UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA

LABORATÓRIO DE BIOQUIMICA
PROF. DRA. SÔNIA SALGUEIRO MACHADO

JOSÉ RONALDO DE ARAUJO

PRATICA 01: QUANTIFICAÇÃO DE PROTÉINAS - MÉTODO DE

BRADFORD

Maceió/AL
2021
 JOSÉ RONALDO DE ARAUJO

PRATICA 01: QUANTIFICAÇÃO DE PROTÉINAS - MÉTODO DE

BRADFORD

Relatório de aula prática apresentando ao

Curso de graduação em Química
Tecnológica e Industrial, da Universidade
Federal de Alagoas, como requisito para
obtenção de nota da disciplina de
Laboratório de Bioquímica.

Maceió/AL
2021
1. Introdução

Os métodos espectrofotométricos utilizando albumina do soro bovino (BSA) como

referência são os mais usados para determinação de proteínas, visto ser impraticável na
rotina laboratorial o uso de procedimentos analíticos demorados e caros, como a análise
de aminoácidos.1
O método Bradford é baseado na ligação do corante azul de Coomassie brilhante G-
250 (CBBG) às proteínas, sendo capaz de detectar concentrações de 1 μg mL-1. Tem
como vantagens a rapidez, o custo, a estabilidade e a compatibilidade com agentes
redutores, mas apresenta resposta anômala para peptídeos de massa molar baixa (< 67.000
uma). É indicado principalmente para amostras contendo resíduos de arginina, lisina e
histidina.1 É o método mais usado para dosagem de proteínas totais, com faixa de
detecção entre 20 e 2000 μg mL-1, a dosagem de proteínas permite a quantificação exata
da concentração de proteínas numa determinada amostra vegetal; sendo uma etapa
fundamental devido à necessidade e se utilizar uma concentração conhecida nas etapas
subsequentes. Além de altera a absorbância de 465 nm para 595 nm causando visível
mudança de coloração de castanha para tons de azul a depender da concentração de
proteína na amostra.
2. Objetivo do Experimento

Construir uma curva padrão de albumina bovina sérica e realizar dosagem a

concentração de proteína em diferentes extratos oriundos de vegetais, animais ou
microorganismo.

3. Reagentes, vidrarias e material usado

3.1. Coomassie Brilliant Blue G 250 (Sigma 98%);

3.2. Etanol 95%;
3.3. Ácido Fosfórico 85%(v/v);
3.4. Água Mili-Q;
3.5. Espectrômetro;
3.6. Micropipetas;
3.7. Cubeta de plástico ou vidro;
3.8. Erlenmeyer;
3.9. Agitador magnético;
3.10. Backer;
3.11. Balança analítica.

4. Procedimento (Metodologia)

4.1. Preparo do reagente de Bradford

4.1.1. Pesar 102,4 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250 (Sigma 98%);

4.1.2. Adicionar 50 mL de Etanol 95% ao coomassie blue em um Becker de 100
mL coberto com papel alumínio;
4.1.3. Agitar com agitador magnético por 1 hora;
4.1.4. Transferir a solução para um erlenmeyer de 1000 mL (protegido da luz
com papel alumínio);
4.1.5. Adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85%;
4.1.6. Completar o volume para 1000 mL com água Mili-Q;
4.1.7. Agitar (homogeinizar);
4.1.8. Filtra por 2 vezes usando papel filtro waltman No.1no escuro
OBS: Solução deve ficar em vidro âmbar ou coberto com papel alumínio

4.2. Preparo da Curva Padrão

4.2.1. Preparo do gradiente de concentrações de BSA a partir da solução

padrão de BSA (Diluição da solução de BSA (albumina bovina sérica):
1mg/mL em Mili-Q water (Solução padrão de BSA), conforme tabela a
seguir:
 Tabela 01: Diluições de BSA

Alíquotas da
Concentração final
Tubas com diluição solução padrão de Água Mili-Q (µL)
de BSA
BSA (µL)
1 50 950 5 µg/100µL
2 100 900 10 µg/100µL
3 150 850 15 µg/100µL
4 200 800 20 µg/100µL
5 250 750 25 µg/100µL
6 300 700 30 µg/100µL
7 350 650 35 µg/100µL
8 400 600 40 µg/100µL
9 450 550 45 µg/100µL
10 500 500 50 µg/100µL
11 550 450 55 µg/100µL
12 600 400 60 µg/100µL

4.2.2. Esquema dos pontos de curva

Tabela 02: Pontos para construção da curva padrão

Aliquota Absorbância
Conc.
Conc. BSA das Comassie Água (595nm)
Cubeta BSA na
(µg/100µL) diluições (µL) (µL)
curva
(µL)
1ª 2ª 3ª Média

