Análise de Frações de Fósforo – Passo a Passo do Laboratório LASP

Adaptado por Isadora Medina e Cecília Braga

1. Ao coletar amostras de folhas para fazer essa análise, elas devem ser
mantidas no nitrogênio líquido e posteriormente liofilizadas (lab.
Floricultura). Após a liofilização, deve-se pesar 50 mg por amostra para
dar continuidade com a análise.
2. Macerar, com N2 líquido, as amostras pesadas até que viram uma
pastinha (pellet) que deve ser transferida para os tubos de eppendorf
devidamente identificados.
3. Adicionar 1mL de CMF frio aos eppendorfs já contendo o pellet e passa-
los pelo vortex.
4. Centrifugar as amostras a 5000 rpm 4°C por 10 minutos (lembre-se de
ligar a centrifuga antes, para que atinja essa temperatura).
5. Transferir o sobrenadante para tubos de falcon (devidamente
identificados).
6. Repetir os passos 4 e 5 duas vezes. Ao final dessa etapa, o tubo deve
ter 3 mL.
7. Adicionar 1,26 mL de CMW aos eppendorfs. Levar ao vortex para
homogeneizar.
8. Centrifugar as amostras a 5000 rpm 4°C por 10 minutos e transferir o
sobrenadante para os tubos de falcon que já contêm 3 mL.
9. Repetir passos 7 e 8 duas vezes. Ao final dessa etapa, o volume deve
ser de 6,78 mL [3mL CMF + 3,78 mL CMW]).
10. Adicionar 1,9 mL de CWW nos tubos de falcon. Homogeneizar os tubos
invertendo sem levar ao vortex.
11. Centrifugar as amostras a 4000 rpm 4°C por 10 minutos. (lembre-se de
trocar o cabeçote da centrífuga de eppendorfs para o de tubos de
falcon).
12. Vão haver duas camadas no tubo de falcon após a centrifugação; uma
camada superior aquosa, que será destinada ao P metabólico e uma
camada inferior verde que é o P lipídico.
13. Transfira a camada superior para novos tubos de falcon intitulados P
metabólico (PMet) e a camada inferior para um tubo limpo de
biodigestão (que deve ser intitulado Plip). Lave os tubos anteriores com
1 mL de CMW e centrifugue-os novamente a 4000 rpm 4°C por 10
minutos. Outras duas camadas, mais fracas em cores, vão aparecer.
Transfira cada camada para seu respectivo frasco. Se houver algum
precipitado, este volta para os eppendorfs.
14. Coloque os frascos de Biodigestão na estufa, a 50°, para evaporar.
*aqui termina o primeiro dia da extração. Mantenha os frascos na geladeira
para continuar no dia seguinte*
15. Retire quaisquer líquidos residuais que hajam nos eppendorfs usando
uma pipeta. (Dica: 1mL na pipeta azul).
16. Adicione 1mL de Metanol 85% nos eppendorfs e leve ao vortex para
homogeneizar. Após isso, centrifugar as amostras a 5000 rpm 4°C por
10 minutos.
17. Tire o sobrenadante e coloque nos tubos de falcon de Pmet.
18. Novamente, retire quaisquer líquidos residuais que hajam nos
eppendorfs usando uma pipeta.
19. Adicione 1mL de TCA 5% ao eppendorf, leve ao vortex e depois leve ao
shaker e deixe-os lá, em pé (use os aparadores pequenos) por 1 hora.
[essa etapa é feita na floricultura]
[Aproveite e ligue o banho maria, que será necessário na etapa 24]
20. Centrifugar as amostras a 5000 rpm 4°C por 10 minutos e transferir o
sobrenadante para os tubos de falcon de Pmet.
21. Repetir os passos 19 e 20. (Total: 2mL TCA 5%, 2 horas no shaker).
22. Complete o volume de 10 mL dos tubos de Pmet com água deionizada.
23. Pegue 5 mL e dos tubos de Pmet e transfira para o fraco de biodigestão
identificado como Pmet. (Os demais 5 mL serão armazenados para
serem usados como Pinorgânico, caso a soma das frações seja inferior
a 80% do P total medido por método tradicional).
24. Adicione 1 mL de TCA 2,5% no eppendorf e leve ao vortex. Aqueça-os
em banho maria (ligue-o cerca de duas horas antes) a 95°C por uma
hora, invertendo os eppendorfs a cada vinte minutos. Lembre de tampar
os eppendorfs com parafilm. Para evitar que explodam, faça um
pequeno furo com uma pinça nas tampas. Quando a 1 hora acabar,
centrifugue as amostras a 5000 rpm 4°C por 10 minutos e transfira o
sobrenadante para novos tubos de biodigestão intitulados PAcidNuc.(P
ácido Nucleico).
25. Repita o passo 24 duas vezes. (Total: 3mL de TCA 2,5, 3 horas de
banho.)
26. Adicione 1mL de TCA 2,5% ao eppendorf com o pellet residual e
transfira todo o seu conteúdo para um novo frasco de biodigestão,
identificado como Presidual.
27. Coloque as três frações para evaporar na estufa a 50° por três dias.
28. Faça a leitura das frações já evaporadas no espectrofotômetro.