a galactosemia é um erro inato do metabolismo caracterizado pela deficiência de galactose-1-

fosfatouridiltransferase, que compromete a capacidade do organismo em metabolizar galactose,

um açúcar que é principalmente derivado da lactose do leite mas tambem podendo ser
encontrada em frutas e derivados, e é importante para fornecer energia para célula e participar de
processos celulares que regulam o bom funcionamento do organismo. A galactosemia é o
resultado de uma alta concentração sanguínea tanto da galactose quanto de moléculas derivadas
desse açúcar, que também podem se acumular nos tecidos. Esse distúrbio metabólico é causado
devido a mutações nocivas no gene GALT, que codifica a enzima Galactose 1-fosfato uridil-
transferase.

A galactosemia clássica é uma doença metabólica hereditária que afeta cerca de 1:30000 a 1:60
000 recém-nascidos, caracterizada pela deficiência da enzima galactose-1-fosfato
uridiltransferase (Fridovich-Keil, 2006). A maioria dos doentes apresenta no período neonatal,
após ingestão de leite, uma deterioração neurológica progressiva, cataratas e alterações no
aparelho digestivo e renal.

O diagnóstico precoce é fundamental para excluir de imediato a galactose da dieta alimentar de

modo a evitar sequelas irreversíveis (Bosch, 2000),

Neste trabalho iremos fazer uma análise de sobre o estresse causado no tecido após ser
submetida a catalase, sulfidrila e TBA.

A catalase: é uma peroxidase, ou seja, uma enzima que faz parte do grupo de oxirredutases
responsáveis por oxidar substratos orgânicos, e possui a função de degradação do peróxido de
hidrogênio, que é uma molécula naturalmente formada em organismos vivos durante o
metabolismo oxidativo.

a sulfidrila; é caracterizado por um átomo de enxofre, ligado a um átomo de hidrogênio.

TBA; A toxina botulínica é uma neurotoxina produzida pela bactéria Clostridium botulinum. A
toxina se liga aos receptores pré-sinápticos, impedindo a fusão das vesículas de acetilcolina com
a membrana celular e reduzindo a sua liberação. Isso resulta em uma diminuição da contração
muscular.

para este experimento foram usadas amostras do rim esquerdo (30 dias).

4 machos e 4 fêmeas

1. tampão fosfato de sódio 20mM c/kcl 140mM

500ML

· KCL ----- 5,22g

 · Na2H2Po47H2o ------2,17g

· Na2aH2Po4H2o --------0,26g

· diluimos em água

· acertamos o ph com HCL (7.4)

· completamos o volume até 500ml

· e foi armazenado na geladeira

2. calculos para soluçao de galactose 5mM

a amostra foi homogeneizada em uma soluçao 160μl de sobrenadante + 40 μl de soluçao de GAL

55mM

· a concentraçao de GAL na soluçao final deve ser 5mM, sendo assim sera diluido no
sobrenadante 4x o volume de GAL então precisamos que a concentraçao da soluçao fosse
5x maior, sendo 25mM

3. foram 8 amostras (4 machos e 4 femeas) que foram divididas

· 8 controles ---- 16μl sobrenadante + 40μl tampao

· 8 GAL ----160 μl sobrenadante + 40 de sol. GAL

4. procedimento

preparamos o homogeneizado do rim em fosfato de sodio 20mM contendo KCL140mM ph7.4

centrifugamos a 750g por 10 minutos em 4°C

encubamos por 1 hora a 37°, quatro partes de homogeneizado e uma parte do metabolito 160μL
de homogeneizado + 40μL de solução de PHE

após a encubaçao usamos o método em duplicata fizemos um branco de amostra para cada
concentraçao.

em epperndofs pipetamos na seguinte ordem:

 · Tampão de PBS com EDTA 1mM ph 7,4

->Usado para dissolver o DTNB.

5. misturamos em vortex e encubamos por 30 minutos no escuro, em temperatura ambiente

logo depois zeramos com água e levamos ao espectofotômetro em cubetas de plástico para ler
em 412nm.

O reagente de cor (DTNB) é reduzido por tóis gerando um derivado amarelo (TNB) lido no
espectofotometro em 412nm. determinando os tióis totais da amostra , sendo um parâmetro de
medida de dano oxidativo ás proteinas da amostra.

-> o DTNB deve ser preparado no dia e envolto em papel alumínio pois é fotosensivel.

RESULTADOS DA ÁNALISE

*planilha da curva

PROTOCOLO DE TBA

-> a curva foi feita em método de duplicata e as amostras em triplicata.

· pipetamos 10ml de amostra

· fizemos a curva desta forma.

-> acrescentamos 200μl de TCA 10% + 300μl de TBA 0,67% e levamos a encubação, em banho
fervente por 2 horas.
passadas 2 horas levamos as amostras ao espectofotometro para leitura em 512nm

RESULTADOS A BAIXO:

*PLANILHA DA CURVA