Universidade Federal Fluminense

Hospital Universitário Antônio Pedro

Tipo do PROCEDIMENTO OPERACIONAL

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1. QUEM

Os profissionais habilitados para execução deste procedimento são técnicos de

laboratório, biólogos, biomédicos, farmacêuticos e médicos patologistas clínicos.

2. DEFINIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS

Na ocorrência de lesões típicas de leishmaniose, o diagnóstico clínico e epidemiológico

pode ser realizado, especialmente se o paciente procede de áreas endêmicas ou esteve
presente em lugares onde há casos de leishmaniose. O diagnóstico clínico-
epidemiológico pode ser complementado pela IDRM positiva e eventualmente pela
resposta terapêutica. Entretanto, a confirmação desse diagnóstico por métodos
parasitológicos é fundamental tendo em vista o número de doenças que fazem
diagnóstico diferencial com a LTA.

Demonstração direta do parasito é o procedimento de primeira escolha por ser mais

rápido, de menor custo e de fácil execução. A probabilidade de encontro do parasito é
inversamente proporcional ao tempo de evolução da lesão cutânea, sendo rara após um
ano. A infecção secundária contribui para diminuir a sensibilidade do método, dessa
forma, deve ser tratada previamente.

3. OBJETIVO

Este procedimento Operacional Padrão foi elaborado pela Seção de Parasitologia tem
como produto final detecção de formas Amastigotas de Leishimania sp.
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4. MATERIAL

 Microscópio;
 Lâmina;
 Suporte para lâmina.

4.1 Reagente
 Água;
 Corante de Wright;
 Corante Panótico Rápido;
 Corante de May-Grunwald-Giensa;
 Óleo de imersão.

5. DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO

5.1 Amostra

 Coleta da amostra para demonstração direta do parasito:

a) O esfregaço é realizado por escarificação da borda interna da úlcera ou da

superfície de lesão fechada, utilizando-se lâminas de bisturi estéreis ou estilete
(Figura 1).

b) A punção aspirativa pode ser realizada após injeção de 3mL de solução salina
estéril na borda da lesão ou linfonodo, utilizando-se uma seringa de 5mL e agulha
25x8.

c) Após a excisão cirúrgica, a técnica de aposição em lâmina (também denominada

imprint ou touch preparation) pode ser realizada por meio da delicada
compressão de fragmento de tecido, obtido por biópsia, sobre uma lâmina de
vidro. Uma boa execução da técnica requer que o fragmento seja previamente
banhado em solução salina estéril e o excesso de sangue e líquidos absorvidos em
gaze ou papel de filtro.
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d) O material obtido por qualquer das técnicas deve ser distendido em lâminas de
microscopia previamente limpas, desengorduradas e secas. Se possível, empregar
lâminas de borda fosca para melhor identificação do material (Figura 2). e) Após a
confecção do esfregaço, as lâminas serão coradas pelos métodos de Wright, May-
Grunwald-Giensa ou corantes rápidos (este último ainda visto com algumas
restrições por alguns cientistas) e observadas no microscópio ótico para pesquisa
de formas amastigotas.
Figuras 1 e 2 – LTA – Escarificação da borda de lesão cutânea, localizada no membro
superior, com lâmina de bisturi e confecção do esfregaço em lâmina de vidro.

Fonte: Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde.

5.2 Coloração

5.2.1 Coloração pelo método de May-Grunwald / Giensa

1. Identificar os esfregaços com etiqueta impressa ou o nome do paciente, o número da

amostra e data a lápis na borda fosca da lâmina;
2. Colocar a lâmina sobre o suporte como esfregaço voltado para cima;
3. Cobrir a lâmina com corante de May-Grünwald (20 gotas) e aguardar 2 minutos;
4. Lavar as lâminas com água destilada;
5. Cobrir a lâmina com o corante de Giemsa que deve ser preparado para uso na
proporção de uma gota do corante (50 µL) para cada 1 ml de água. Após o tempo de
cinco minuto desprezar o corante e lavar;
6. Limpar o fundo da lâmina com gaze seca;
7. Colocar a lâmina para secar na posição vertical.
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 Obs.: A solução uso do corante de Giemsa não deve ser guardada por mais de 24
horas.

5.2.2 Coloração pelo método de Wright

1. Identificar os esfregaços com etiqueta impressa ou o nome do paciente, o número da

amostra e data a lápis na borda fosca da lâmina;
2. Colocar a lâmina sobre o suporte com o esfregaço sanguíneo identificado voltado
para cima;
3. Cobrir o esfregaço com o corante e deixar agir por um minuto, período no qual o
esfregaço é fixado pelo metanol;
4. Acrescentar 20 gotas de água ou solução. Tampar. Soprar com pipeta, a fim de
misturar os dois líquidos. Corar por aproximadamente 5 minutos;
5. Lavar com água corrente. Limpar a parte oposta ao esfregaço com gaze para retirar
os resíduos de corante;
6. Deixar secar.

5.2.3 Coloração pelo método Panótico

1. Identificar os esfregaços com etiqueta impressa com dados do paciente na parte

fosca da lâmina;
2. Colocar as soluções do kit de coloração nas cubas de Coplin , uma separadamente da
outra, e identificar os frascos com os números 1, 2 e 3, obedecendo à ordem de
imersão;
3. Colocar as lâminas na cuba do primeiro corante e deixar por 10 segundos. Aos 10
segundos retirar do corante e deixar escorrer durante 5 segundos;
4. Colocar as lâminas na cuba do segundo corante e deixar por 10 segundos. Retirar do
corante e deixar escorrer durante 5 segundos;
5. Colocar as lâminas na cuba do terceiro corante e deixar por 20 segundos. Retirar do
corante e deixar escorrer durante 5 segundos e lavar as lâminas com água deionizada
recente.

 Obs.: A técnica de coloração deve ser seguida rigorosamente observando o volume

do corante (a extensão deve estar totalmente submersa no corante) e o intervalo de
5 segundos entre as colorações subsequentes. Sempre certificar o correto
fechamento das tampas das cubas, uma vez que os corantes são voláteis; o seu
volume pode ser completado sempre que necessário.
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5.3 Resultados

 Presença ou ausência de formas amastigotas de Leishmania sp.

5.4 Controles de qualidade

 Dupla leitura: todas as lâminas examinadas ao microscópio, independente da

metodologia aplicada e colaborador que realizou, são armazenadas adequadamente,
e diariamente um percentual é reexaminada por outro microscopista.

 Simples cego: amostras, sabidamente positivas ou negativas, conservadas, são

incorporadas à rotina, periodicamente.

 Duplo cego: alíquota de amostra recebida é inserida novamente na rotina,

periodicamente, com nome fictício.

6. REFERÊNCIAS

1. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana / Ministério da Saúde,

Secretaria de Vigilância em Saúde. – 2. ed. atual. – Brasília: Editora do Ministério da
Saúde, 2010

2. De Carli AG. Parasitologia clínica – Seleção de métodos e técnicas de laboratório para

o diagnóstico das parasitoses humanas. 2.ed. São Paulo: Atheneu, 2001.

3. LIMA AO. Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica – Técnica e Interpretação. 8ª

ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2001.

4. MOURA RA. Técnicas de Laboratório. 3ª ed. São Paulo: Atheneu, 2006.

5. NEVES DP. Parasitologia humana. 13. ed. São Paulo: Atheneu, 2004.

6. Bula fabricante corante de Wright.