1.2. Protocolo de quantificação de proteínas totais pelo método de Bradford.

O ensaio de Bradford será realizado em placa de ELISA de 96 poços, consistindo num volume
final de 200 ul para cada poço da placa.
- Prepara solução estoque de BSA 10 mg/ml. Diluir 10 vezes a solução para efetuar as
diluições para preparar a curva de calibração.
- Preparar curva padrão com as seguintes concentrações de BSA: 0,125 ug/ml; 0,25 ug/ml;
0,5 ug/ml; 0,75 ug/ml; e 1,0 ug/ml. Diluir BSA em tampão de extração de proteínas. Aplicar
5ul de amostra de proteína na placa.
- Após aplicar as amostras de proteína na placa, em triplicata, adicionar 195 ul de reagente
Bradford. Lembrar-se de aplicar o branco, no caso o tampão de extração de proteínas (seguir
mesma mistura que as proteínas: 5 ul de tampão + 195 ul de reagente Bradford).
- Incubar as amostras, sob leve agitação, por 5 minutos.
- Efetuar leitura da absorbância no comprimento de onda de 595 nm em espectrofotômetro.
- Construir curva de padronização, com as concentrações de BSA na abscissa e as
absorbâncias médias na ordenada. Plotar no Excel, obtendo equação de ajuste linear.
- Medir a absorbância da amostra do extrato total de proteína (média das triplicatas) e
estimar o valor da concentração de proteínas na amostra (variável “x”) substituindo o valor
da absorbância na equação linear resultante da curva padrão (variável “y”)