Universidade Federal Fluminense

Hospital Universitário Antônio Pedro

Tipo do PROCEDIMENTO OPERACIONAL

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ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA
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1. QUEM

Os profissionais habilitados para execução deste procedimento são técnicos de

laboratório, biólogos, biomédicos, farmacêuticos e médicos patologistas clínicos.

2. DEFINIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS

O Procedimento de Eletroforese SPIFE Hemoglobina Alcalina é um método de

determinação qualitativa e semi-quantitativa de hemoglobinas utilizando eletroforese em
gel de agarose em tampão alcalino no sistema SPIFE 3000. O sistema é usado como
método de triagem para diagnóstico in vitro. Este é método baseado com interações
complexas da hemoglobina com um tampão ácido eletroforético e suporte de Agar. O
procedimento SPIFE Hemoglobina Alcalina é um método simples que requer mínimas
quantidades de hemolisado para fornecer a triagem da presença de hemoglobinas
anormais, tais com hbS, HbC e HbF.

3. OBJETIVO(S)

Este procedimento Operacional Padrão foi elaborado pela Seção de Hematologia e

tem como produto final a automatização da ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA no sangue
total. O equipamento utilizado é o SPIFE 3000 - HELENA LABORATORIES para a realização
destes exames.

4. MATERIAL

4.1 Amostras

4.1.1 Preparo do paciente: jejum de oito horas;

4.1.2 Obtenção da amostra: sangue venoso colhido com anticoagulante (EDTA)
através de punção venosa, conforme o manual de coleta do laboratório;
4.1.3 Armazenamento e estabilidade da amostra: Se for necessário armazenar
as amostras, o sangue total e hemácias lavadas, devem ser armazenadas por até uma
semana entre 2 a 8°C. Amostras congeladas podem apresentar artefatos em uma banda
anódica a HbA.
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4.2 Frascos adequados

Tubo de sangue total com anticoagulante EDTA (tampa roxa)

4.3 Amostras inadequadas

Amostras hemolisadas, com fibrina, coagulada.

4.4 Equipamento:

4.4.1 SPIFE 3000

4.4.2 Computador
4.4.3 Densitômetro (Scanner)
4.4.4 Impressora

4.5 Reagentes

Gel de Agarose (Pronto para uso)

Azul Ácido. Preparo para utilização: Dissolver o corante seco (todo o conteúdo do
frasco) em 1L de solução de ácido acético a 5%. Agitar bem. (Maiores detalhes vide bula)

Descorante Ácido Cítrico. Preparo para utilização: Despeje 11L de água deionizada
no frasco de descorante. Adicione o conteúdo inteiro da embalagem. Agite bem até que
todo o conteúdo esteja dissolvido. (Maiores detalhes vide bula).

Hemolisante – Pronto para uso imediato

4.6 Controle de Qualidade

Controle de Qualidade (CQ): AA2 HEMO CONTROL (Cat. No. 5328) e AFSC
HEMO CONTROL (Cat. No. 5331) podem ser usados para verificar todas as fases do
procedimento e devem ser usados em cada corrida.

Preparo do Controle (CQ): Pronto para uso

Estabilidade do Controle (CQ): Armazenado de 2 a 8°C tem estabilidade até a
data de validade indicada no frasco.
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5. DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO

5.1 Protocolo de Eletroforese de Hemoglobina Alcalina – No Equipamento: SPIFE

3000
5.1.1 Lavagem de Hemácias:

- Centrifugar o sangue anticoagulado por 10 minutos para separar as células do plasma;

- Remova o plasma;
- Lave as hemácias 3 vezes por ressuspensão em 5 a 10 volumes de solução salina normal
(0,85% NaCl), centrifugando e aspirando o sobrenadante;
- Após lavar as amostras, prepare o lisado misturando 10µL de amostra em 100µL de
Reagente Hemolisante. Misture no Vórtex ou agite vigorosamente por 15 segundos

5.1.2 Ligar o equipamento na chave lateral e executar “Manutenção”.

5.1.3 Aplicação das amostras: 20 amostras:

- Colocar a canaleta apropriada (poço raso) na placa de amostras;

- Pipetar 17µL das amostras e/ou controles nos poços da canaleta de amostra;
OBS: O controle AA2, não é necessário diluir. O AFSC diluir 1:2 (uma parte de controle
mais uma parte do Reagente Hemolisante).
- Colocar a placa de amostra no equipamento;
- Colocar o aplicador branco no carrinho aplicador na posição 2;
- Colocar peso no aplicador.

