MÉTODO DE BRADFORD (1976)

1. Preparo do reagente de Bradford

▪ Misturar 100 mg de corante Coomassie Brilliant Blue G 250 + 50 mL de etanol

95% + 100 mL de ácido ortofosfórico 85%.
▪ Manter em agitação constante durante duas horas.
▪ Completar o volume para 1000 mL com água deionizada.
▪ Realizar duas filtrações utilizando a bomba de vácuo.
▪ Este reagente pronto apresenta cor acastanhada clara.
▪ Conserve em frasco escuro.

Observação: Todos os recipientes utilizados no preparo do reagente devem ser envoltos

em papel alumínio, em virtude da sensibilidade do reagente.

2. Curva padrão do reagente de Bradford utilizando soroalbumina bovina

▪ Limpar os tubos a serem utilizados com álcool puro.

▪ Preparar soluções padrão de albumina bovina nas concentrações descritas
nas tabelas 1 e 2 (diluir em água destilada ou cloreto de sódio 0,15M) a partir
de solução estoque de 100 mg/mL e 1000 mg/mL.
▪ Homogeneizar bem as diluições no vortex, uma vez que as concentrações são
muito pequenas.
▪ Adicionar 50 µL de cada concentração de BSA + 1,5mL do reagente de
Bradford. Fazer em triplicata.
▪ Para o tubo branco, adicionar 50 µL de água destilada e 1,5 mL do reagente
de Bradford.
▪ Agitar os tubos e ler em espectrofotômetro, a 595 nm, zerando o aparelho
com o tubo branco.
▪ Traçar a curva de calibração.
Tabela 1: [BSA] 0-100 µg/mL.
Amostras Concentrações de Solução de BSA Solução de NaCl
BSA (µg/mL) 100 µg/mL (µL) 0,15 M (µL)
Branco 0 0 500
1 5 25 475
2 10 50 450
3 20 100 400
4 30 150 350
5 40 200 300
6 50 250 250
7 60 300 200
8 10 350 150
 9 80 400 100
10 90 450 50
11 100 500 0

Tabela 2: [BSA] 0-1000 µg/mL.

Amostras Concentrações de Solução de BSA Solução de NaCl
BSA (µg/mL) 1000 µg/mL (µL) 0,15 M (µL)
Branco 0 0 500
1 50 25 475
2 100 50 450
3 200 100 400
4 300 150 350
5 400 200 300
6 500 250 250
7 600 300 200
8 700 350 150
9 800 400 100
10 900 450 50
11 1000 500 0

Observações:

1. Solução Estoque de BSA

0,01 g de BSA em 100 mL (concentração – 100 µg/mL)
0,01 g de BSA em 10 mL (concentração – 1000 µg/mL)
Dissolver o BSA em água ou em Solução de NaCl 0,15M com suave agitação mecânica.
2. Na pipetagem deve-se adicionar primeiro a solução de NaCl e posteriormente a
de BSA.
3. Cálculo da Concentração de proteína total em mg/mL.
Equação da curva (ou Reta) de Calibração:
𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥
