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ROTEIRO AULAS PRTICAS

Professora: Cssia Calixto de Campos Martins


Turma: 9 SEM de Frmacia 2017
UNOPAR

1 AULA PRTICA
Obteno de soro e plasma

INTRODUO:
O sangue representa o mais importante lquido do organismo e duas
partes o constituem: a slida e a liquida. A primeira formada pelos elementos
figurados, leuccitos, plaquetas e eritrcitos e a segunda pelo plasma, que est
limitado ao sistema vascular.
A obteno do plasma se faz retirando o sangue com anticoagulante e
separando-se os glbulos por centrifugao ou sedimentao.
O plasma uma soluo aquosa contendo protenas plasmticas, sais
inorgnicos, compostos orgnicos diversos, tais como aminocidos, vitaminas,
hormnios, lipoprotenas, etc.
Entre as protenas plasmticas, podemos citar a albumina, as alfa, beta
e gamaglobulinas e o fibrinognio. A albumina, mais abundante, representa um
papel fundamental na manuteno da presso osmtica do sangue, no grupo
das globulinas esto os anticorpos (imunoglobulinas), sendo o fibrinognio
necessrio para a formao da fibrina, componentes final da coagulao
sangunea.
Diversas substncias insolveis ou pouco solveis em gua, como os
lipdios, podem ser transportadas pelo plasma devido ao fato de se cominarem
com as albuminas, alfa e beta globulinas.
O soro se obtm aps coagulao do sangue. O coagulo ao se retrair
prende os glbulos em suas malhas de fibrina e pela retrao deixa sair um
liquido: o soro.
A composio do plasma e soro diferente. Neste inexistem, ou existem
em pequena quantidade, determinadas substancias que foram utilizadas para
coagulao sangunea.
Vrios fatores intervm no fenmeno da coagulao sangunea. Este
fenmeno se daria segundo o mecanismo intrnseco e extrnseco.
O processo de coagulao do sangue pode ser retardado ou evitado
mediante o emprego de anticoagulantes, que podem ser empregados in vitro.
In vivo ou em ambas as situaes que atuam interferindo em algum ponto do
processo de coagulao como por exemplo: os oxalatos que precipitam o on
clcio ou a heparina que impede a ativao da protrombina.
A coletas do sangue para exames hematolgicos, qumicos e para
provas sorolgicas deve ser efetuado em jejum, pela manh e o sangue
empregado nestas pesquisas, geralmente o sangue venoso.

MATERIAL E MTODOS
1) PUNAO VENOSA
- Garrote
- Seringa de 10.0 ml (estril)
- Agulhas de 25 x 8
- Algodo hidrfilo
- lcool
- Tubos de ensaio
- Estantes para tubo
- Canho para tubo vacuo
- Tubos vcuo contendo anticoagulante e sem anticoagulante
- Laminas para esfregao
- Colorao May-Grumwald-Giemsa.
- Microscpio
- leo de imerso
- Descarpak e lixo hospitalar

Procedimento: Fazer a antissepsia da dobra do cotovelo com lcool, deixar


secar. Colocar o garrote em torno do brao, cerca de 5 cm acima da dobra do
cotovelo, introduzir a agulha na veia mediana, baslica ou ceflica, atingida a
veia aspirar 10.0 ml de sangue. Retirar o garrote e, em seguida a agulha.
Comprimir local puncionado com algodo embebido em lcool. Colocar uma
gota de sangue em uma lamina para confeccionar o esfregao. Retirar a agulha
da seringa e transferir 5 ml de sangue para o tubo contendo anticoagulante e 5
ml para o tubo sem anticoagulante.

2) OBTENO E COAGULAO DO PLASMA.


MATERIAL:
- Tubo de hemlise anticoagulante e 5 ml de sangue
- Centrfuga
- Pipeta Pasteur
- Tube de hemlise
- Soluo de cloreto de clcio a 0,5%
- Banho Maria a 37 C

Procedimento: Tomar o tubo de hemlise contendo 5 ml de sangue com


anticoagulante e centrifugar a 2000 r.p.m. por 10 min.
- Separar o sobrenadante por aspirao, usando pipeta Pasteur e colocar em
outro tubo de hemlise.
- Adicionar a este tubo 5 gotas de soluo de cloreto de clcio a 0,5% levar ao
banho Maria a 37 C. Agitar e anotar o tempo gasto para ocorrer a
coagulao.

