campo
elétrico.

Os procedimentos eletroforeticos mais comuns, são os em suporte de acetato de celulose, de

gel de agarose e gel de poliacrilamida

Matriz de gel, cria suporte para a migração e impede que as moléculas se

misturem novamente, depois da reação terminar. Mas também cria um
crivo/coador molecular que contribui para a separação

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é o procedimento mais

sofisticado que permite a resolução de proteínas individuais, mesmo que
sejam estruturalmente semelhantes.

Devido à capacidade de crivagem do gel de poliacrilamida as proteínas

mais pequenas migrarão mais depressa do que as maiores o que significa que a técnica de SDS-
PAGE não só permite separar proteínas, mas também determinar a sua massa molecular

A mobilidade de duas proteínas sob um mesmo campo elétrico será proporcional à diferença
entre as densidades de carga (ou razão carga/massa). Esta propriedade varia com o valor de ph
(porque este faz variar a ionização dos grupos e assim a carga total da proteína).

O que é o SDS (sulfato dodecil de sódio)?

- Um detergente aniónico muitas vezes associado á electroforese
em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) pois liga-se fortemente às
proteínas, rompendo as ligações não covalentes que estabilizam a
estrutura natural e conferindo-lhes carga total negativa.

Na presença de SDS, as proteínas ficam desnaturadas e a sua carga

total é principalmente devida ao SDS (ou seja ficam todas com a
mesma densidade de carga- negativa).

O que é o DTT?
- Redutor das ligações sulfureto (S-S), libertando as subunidades das proteínas multiméricas.

Procedimento:

o Montagem da tina de eletroforese

- Diluir o tampão de corrida 1x (1:10)

- Remover o gel da embalagem e retirar o pente (topo) e a fita isolante (base)

- Fixar a sanduíche que é composta por gel polimerizado ao aparato interno da tina de
eletroforese

- Acrescentar o tampão de corrida nos reservatórios do cátodo e do ânodo, de forma que os

poços e a base de gel permaneçam inteiramente cobertos – verificar a inexistência de fugas

Como funciona o processo de eletroforese?

Como podemos utilizar a eletroforese?

- Testes de paternidade

o Preparação e aplicação das amostras

- Adicionar 15 μL da solução de soro de cavalo diluída em água destilada ao tampão de

amostra (valores dependentes do fator de diluição e do volume de amostra referidos
anteriormente

- Ferver a 100oC por 3 minutos

- Centrifugar 1 a 2 minutos
- Com apoio de uma micropipeta, colocar as amostras e os marcadores de Mr em cada um dos
poços de forma que as amostras de depositem bem no fundo do poço