DISCIPLINA DE LABORATÓRIO CLÍNICO VETERINÁRIO

ROTEIRO DE AULA PRÁTICA - HEMATOLOGIA

Profa Regina K. Takahira
EXAME HEMATOLÓGICO

A) COLHEITA DO SANGUE: Após a antissepsia, realizar o garrote e introduzir a agulha

na pele até atingir a veia. Aspirar lentamente até a quantidade de sangue exigida. Aliviar
o garrote e comprimir a região com algodão. Caso não sejam utilizados tubos de coleta a
vácuo, retirar a agulha da seringa e desprezar o sangue no frasco pelas paredes
respeitando a proporção adequada de sangue e anticoagulante. Inverter o tubo várias
vezes a fim de que o anticoagulante se distribua homogêneamente no sangue. OBS:
Para grandes e médios animais o uso da seringa pode ser dispensado, utilizando-se
apenas a agulha. Causas de Hemólise: - descarga violenta da seringa; - agitação violenta
com anticoagulante; - calor excessivo; - contaminação bacteriana.

B) ANTICOAGULANTES: 1 - EDTA (ácido etileno diamino tetra acético de sódio ou

potássio) a 10% ou 7,5%. Modo de ação: quelante de cálcio. É recomendado para rotina
hematológica porque não interfere na morfologia celular, preservando a amostra de
sangue por até 24 horas quando refrigerada. O sal de potássio é mais solúvel. Respeitar
o volume exigido nos tubos à vácuo comerciais. TUBO DE TAMPA ROXA
2 - Citrato de Sódio - usado para transfusões sanguíneas e provas de hemostasia, em
solução a 3,2%, na proporção de 1 parte da solução para 9 de sangue. TAMPA AZUL.
3 - Fluoreto de Sódio - usado para determinação de glicose e lactato por inibir a
glicólise. Usado em associação com outro anticoagulante, como o EDTA. TAMPA CINZA.
4 - Heparina - Tem ação antitrombina. Apresenta interferência na coloração do
esfregaço sanguíneo, não sendo recomendado para exames hematológicos, exceto em
algumas espécies de aves e répteis. Neste caso, realizar o esfregaço do sangue sem
anticoagulante. Recomendado para hemogasometria e algumas provas bioquímicas. A
heparina retarda a coagulação do sangue por até 8h. TAMPA VERDE.

C) PREPARO DO ESFREGAÇO: Colocar uma gota de sangue em lâmina

desengordurada. Tomar outra lâmina de canto recortado (ou lamínula) e colocá-la à
frente da gota num ângulo de 45o, fazer um ligeiro movimento para trás até o sangue se
espalhar na lâmina. Com um movimento uniforme para frente, fazer a lâmina deslizar
sobre a outra. Ela arrastará atrás de si o sangue que se espalhará em fina camada. Agitar
a lâmina no ar até o esfregaço secar completamente e identificá-la com lápis.

D) MÉTODOS DE COLORAÇÃO
Colocar 15 gotas do corante (LEISHMAN, ROSENFELD ou WRIGHT) sobre a lâmina por
3-5 minutos. Em seguida adicionar 15 gotas de água destilada e/ou solução tamponada.
Após 15 minutos escorrer o corante e lavar em água corrente, secar e examinar ao
microscópio em objetiva de imersão. Alternativa: uso de corantes rápidos, tipo panótico,
com coloração sequencial rápida em três soluções.

E) LEITURA DO EXAME DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS:

Fazer a contagem diferencial dos leucócitos identificando cada célula. Para isso contar
100 leucócitos e calcular a porcentagem de cada uma delas.
F) CONTAGEM GLOBAL DE LEUCÓCITOS:
Em câmara de Neubauer: Pipetar 400 microlitros de Türk ou ácido acético a 4% em tubo
de ensaio; Pipetar 20 microlitros de sangue homogeneizado; Limpar o excesso de
sangue da parte externa da ponteira com gaze ou papel e adicionar o sangue no tubo de
ensaio com o diluente; Montar a câmara de Neubauer e preencher um dos lados com a
diluição homogeneizada; Contar os 4 quadrados laterais maiores e multiplicar por 50.
CÁLCULO DA CONTAGEM GLOBAL DE LEUCÓCITOS:
Área de cada quadrado maior: 1mm2 Profundidade: 1/10mm Diluição: 1:20.
Número total de leucócitos =
Número de células contadas x 10 (altura) x 20 (diluição) / 4 (número de quadrados)
no total de leucócitos x 50 = no total de leucócitos/mm3 (ou microlitro – L) de sangue.

G) CONTAGEM GLOBAL DE ERITRÓCITOS:

Proceder da mesma maneira, porém utilizar 4 mL (4.000 microlitros) de diluente: -
solução de Marcano (carnívoros e equinos), - Gower (ruminantes), ou - Sol. Fisiológica
(se realizada a contagem imediata). Contar as hemácias de 5 quadrados médios centrais.
Somar o resultado de cada um dos 5 quadrados médios e multiplicar por 10.000.
CÁLCULO DA CONTAGEM GLOBAL DE ERITRÓCITOS:
Área do quadrado central maior: 1mm2 Profundidade: 1/10mm Diluição: 1:200.
Número total de hemácias =
No de células contadas x 10 (altura) x 200 (diluição) x 5 (5 de 25 quadrados médios)
no de hemácias contadas x 10.000 = no total de hemácias/L) de sangue.

H) HEMATÓCRITO OU VOLUME GLOBULAR

Método do Micro-Hematócrito: Encher 2/3 de um capilar com sangue mais
anticoagulante homogeneizado. Limpar a extremidade com gaze ou papel higiênico.
Fechar a extremidade do tubo na chama, protegendo o sangue com o dedo e
rotacionando lentamente o tubo. Também pode-se utilizar massa apropriada. Centrifugar
por 5 minutos a 11.500rpm. Fazer a leitura no cartão especial alinhando o início da coluna
de hemácias em zero e o final do plasma em 100% e obtenha o resultado em
porcentagem. OBS: Pode-se usar um tubo heparinizado colhendo-se o sangue
diretamente do animal, porém o resultado pode ser cerca de 3% maior que com EDTA.

I) - DETERMINAÇÃO DA HEMOGLOBINA (técnica espectrofotométrica)

MÉTODO DE CIANOMETAHEMOGLOBINA. Adicionar 20 l de sangue homogeneizado
num tubo com 5 mL de solução de Drabkin, agitar, após 5 minutos fazer a leitura
colorimétrica em comprimento de onda de 540 nm, usando a solução de Drabkin como
branco. Anotar a leitura e compará-la com uma solução padrão.

J) - Determinação da Proteína total plasmática e do fibrinogênio

1. Preencher dois capilares com sangue homogeneizado. Proceder como na leitura do
microhematócrito (até o item 4). Quebrar o primeiro capilar acima da linha das células,
após a leitura do Ht/VG%. Retirar todos os possíveis fragmentos de vidro do capilar.
Desprezar o plasma sobre o visor do refratômetro.(1ª leitura = PPT). Colocar o segundo
capilar em banho-maria a 56-58°C por 3’ (desnaturação do FBG) e centrifugar a
12.000rpm por 3’. Ler novamente a proteína no refratômetro (2ª leitura = PPT – FBG)

FBG (g/dL) = PPT – 2ª leitura

 Esfregaço ideal para o exame diferencial de leucócitos

Câmara de Neubauer. Local de preenchimento com a diluição.

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