3) OBTENO DO SORO
MATERIAL:
- Tubo de 16 x 160 contendo sangue sem anticoagulante.
- Centrfuga
- Pipeta Pasteur
- Tubo de hemlise

Procedimento: Deixar o tubo de ensaio com o sangue inclinado, temperatura


ambiente por 2 horas; para coagulao.
- Aps a retrao do cogulo usando pipeta Pasteur descolar o cogulo e
transferir a para lquida para o tubo de hemlise.
2 AULA PRTICA

1) Determinao do Hematcrito

Mtodo: Microcentrifugao

Princpio: O sangue centrifugado em tubos capilares a uma fora centrifuga


elevada para permitir o empacotamento das hemcias. O volume dos
eritrcitos depende da velocidade de centrifugao, do raio da centrifuga, do
comprimento da coluna do sangue e do tempo de centrifugao.

Amostra: Sangue total colhido em EDTA

Material:
Sangue total colhido na hora
Tubo capilar
Centrifuga de microhematcrito
Bico de Bunsen
Rgua de leitura de hematcrito

Procedimento:
Encher o tubo capilar com sangue previamente homogeneizado at 2/3 do tubo
Fechar a extremidade sem sangue com massa especifica ou aquecimento em
chama
Centrifugar 3 a 5 minutos (o tempo dever ser determinado atravs da
padronizao para cada centrifuga)
Realizar a leitura em tabela prpria
Fazer o menisco inferior coincidir com a linha zera e o menisco superior com a
linha 100%
Determinar a linha de separao entre a coluna de hemcias sedimentadas e o
plasma, desprezando a fina camada de leuccitos e plaquetas que se formam
nesta regio
O resultado expresso em %, e os valores de referncias variam com o gnero

Valores de Referencias
Hematcrito %
RN at 3m 1 1a3 3a5 5 a 10 10 a 16 Acima de 16
15 dias ano anos anos anos anos Fem Mas
52 33-41 33-41 33-41 33-41 35-52 37-47 40-54
2) Dosagem de hemoglobina

Objetivo: Realizar dosagem de hemoglobina no sangue

Mtodo: cianometahemoglobina

Princpio: O sangue diludo numa soluo de ferricianeto de potssio e de


cianeto de potssio. O ferricianeto de potssio oxida o ferro da hemoglobina
transformando-o de estado ferroso para estado frrico, formando a
metahemoglobina. A metahemoglobina combina com o cianeto de potssio
formando cianeto de metahemoglobina, um pigmento estvel, que tem no
mximo de absoro amplo num comprimento de onda de 540nm.

Amostra: Sangue total colhido em EDTA

Material:
Sangue total colhido na hora
Pipeta de 2,5 mL
Micropipeta 0,01mL
Pra
Soluo de Drabkin
Espectofotmetro
Tubos de ensaio 12x75mm
Padro de hemoglobina

Reagentes:
Soluo de Drabkin
Bicardonato de sdio ------ 1 g
Cianeto de potssio -------- 0,05g
Ferrocianeto de potssio 0,20g
Agua destilada qsp --------- 1000mL
Obs: mantes em frasco escuro na geladeira e manipular com cuidado por
conter cianeto (veneno). Aps o preparo possui validade de 1 ms

Procedimento:
Branco Padro Teste
Soluo de Drabkin 2,5 mL 2,5mL 2,5mL
Padro - 0,01mL -
Amostra homogeneizada - - 0,01mL
gua destilada 2,5 mL
Homogeneizar e deixar os tubos em repouso durante 5 minutos
Ler a D.O. no espectrofotmetro em 540nm, zerando com o tubo branco
Valores de referncia
Hemoglobina g/dL
RN 3m 1a3 3a5 5 a 10 10 a 16 Acima de 16
at 15 1 ano anos anos anos anos Fem Mas
dias
17 10,3- 10,6- 11,0- 11,5- 11,5- 11,5- 12,8-
12,7 13,0 14,5 14,0 15,0 16,0 16,9
3) Contagem total de hemcias

A cmara de Neubauer tambm conhecida como hemocitmetro e


consiste em uma pea de vidro espessa contendo um rebaixamento na parte
separa que separado das partes laterais por duas pequenas valetas. Na parte
central (que pode ser espelhada), est gravado o reticulo. A profundidade da
cmara de 0,1mm sendo, ento o volume total da cmara de 0,9mm 3

