UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

HOSPITAL UNIVERSITÁRIO LAURO

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PROCEDIMENTO / ROTINA
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COLORAÇÃO DE GRAM
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1. OBJETIVO

A coloração de Gram é utilizada para classificar bactérias com base no tamanho,

morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratório de microbiologia clínica é
um teste adicional rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, sendo também utilizado para
avaliar a qualidade da amostra clínica analisada.

2. MATERIAIS

• Cabine de segurança biológica;

• Lâminas de vidro limpas e desengorduradas 7,5x2,5cm, com extremidade
fosca;
• Álcool para limpeza da lâmina;
• Alça bacteriológica;
• Algodão ou gaze;
• Suporte para coloração;
• Luvas;
• Cronômetro;
• Salina estéril;
• Bico de Bunsen;
• Óleo de imersão;
• Microscópio;
• Fonte de água corrente.

2.1. Corantes de GRAM:

• Corante: Cristal violeta (cristal violeta, oxalato de amônio e álcool etílico);
• Mordente: Lugol 1% (Iodeto de potássio, iodo, álcool etílico);
• Descorante: Álcool etílico e acetona;
• Contra corante: Fucsina fenicada (Fucsina básica, fenol, álcool etílico).
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3. DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO

3.1. Tipo de Amostra

Amostras coletadas com swabs, aspirados, exsudatos, escarros, líquidos e outros
fluidos orgânicos, Líquido Cefalorraquidiano (LCR), biópsias ou fragmentos de tecidos, urina, fezes.

3.2. Procedimento Técnico

3.2.1. Técnica para preparo do esfregaço

• Identificar a lâmina de maneira segura;
• Rolar toda a superfície do swab sobre a lâmina para não destruir as células;
• Os líquidos estéreis devem ser centrifugados e depositados na lâmina com alça
bacteriológica;
• Fixar rapidamente na chama;
• Quando material é escasso, demarcar a área do esfregaço.

3.2.2. Coloração
• Cobrir a lâmina com a solução de cristal-violeta por cerca de um minuto;
• Decantar o cristal-violeta e lavar suavemente com a água da torneira.
(Observação: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das células
Gram-positivas);
• Cobrir a área do esfregaço com a solução de lugol durante cerca de um minuto;
• Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra
incolor;
• Alternar com água corrente (jato fraco). O tempo usualmente utilizado nesta
etapa é de cerca de 10 segundos. (Observação: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a
retirada do cristal violeta das células Gram-positivas, assim como, a pouca descoloração pode
resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma tonalidade azulada nas bactérias
Gram-negativas);
• Cobrir o esfregaço com a solução de fucsina, por cerca de 30 segundos;
• Lavar com água corrente;
• Deixar secar ao ar, em temperatura ambiente.
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Figura 1. Técnica de coloração pelo método de Gram.

Fonte: Tortora, 2012.

3.3. Procedimento Analítico

3.3.1. Microscopia
• A leitura deve ser feita em objetiva de imersão, aumento de 1000x.
• Os resultados das leituras são anotados para depois serem digitados e liberados
pelo farmacêutico/biólogo/biomédico responsável.

3.3.2. Resultados
As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração
violeta enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo coradas com o
corante de fundo (fucsina) e se apresentam róseas.

3.3.3. Resultados esperados:

• Bacilos Gram-negativos, coloração rósea.
• Cocos Gram-positivos, coloração violeta.

3.3.4. Ação Corretiva

O Setor de Microbiologia, depois de corar as lâminas, deve observar uma grande
extensão destas para conclusão do diagnóstico. Se o esfregaço é malfeito, acumulando material na
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lâmina sem estendê-lo apropriadamente, isso resulta numa superposição de células, muco,
bactérias etc., impossibilitando a diferenciação de detalhes ou mesmo a visualização dos elementos.
Confeccionar nova lâmina melhorando a qualidade do esfregaço.
Riscos na lâmina ou precipitados de corantes podem confundir o técnico com
estruturas bacterianas. Usar lâminas novas para confeccionar os esfregaços e filtrar os corantes para
evitar os precipitados.

3.4. Controle de Qualidade

• Verificar diariamente a aparência dos reagentes. Se a solução de cristal-violeta
precipitar, filtre novamente antes de usar.
• A evaporação pode afetar a eficácia dos reagentes. Recomenda-se que as
soluções de trabalho sejam trocadas regularmente, dependendo da demanda.
• Diariamente e quando novos reagentes forem preparados, corar, juntamente com
os esfregaços da rotina, lâminas controles com a bacterioteca pertencente ao laboratório ou com
cepas padrões.
• Fazer manutenção preventiva e limpeza dos microscópios.

4. REFERÊNCIAS

BRASIL. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Manual de Procedimentos

Básicos em Microbiologia Clínica para o Controle de Infecções Hospitalares. <Disponível em:
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_procedimentos_microbiologiaclinica_control
e_infechospitalar.pdf>. Acesso em: 21 de maio de 2020.
BRASIL. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Manual de Microbiologia Clínica
para o Controle de Infecções em Serviços de Saúde. Disponível em :<
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_microbiologia_completo.pdf>. Acesso em:
21 de maio de 2020.
OPLUSTIL, Carmen Paz. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 3. ed. São Paulo: Sarvier,
2010.
PILONETO M, PILONETO DV. Manual de Procedimentos Laboratoriais em Microbiologia - POPs em
Microbiologia. Microsciense, Curitiba, 1998.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10 ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. p. 70.
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5. HISTÓRICO DE REVISÃO

VERSÃO DATA DESCRIÇÃO DA ALTERAÇÃO

1.0 30/07/2020 Elaboração do documento.

Elaboração Data: 30/07/2020

Adriana Nogueira
Antônio Francisco A. Gonçalves
Deborah Gomes B. Pinto
Larissa Rodrigues dos Santos Silva
Tatiana Simões Pontes

Revisão Data: 30/08/2020

Ednamar Pereira Vale
Maria de Fátima Pereira Reis
Albalucia Costa Carvalho
Humberto de Carvalho Aragão Neto

Validação Data: 01/10/2021

Larycia Vicente Rodrigues – Setor de Gestão da Qualidade e
Vigilância em Saúde

Aprovação (Nome, Função, Assinatura) Data: 10/11/2021

Dr. Rubens Batista Benedito – Farmacêutico

Chefe da Unidade de Laboratório de Análises Clínicas

Permitida a reprodução parcial ou total, desde que indicada a fonte