Universidade Federal Fluminense

Hospital Universitário Antônio Pedro

Tipo do PROCEDIMENTO OPERACIONAL

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ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
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1. QUEM

Os profissionais habilitados para execução deste procedimento são técnicos de

laboratório, biólogos, biomédicos, farmacêuticos e médicos patologistas clínicos.

2. DEFINIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS

O soro humano possui mais de cem proteínas individuais, cada uma com um conjunto
específico de funções e sujeitas a variações em concentração sob diferentes condições
patológicas. Desde a introdução da eletroforese em bandas móveis, por Tisselius, e o uso
subsequente da eletroforese de zonas, as proteínas séricas têm sido fracionadas com base
em suas cargas elétricas em um pH particular, formando as cinco frações clássicas:
albumina, alfa1, alfa2, beta e gama. Cada uma dessas zonas clássicas de eletroforese,
exceto a albumina, normalmente contém dois ou mais componentes protéicos. A
proporção relativa encontrada entre estas frações tem comprovadamente uso no
diagnóstico e prognóstico de certos estados patológicos.

3. OBJETIVO(S)

Este procedimento Operacional Padrão foi elaborado pela Seção de Hematologia e tem
como produto final a automatização da ELETROFORESE DE PROTEINAS no soro e na urina.
O equipamento utilizado é o SPIFE 3000 - HELENA LABORATORIES para a realização destes
exames.

4. MATERIAL

4.1 Amostras

4.1.1 Preparo do paciente: jejum de oito horas;

4.1.2 Obtenção da amostra: sangue venoso colhido sem anticoagulante através
de punção venosa, conforme o manual de coleta do laboratório;
4.1.3 Armazenamento e estabilidade da amostra: Se for necessário armazenar o
soro, as amostras devem ser armazenadas entre 15 a 30°C por 4 dias, entre 2 a 8°C por 2
semanas ou -20°C por 6 meses. Amostras de urina podem ser armazenadas entre 2 a 8°C
por até 72 horas ou a -20°C por 1 mês.
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4.1.4 Fatores que influenciam na corrida eletroforética estão no Anexo I deste

POP;

4.2 Frascos adequados

Tubo para soro com gel, sem anticoagulante (tampa amarela ou vermelha)

4.3 Amostras inadequadas

Amostras hemolisadas e com fibrina.

4.4 Equipamentos

4.4.1 SPIFE 3000

4.4.2 Electophoresis Sample Hadler (ESH)
4.4.3 Computador
4.4.4 Densitômetro (Scanner)

4.5 Reagentes

Gel de Agarose (Pronto para uso)

Azul Ácido. Preparo para utilização: Dissolver o corante seco (todo o conteúdo do
frasco) em 1L de solução de ácido acético a 5%. Agitar bem.

Descorante Ácido Cítrico. Preparo para utilização: Despeje 11L de água deionizada
no frasco de descorante. Adicione o conteúdo inteiro da embalagem. Agite bem até que
todo o conteúdo esteja dissolvido.

4.6 Controle de qualidade

Controle de Qualidade (CQ): SPE Normal (Cat. No. 3424) e SPE Anormal (Cat.
No. 3425) podem ser usados para verificar todas as fases do procedimento e devem ser
usados em cada corrida.
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Preparo do Controle (CQ): Reconstituir SPE Normal e o SPE Anormal com 2.0
mL de água destilada, aguardar aproximadamente 20 minutos e homogeneizar
gentilmente até completa diluição.

Estabilidade do Controle (CQ): O controle liofilizado armazenado de 2 a 8°C

tem estabilidade até a data de validade. Após reconstituído a estabilidade é de 5 dias
armazenado de 2 a 8°C.

5. DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO

5.1 Protocolo do equipamento ESH (Electroforesis Sample Handler) – Pipetador

para Eletroforese.

5.1.1 Preencher os galões/ frascos com as seguintes soluções: Galão Bomba da

Seringa: Solução fisiológica (salina) – 1L, Galão Bomba de lavagem: Água Reagente – 1,5 a
2L. – Frasco Diluente de amostras: Solução fisiológica (Salina).
5.1.2 Inserir o Frasco Diluente de amostras no local indicado SEM TAMPA.
5.1.3 Encaixar o carrossel com o tubo Branco (STOP) na posição seguinte da
última a ser pipetada.
5.1.4 Ligar o equipamento na chave lateral (Power) – Toda vez que o
equipamento é ligado, o carrossel gira até que a luz de leitura seja alinhada ao centro da
fenda para a leitura dos códigos de barras dos tubos. O nome do último teste utilizado
aparecerá na tela, seguido da palavra (READY) logo abaixo.
5.1.5 Manutenção diária: -Menu/Esc – seta para a direita – Selecionar (WASH) –
START. (O equipamento realizará a limpeza da agulha e lavagem das tubulações)
5.1.6 Seleção do teste a ser realizado: - Menu/Esc- Selecionar (TEST), clicar em
START (abrirá o menu de testes “[ ]”). Procurar o teste desejado com a seta:
- Eletroforese de Proteinas 60 testes: [Spife Split Beta 60 45µL]
- Imunofixação 15 testes (imunofix-15): [Spife IFE 15 SP 1:3 A,M,L 1:5 G,K 1:10]
- Selecionar “Start” (voltará para o Menu) O visor irá “assumir” o teste que você
escolheu através do START.
- Clicar em “Menu/Esc” até chegar na tela com o nome do teste, seguido de
“READY”
5.1.7 Inserir os tubos de amostras no carrossel e a placa à ser pipetada com as
respectivas canaletas - Após inserir a placa e os tubos, clicar em START para iniciar a
pipetagem.
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5.1.8 Observações importantes:

