UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

RELATÓRIO PRÁTICA 6 CINÉTICA ENZIMÁTICA: EFEITO DE INIBIDORES

SOBRE A VELOCIDADE DE REAÇÃO.

Alunos: Denise Junqueira Viana 11320172

Luís Henrique Biachi 11848271
Maria Vitória Fonseca 11856277

7,6/9,0

Ribeirão Preto 2023

Objetivo: 0,5/0,5
Observar a inibição da atividade da enzima pelo fosfato de sódio, bem como determinar o
tipo de inibição e calcular a constante de dissociação Ki.

Procedimento experimental:

Cada grupo deverá preparar 5 fileiras de 10 tubos de ensaio (uma fileira sendo com
os brancos, outra sem inibidor, e 3 com inibidor em 3 diferentes concentrações (0,5
mmol/L; 1,5mmol/L e 3,0mmol/L)
Nas três baterias contendo o inibidor, o fosfato de sódio estará presente numa
concentração de 0,5; 1,5 ou 3,0 mmol/L, sendo mantida a mesma concentração nos 10
tubos da bateria.

Em todas as baterias, as concentrações de tampão citrato, pH 5,5 (100 mmol/L) e enzima

(10 ng/tubo, exceto nos brancos) serão mantidas constantes, enquanto a concentração
de substrato deverá variar conforme citado anteriormente. O volume final de cada tubo
será de 1 mL.
.
Nos tubos da fileira de brancos (sem enzima e sem inibidor) adicionamos um volume de
água igual à soma dos volumes de enzima e fosfato adicionados aos demais.
Todas as reações foram finalizadas com 1,0 mL de NaOH 1,0 mol/L.
Para este experimento serão fornecidas as seguintes soluções estoque

: * Tampão citrato 200 mmol/L, pH 5,5

* fosfato de sódio 5 mmol/L, 15 mmol/L e 30 mmol/L

* PNFF 20 mmol/L, 2 mmol/L e 1 mmol/L.

* fosfatase ácida 100 ng/mL

Adicionamos o volume de enzima calculado, aos tubos das 3 fileiras, em intervalos

regulares de 1 minuto. Higienizamos, suavemente, o conteúdo dos tubos e deixamos a
reação se processar durante exatamente 30 minutos à temperatura ambiente.

Depois, interrompemos a reação pela adição de 1,0 mL de NaOH 1,0 mol/L a cada tubo,
com o mesmo intervalo de 1 minuto entre os tubos agitando vigorosamente. Efetuamos,
em seguida, a leitura de absorbância de cada tubo em 410 nm, utilizando o branco
correspondente.

Resultados e discussões

Cálculo das soluções estoque

-> Tampão citrato 200 mMol/L, pH 5,5.

Concentração final x Volume final = Concentração inicial X Volume inicial

100 mMol/L x 1mL = 200 mMol/L x Y

Y= 0,5 mL ou 500 µL
-> Fosfatase ácida 100 ng/mL

10 ng/mL x 1 mL = 100 ng/mL x Z

Z= 0,1 mL ou 100 µL

-> Fosfato de sódio 5 mMol/L, 15 mMol/L e 30 mMol/L

Em aula prática ficamos com duas concentrações do inibidor, são estas: 1,5
mMol/L e 3 mMol/L. Sendo assim, utilizamos:

Para concentração do inibidor 1,5 mMol/L-> solução estoque 15 mMol/L

1,5 mMol/L x 1 mL = 15 mMol/L x A

A= 0,1 mL ou 100 µL

Para concentração do inibidor 3 mMol/L-> solução estoque 30 mMol/L

3 mMol/L x 1 mL = 30 mMol/L x B

B= 0,1 mL ou 100 µL

-> Para cálculo das concentrações de pNFF foi utilizado a mesma fórmula, porém
a que melhor se encaixasse para a concentração desejada e o volume final
almejado.

exemplo: para o,o5 mMol/L de pNFF

0,05 mMol/L x 1 mL = 1 mMol/L x X

X= 0,05 mL ou 50 µL

-> Completamos com água destilada cada tubo, almejando o volume final de 1
mL.