O reticulo da Cmara formado por 9 quadrantes de 1,0mm 3 de rea e


portanto tem 9mm3 de superfcie. A profundidade da cmara de 0,1mm
sendo, ento, o volume total da cmara de 0,9mm 3
Cada um dos 9 quadrados subdividido. Os quatro quadrados externo
so divididos em 16 pequeno quadrados. A formula geral para a contagem de
clulas na cmara :

Clulas /mm3 = clulas contadas x diluio da amostra x 10


N de quadrantes

reas vermelhas para contagem das hemcias

Contagem de hemcias

Mtodo: manual de Dacie

Princpio: diluio do sangue total em soluo isotnica direta ao microscpio


em cmara de Neubauer

Amostra: sangue total colhido em EDTA

Material:
Sangue total colhido na hora
Pipeta 2,0 mL
Micropipeta 0,01 mL
Pra
Micrscopio
Diluente da Dacie
Cmara de Neubauer
Laminula
Cmara mida
Tubos de ensaios 12x75

Reagentes
Diluente da Dacie: (citrato trissdico)
Citrato trissdico -------- 31,8g
Formol 4% ---------------- 10 mL
gua destilada qsp ----- 1000mL

Procedimento
Em um tubo de ensaio diluir 0,01mL de sangue em 2,0 ml de diluente de Dacie
Homogeneizar e encher a cmara de Neubauer
Repousar durante 5 minutos em cmara mida
Contar em objetiva de 40x 5 dos 25 quadrantes do quadrado central da cmara
de newbauer

Clculo
Hemcias/mm3 = n de hemcias contatas nos 5 quadrantes x fator de diluio
x 10.000

Valores de referencia
Hemcias (milhes/mm3)

RN 3m 1a3 3a5 5 a 10 10 a 16 Acima de 16


at 15 1 ano anos anos anos anos Fem Mas
dias
5,2 4,1- 4,0- 4,0- 4,0- 4,0-5,5 4,0- 4,5-
4,9 5,1 5,1 5,1 5,4 6,0
4) Calcular os ndices hematimtricos

Ao ndices hematimtricos descrevem as caractersticas da hemcia e


so clinicamente uteis na classificao de anormalidades que envolver a serie
vermelha, embora esses valores representem caractersticas celulares medias,
portanto os ndices em si so insuficientes para classificar o tamanho celular,
contedo de hemoglobina e assim, um exame correte deve tambm incluir um
estado microscpio minucioso da lamina do sangue perifrico.
So eles: Volume corpuscular mdio (VCM)
Hemoglobina corpuscular mdia (HCM)
Concentrao hemoglobina corpuscular mdia (CHCM)

Os valores variam de acordo com

VCM= Ht x 10
He

HCM= Hb x 10
He

CHCM= Hb x 100
Ht

Valores de referencia

VCM: 84 a 99mm3.

HCM: 26 a 32 pg.

CHCM: 31 a 36 g/dl.

3 AULA PRTICA
Anlise morfolgica das hemcias

Amostra: Sangue colhido em EDTA


Material: Sangue
Micropipeta 0,02 mL
Lminas
Lmina matriz
Colorao de May Grunwald-Giemsa
lcool e algodo para limpar as lminas
Procedimento: Limpar as lminas com lcool e algodo e colocar 0,02 mL de
sangue e deslizar a lminas matriz (ngulo 45) sobre o sangue. Observar as
hemcias em microscpio

1) Teste de Falcizao
Amostra: Sangue colhido em EDTA
Material: Sangue
Micropipeta 0,1mL
Lminas
Esmalte colorido
Soluo de metabissulfito 2%
Tubos de ensaio 12x75mm
Cmara mida
Lamnula
Procedimento: Misture 0,1mL de sangue em 0,1 mL de Metabissulfito de
Sdio, e coloque uma ou duas gotas da soluo em uma lmina e cubra com
uma lamnula sem deixar bolhas, em seguida vede as bordas da lamnula com
esmalte. Repouso por 30 minutos e examine em microscpio.

Reagente:
Metabissulfito de sdio ---------------- 0,05g
gua destilada --------------------------- 2,5 mL
Soluo deve ser preparada no momento do uso