5.1.4 Preparação do gel na cuba:

- Colocar aproximadamente 1, 5 mL de Rep Prep na cuba de eletroforese (quadrado

marcado para QuickGel);
- Cuidadosamente retirar o gel de eletroforese da embalagem acrílico;
- Colocar o gel sobre o Rep Prep de forma que NÃO forme bolha sob o mesmo;
- Com uma gaze retirar o excesso de Rep Prep da cuba, que eventualmente pode se
espalhar ao redor do gel;
- Colocar os eletrodos sobre os blocos de gel;
- Retirar overlay (película transparente);
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- Aplicar o Blotter C (papel de filtro) sobre o gel, em seguida, retire-o;

- Remover todo excesso de líquido que pode estar ao redor do gel;
- Fechar a tampa do equipamento.

5.1.5 Corrida do Gel:

- No botão TEST SELECT, selecionar: Alkaline Hemoglobin;

- Para iniciar o teste, pressionar START (2 vezes)
- Fechar a tampa do equipamento para a corrida eletroforética;
- Finalizado o tempo de corrida, será emitido um bip pelo equipamento;
- Abrir a tampa do equipamento;
- Retirar os eletrodos;
- Remover os blocos de gel com a espátula;
- Retirar o gel da cuba;
- OBS: Retirar a placa de amostra e aplicadores do equipamento. As canaletas e os
aplicadores devem ser lavados em água corrente sobre um papel toalha para secagem em
temperatura ambiente.

5.1.6 Coloração e descoloração do gel:

- No botão TEST SELECT, selecionar o teste: Alkaline Hemoglobin;

- Colocar o gel no Holder – Cuidado para não envergar o gel durante o encaixe no holder;
- A frente do gel deverá estar de costas para o operador;
- Para iniciar o procedimento, selecionar START (2 vezes);
- O equipamento emite um bipe ao finalizar os procedimentos (coloração, descoloração e
secagem do gel);
- O gel está pronto para realizar a digitalização no QSK.

5.1.7 Visualização das Bandas

- Poderá ser observado no gel:

- Hemoglobina A
- Hemoglobina F
- Hemoglobina S/D/G
- Hemoglobina C/E/A2
- Anidrase Carbônica (Enzima que tem papel importante no transporte do CO2 e no
controle do pH do sangue.
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- Ponto de aplicação
OBS: Para leitura do gel no QSK 200, durante ajuste fino, não incluir os itens e e f.

5.2 Resultados e Interpretação

- As anormalidades da hemoglobina mais comuns são:

Traço Falciforme – Padrão heterozigótico que mostra HbA e HbS e concentrações normais
de HbA2, em acetato de celulose. Resultados em ágar citrato mostram hemoglobinas HbA
e HbS em posições migratórias. (zonas).
Anemia Falciforme – Padrão homozigótico que mostra exclusivamente HbS, apesar de
que pequenas concentrações de HbF também podem estar presentes.
Hemoglobinopatias SC – Padrão heterozigótico que mostra a HbS e HbC.
Talassemia – Esta condição mostra HbA, HbF, HbF e HbA2.
Talassemia-βº - HbA ausente.
Talassemia β+ - HbA presente em concentrações reduzidas.
Talassemia C – Esta condição mostra HbA, HbF e HbC.
Hemoglobinopatia C – Padrão homozigótico que mostra quase exclusivamente a HbC.
Talassemia Maior – Condição que mostra HbF, HbA e HbA2.

5.3 Valores de referência

- Hemoglobina A: 95 a 98,7%
- Hemoglobina F: 0,2 a 2%
- Hemoglobina S/G/D 0,0%
- Hemoglobina A2/C/E 1,3 a 3,7%

Nota 1. Fração A2/C maior que 20% indica a presença de Hemoglobina C.

Nota 2. As frações foram identificadas conforme as variantes mais relevantes clínica e

epidemiológicamente em nossa população. Como outras frações podem ter a mesma
migração na eletroforese de pH alcalino, a interpretação deve ser de acordo com a clínica.

6. REFERÊNCIAS
ANALISADOR SPIFE 3000 (Manual do Usuário);

Bula do Kit SPIFE Hemoglobina Alcalina.