Usando como modelo a tabela do protocolo experimental da Apostila de

aulas práticas 2023, temos:
 pNFF
TAMPÃO ÁGUA ( (ESTOQUE pNFF ( pNFF FOSFAT Abs. 410
TUBO ( µL) µL) ) µL) (mm) O ENZIMA nm
1 500 450 1 mMol/L 50 0,05 - - BRANCO
2 500 430 1 mMol/L 70 0,07 - - BRANCO
3 500 400 1 mMol/L 100 0,1 - - BRANCO
4 500 425 2 mMol/L 75 0,15 - - BRANCO
5 500 400 2 mMol/L 100 0,2 - - BRANCO
6 500 300 2 mMol/L 200 0,4 - - BRANCO
7 500 250 2 mMol/L 250 0,5 - - BRANCO
8 500 450 20 mMol/L 50 1 - - BRANCO
9 500 400 20 mMol/L 100 2 - - BRANCO
10 500 250 20 mMol/L 250 5 - - BRANCO

Tabela 1. Tabela para confecção dos tubos utilizados como “branco”

pNFF
TAMPÃO ÁGUA ( (ESTOQUE pNFF ( pNFF FOSFAT ENZIMA ( Abs. 410
TUBO ( µL) µL) ) µL) (mm) O µL) nm
1 500 350 1 mMol/L 50 0,05 - 100 0,03
2 500 330 1 mMol/L 70 0,07 - 100 0,01
3 500 300 1 mMol/L 100 0,1 - 100 0,013
4 500 325 2 mMol/L 75 0,15 - 100 0,023
5 500 300 2 mMol/L 100 0,2 - 100 0,018
6 500 200 2 mMol/L 200 0,4 - 100 0,034
7 500 150 2 mMol/L 250 0,5 - 100 0,038
8 500 350 20 mMol/L 50 1 - 100 0,075
9 500 300 20 mMol/L 100 2 - 100 0,129
10 500 150 20 mMol/L 250 5 - 100 0,233

Tabela 2. Tabela utilizada para confecção dos tubos da reação sem inibidor.

pNFF
TAMPÃO ÁGUA ( (ESTOQU pNFF ( pNFF FOSFAT ENZIMA Abs. 410
TUBO ( µL) µL) E) µL) (mm) O ( µL) nm
1 500 1 mMol/L 50 0,05 100 0,018
2 500 1 mMol/L 70 0,07 100 0,02
3 500 1 mMol/L 100 0,1 100 0,016
 4 500 2 mMol/L 75 0,15 100 0,06
5 500 2 mMol/L 100 0,2 100 0,037
6 500 2 mMol/L 200 0,4 100 0,11
7 500 2 mMol/L 250 0,5 100 0,089
8 500 20 mMol/L 50 1 100 0,163
9 500 20 mMol/L 100 2 100 0,298
10 500 20 mMol/L 250 5 100 0,348

Tabela 3. Tabela utilizada para confecção dos tubos da reação com inibidor na
concentração 0,5 mMol/L. Absorbância cedida por outro grupo.

pNFF
TAMPÃO ÁGUA ( (ESTOQU pNFF ( pNFF FOSFAT ENZIMA Abs. 410
TUBO ( µL) µL) E) µL) (mm) O ( µL) ( µL) nm
1 500 250 1 mMol/L 50 0,05 100 100 0,038
2 500 230 1 mMol/L 70 0,07 100 100 0,05
3 500 200 1 mMol/L 100 0,1 100 100 0,064
4 500 225 2 mMol/L 75 0,15 100 100 0,093
5 500 200 2 mMol/L 100 0,2 100 100 0,112
6 500 100 2 mMol/L 200 0,4 100 100 0,183
7 500 50 2 mMol/L 250 0,5 100 100 0,207
8 500 250 20 mMol/L 50 1 100 100 0,293
9 500 200 20 mMol/L 100 2 100 100 0,312
10 500 50 20 mMol/L 250 5 100 100 0,492

