Curso Tcnico em Biotecnologia

Disciplina de Imunologia


ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY ELISA
Indireto
Protocolo
1- Diluir a albumina em tampo carbonato-bicarbonato (TCB) a concentrao final de 10
g/mL e colocar 100 L por poo da placa de 96 poos. Incubar por 2 horas a 37C, em
cmara mida.
2- Em seguida lavar duas vezes a placa em PBS para proceder a retirada dos antgenos no
ligados.
3- Colocar 100 L de soluo de bloqueio e incubar por 1 hora a temperatura ambiente ou
overnight a 4C.
4- Em seguida lavar duas vezes a placa em PBS.
5- Diluir os soros a serem testados, em duplicata, de 1:2 a 1:256 em PBS com 0,05% de
Tween-20 e 1% de leite em p desnatado (volume final em cada poo de 100 L). Incubar
por 45 minutos a 37C.
6- Em seguida lavar trs vezes a placa em PBS.
7- Diluir o anticorpo secundrio (conjugado) em PBS com 0,5% de Tween-20 e 1% de leite em
p desnatado e colocar 100 L por poo. Incubar por 30 minutos.
8- Em seguida lavar trs vezes a placa em PBS.
9- Adicionar 100 L de tampo de substrato/TMB e incubar por at 30 min no escuro (olhar a
placa a cada 5 minutos). Aps a incubao acrescentar 100 L de soluo de parada.
10- Fazer a analise visual ou determinar a densidade ptica a 450 nm em um leitor de ELISA.

Tampo carbonato-bicarbonato 0,06 M. pH 9,6 (TCB): para sensibilizar a placa de ELISA
Soluo A:
Bicarbonato 5,0406g
H
2
O qsp 1000ml

Soluo B:
Carbonato 6,359g
H
2
O qsp 1000ml
Adicionar em um Becker 1 parte de soluo B e 4 partes de soluo A. Ou ajustar o pH para 9,6,
adicionando soluo A caso esteja acima e soluo B se abaixo de 9,6.