Branco - - 2500 100

1 5 µg/100µL 100 2500 -

10
2 100 2500 -
µg/100µL
15
3 100 2500 -
µg/100µL
20
4 100 2500 -
µg/100µL
25
5 100 2500 -
µg/100µL
30
6 100 2500 -
µg/100µL
35
7 100 2500 -
µg/100µL
 40
8 100 2500 -
µg/100µL
45
9 100 2500 -
µg/100µL
50
10 100 2500 -
µg/100µL
55
11 100 2500 -
µg/100µL
60
12 100 2500 -
µg/100µL

4.2.3. Construção da curva padrão

4.2.3.1. Utilizando as micropipetas de acordo com o volume pretendido,
conforme tabela anterior, adicionar água destilada, BSA (dissolvido em
água para concentração de 1 µg/µL) e o reagente de Bradford nas
proporções sugeridas na tabela 1;
4.2.3.2. Após o preparo das diluições, tirar alíquotas para a quantificação
de cada ponto da curva;
ETAPA 1: Após a preparação das soluções de BSA em diferentes
concentrações, agite-as no vórtex e leia 15 min no espectrofotômetro no
comprimento de onda 595 nm em triplicatas.
4.2.3.3. Após mesclar todos os itens constantes na tabela 2, homogeneíze
e deixar em repouso por 5 min;
4.2.3.4. A calibração do espectrofotômetro para o valor da absorbância zero
é feita usando água destilada;
4.2.3.5. Em seguida colocar o conteúdo do tubo nº 1 na cubeta, e registrar
a leitura de absorbância, realizar esse procedimento para todos os tubos
de 2 a 12;
4.2.3.6. Com os valores de absorbância obtidos preencher a tabela 2 e
construir a curva padrão como base em BSA.
Tabela 03: Resultados de absorbância e concentração

Absorbância
(595nm)
C (µg/100µL)

Abs 1 Abs 2 Abs 3 Média Desvio

1 1,25 0,019 0,014 0,028 0,020333 0,007095

2 2,5 0,04 0,043 0,056 0,046333 0,008505

3 5 0,115 0,095 0,128 0,112667 0,016623

4 10 0,183 0,213 0,178 0,191333 0,01893

5 15 0,227 0,256 0,248 0,243667 0,014978

6 20 0,267 0,292 0,326 0,295 0,029614

7 25 0,428 0,407 0,406 0,413667 0,012423

8 30 0,5 0,531 0,514 0,515 0,015524

9 35 0,635 0,602 0,611 0,616 0,017059

10 40 0,648 0,651 0,629 0,642667 0,01193

11 45 0,716 0,716 0,722 0,718 0,003464

12 50 0,766 0,782 0,765 0,771 0,009539

13 55 0,786 0,825 0,848 0,819667 0,031342

14 60 0,858 0,867 0,881 0,868667 0,01159

 Curva Padrão de BSA
1
0,9 y = 0,0148x + 0,0312
R² = 0,9888
0,8
0,7
ABS a 595 nm

0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 10 20 30 40 50 60 70
C (ug/100uL)

Fator de diluição da amostra = 1:25

ABS = 0,437

0,437 = 0,0148 𝑋 + 0,0312

0,437 − 0,0312 = 0,0148 𝑋
𝑋 = 27,41 µ𝑔/µ𝐿
𝑋 = 685,47 µ𝑔/µ𝐿
𝑋 = 6,85 𝑚𝑔/µ𝐿
5. Resultados e Discussões
A construção do gráfico com base nas absorbâncias obtidas no experimento, foi
possível notar que a curva apresentou os pontos de forma crescente em relação ao
aumento da concentração de proteína nas amostras e os pontos estão bem próximos ou
exatamente da reta, ou seja, garantindo a precisão e exatidão na construção da curva
padrão.
Conforme esperando o corante Comassie brilliant blue BG-250, formou complexo
com a proteína presente na amostra e conforme a presença/concentração de proteína
aumenta na amostra maior a tonalidade do azul é no complexo formado.
A interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém
aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre
a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do
equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm2.
6. Conclusão
Diante dos resultados obtidos na pratica e descrito neste relatório, conclui-se que o
método de Bradford é eficaz, com baixo custo e com ótima sensibilidade para
quantificação de proteínas, sendo uma excelente opção para uso em laboratório por ter
uma curta duração, ser bem perceptível e possui poucos interferentes. Além de ter
construído a curva padrão.
7. Referências Bibliográficas

Roteiro da aula prática, fornecido pela professora;

1
http://static.sites.sbq.org.br/rvq.sbq.org.br/pdf/v9n6a27.pdf;
2
https://www.scielo.br/j/qn/a/pnCxFMPrQkjW5vj38BT5kbG/?lang=pt;