Tabela 4. Tabela utilizada para confecção dos tubos da reação com inibidor na
concentração 1,5 mMol/L.

pNFF
TAMPÃO ÁGUA ( (ESTOQU pNFF ( pNFF FOSFAT ENZIMA Abs. 410
TUBO ( µL) µL) E) µL) (mm) O ( µL) ( µL) nm
1 500 250 1 mMol/L 50 0,05 100 100 0,07
2 500 230 1 mMol/L 70 0,07 100 100 0,07
3 500 200 1 mMol/L 100 0,1 100 100 0,09
4 500 225 2 mMol/L 75 0,15 100 100 0,02
5 500 200 2 mMol/L 100 0,2 100 100 0,018
6 500 100 2 mMol/L 200 0,4 100 100 0,032
 7 500 50 2 mMol/L 250 0,5 100 100 0,04
8 500 250 20 mMol/L 50 1 100 100 0,14
9 500 200 20 mMol/L 100 2 100 100 0,099
10 500 50 20 mMol/L 250 5 100 100 0,184

Tabela 5. Tabela utilizada para confecção dos tubos da reação com inibidor na
concentração 3 mMol/L.

1. Calcule a atividade da enzima em U/mg para cada um dos tubos.

Para determinar a atividade enzimática, precisamos saber a quantidade de produto

formada. Para isso, utilizamos a Lei de Lambert-Beer.
A exemplo, utilizaremos o tubo 4 sem inibidor.
𝐴 = Ɛ. 𝑏. 𝑐
Na qual temos,
que ε é a absortividade molar do analito
b é o comprimento do caminho (a distância percorrida pela luz na solução)
c é a concentração do analito.

Desse modo,

−1 −1
𝐶 = 𝐴/ 17600𝑀 𝑐𝑚 𝑥 1 𝑐𝑚

Portanto,

C= 0,023/ 17600 x 1
−6
𝐶 = 1, 31 𝑚𝑜𝑙/𝐿

Passando para µmol,

𝐶 = 1, 31 µ𝑚𝑜𝑙/𝐿

Obtivemos o volume final de 2 mL (1 mL feito como no protocolo apresentado e 1 mL de

NaOH para inativar a reação)

Assim,

𝑛 = 𝐶. 𝑉
𝑛 = 1, 31 𝑥 0, 002 𝐿
𝑛 = 1, 31 𝑥 0, 002 𝐿
𝑛 = 0, 00262 µmol
Como a reação se procedeu durante 30 minutos, temos que a quantidade de produto
formado dividido pelo tempo de reação foi:

𝑉 = 𝑛/ Δ𝑡
𝑉 = 0, 00262µ𝑚𝑜𝑙/ 30 𝑚𝑖𝑛
𝑉 = 0, 00262µ𝑚𝑜𝑙/ 30 𝑚𝑖𝑛
−5
𝑉 = 8, 7 µ𝑚𝑜𝑙/ 𝑚𝑖𝑛

A atividade enzimática em U/ mg é calculada a partir de que; a atividade da enzima é a

razão da velocidade no tubo dividido pela massa de enzima ( mg)

Atv. = v/ m
−5 −6
Atv. = (8, 7 µ𝑚𝑜𝑙/ 𝑚𝑖𝑛) / 1. 10 𝑚𝑔
𝐴𝑡𝑣. = 87 𝑈/ 𝑚𝑔 10.10-6 mg

Em resumo,

Tabela de cálculo da atividade enzimática - Sem adição de inibidor

 Tabela de cálculo da atividade enzimática - Adição de inibidor 0,5 mmol/L cedida por outro
grupo

Tabela de cálculo da atividade enzimática - Adição de inibidor 1,5 mmol/L

Tabela de cálculo da atividade enzimática - Adição de inibidor 3,0 mmol/L

 1,8/2,5

2. Faça a representação dos duplos inversos e determine o tipo de inibição

que está ocorrendo.