- Durante a pipetagem, a linha superior do visor indica o nome do teste e as
diluições selecionadas e a linha inferior indica o que o equipamento está fazendo naquele
momento.
- O equipamento ESH demora aproximadamente 40 minutos para realizar a
pipetagem de uma placa de amostras.
- Caso o tubo branco (STOP) não seja inserido, ou sejam inseridos mais tubos do
que o número de testes da placa, o equipamento pipetará a placa completa e solicitará
uma nova placa para continuar a pipetagem.

5.1.9 Realizar no “WASH” ao finalizar a pipetagem.

5.2 Protocolo de Eletroforese de Proteínas séricas – No Equipamento: SPIFE 3000

5.2.1 Ligar o equipamento na chave lateral e executar “Manutenção”.

5.2.2 Aplicação das amostras: 60 amostras:

- Colocar a canaleta apropriada (poço fundo) na placa de amostras;

- Pipetar 45µL das amostras e/ou controles nos poços da canaleta de amostra;
OBS: Para Urina/LCR concentrados, pipetar 20µL.
- Colocar a placa de amostra no equipamento;
- Colocar o aplicador branco no carrinho aplicador nas posições 2, 8 e 14;
- Colocar os pesos nos aplicadores.

5.2.3 Preparação do gel na cuba:

- Colocar aproximadamente 1 mL de Rep Prep na cuba de eletroforese (quadrado marcado

para QuickGel);
- Cuidadosamente retirar o gel de eletroforese da embalagem acrílico;
- Colocar o gel sobre o Rep Prep de forma que NÃO forme bolha sob o mesmo;
- Com uma gaze retirar o excesso de Rep Prep da cuba, que eventualmente pode se
espalhar ao redor do gel;
- Colocar os eletrodos sobre os blocos de gel;
- Retirar overlay (película transparente);
- Aplicar o Blotter C (papel de filtro) sobre o gel, em seguida, retire-o;
- Remover todo excesso de líquido que pode estar ao redor do gel;
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- Fechar a tampa do equipamento.

5.2.4 Corrida do Gel:

- No botão TEST SELECT, selecionar: SPLIT BETA;

- Para iniciar o teste, pressionar START (2 vezes)
- Fechar a tampa do equipamento para a corrida eletroforética;
- Finalizado o tempo de corrida, será emitido um bip pelo equipamento;
- Abrir a tampa do equipamento;
- Retirar os eletrodos;
- Remover os blocos de gel com a espátula;
- Retornar os eletrodos a suas posições iniciais para evitar o enrolamento do gel, que
levará a uma secagem irregular;
- Pressionar CONTINUE e aguardar a secagem do gel;
- Retirar o gel da cuba.
- OBS: Retirar a placa de amostra e aplicadores do equipamento. As canaletas e os
aplicadores devem ser lavados em água corrente sobre um papel toalha para secagem em
temperatura ambiente.

5.2.5 Coloração e descoloração do gel:

- No botão TEST SELECT, selecionar o teste: SPLIT BETA;

- Colocar o gel no Holder;
- A frente do gel deverá estar de costas para o operador;
- Para iniciar o procedimento, selecionar START (2 vezes);
- O equipamento emite um bipe ao finalizar os procedimentos (coloração, descoloração e
secagem do gel);
- O gel está pronto para realizar a digitalização no QSK.

5.2.6 Visualização das Bandas

- Poderá ser observado no gel:

- Albumina, Alfa 1, Alfa 2, Beta e Gamaglobulina.
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5.2.7 Resultados e Interpretação:

- Resultados em indivíduos saudáveis consideram as variações de sexo, idade e variações

biológicas do dia a dia. Padrões anormais são observados em gestantes e em desordens
de resposta inflamatória, doença reumática, hepática, desordens de perda de proteína,
discrasias em células plasmáticas e deficiências genéticas.

- Testes Adicionais Necessários: Se alguma anormalidade for observada, estudos de

acompanhamento devem ser apropriadamente realizados. Isso inclui imunoeletroforese,
imunofixação, quantificação de imunoglobulinas, exames de medula óssea e demais testes
apropriados.

5.2.8 Valores de Referência:

- Fração da Proteína % Proteína Total – X ± 2 DP

Albumina 47,6 - 61,9
Alfa1 1,4 - 4,6
Alfa2 7,3 - 13,9
Beta 10,9 - 19,1
Gama 9,5 - 24,8

6. REFERÊNCIAS

ANALISADOR SPIFE 3000 (Manual do Usuário);