Com os resultados em U/mg apresentados nas tabela, conseguimos confeccionar

o gráfico proposto por Lineweaver-Burk, demonstrando a cinética enzimática das
nossas reações.

Tabela para confecção do gráfico de Lineweaver-Burk

Gráfico duplo inverso com representação de Lineweaver-Burk

 Apesar de não conseguirmos resultados satisfatório,’’pela análise do gráfico
acima, percebe-se que a inibição que ocorre é do tipo competitiva, pois o
aumento da concentração de inibidor, resulta em linhas com intercepto no eixo
1/Vmáx, com inclinações diferentes, de forma que vmax é constante (dentro de
margem de erro), e o valor de Km aumenta conforme se aumenta a concentração
de inibidor’’ (VOET,2013)
A partir da literatura, verificamos que o fosfato e o pNFF competem pelo mesmo
sítio ativo da fosfatase ácida. Deste modo, conforme ocorresse o aumento da
concentração de inibidor, uma menor quantidade de produto seria formada.

Método de Lineweaver e Burk para cálculo dos valores de Km e Vmáx,

através da equação de Michaelis-Menten

Correlacionando a equação com a equação da reta, temos que,

Km/ Vmáx é o coeficiente angular e 1/ Vmáx configura-se como coeficiente linear.
Assim,

Para a primeira bateria de tubos ( a qual não consta inibidor)

temos,

y = 761,29x + 5574,8
1/Vmáx = 5574,8
Vmáx = 0,000179 umol/min

Km/Vmáx = 761,29 3,0/3,0

Km = 761,29 . 0,000179
Km = 0,136 mmol/L

Para bateria de tubos na qual a concentração do inibidor é 0,5 mMol/L

y = 814,94x + 1288,2
Vmáx=0,000776 umol/min

km= 0,632 mmol/L

Inibidor na concentração 1,5 mMol/L

y = 315,24x + 747,3
Vmáx= 0,00134 umol/min

km= 0,422 mmol/L

E por fim, inibidor na concentração 3 mMol/L

y = - 26,366x + 6081,9
Vmáx= 0,000164 umol/min

Km/Vmáx = -26,366
km = -26,366 . 0,000164
Km = -0,00432 mmol/L

3. Utilizando a representação de Kmapp x [Inibidor] (mmol/L) determine

graficamente no eixo X (mmol/L) o valor da constante de dissociação do 2,3/3,0
complexo enzima-inibidor (Ki ) em mM.

Concentração inibidor Knapp (mmol/L)

0 0,136
 0,5 0,632

1,5 0,422

3,0 -0,00432

Gráfico da representação de Knapp x [Inibidor].

Configurando o gráfico com os dados acima de Km X Concentração de fosfato,

obtemos a equação da reta, na qual Y= - 0,104x + 0,4264

A partir de que, o valor da constante de dissociação do complexo enzima-inibidor

(Ki) é determinado por:
𝐾𝑖 = 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎𝑟/ 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑔𝑢𝑙𝑎𝑟
𝐾𝑖 = - 4,1 mmol/L

Conclusão

Através dos resultados obtidos conclui-se que possivelmente algumas

condições experimentais não foram satisfeitas, pois era esperado que conforme a
concentração do inibidor fosse aumentando, maior seria a inibição enzimática e
maior a concentração de substrato acumulado e não o contrário. Fato esse
confirmado pela constante de dissociação do complexo enzima-inibidor que
apresentou valor negativo.
Os possíveis erros podem ter sido decorrentes da pipetagem, leitura no
espectrofotômetro, má homogeneização etc.
 Referências: 0,5/0,5

● LEHNINGER, T. M., NELSON, D. L. & COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 6ª

Edição, 2014. Ed. Artmed.
● SKOOG; WEST; HOLLER; CROUCH. Fundamentos de Química Analítica. Trad.
8ª Edição Norte-Americana. Editora Thomson.
● VOET, D. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2013. 4a ed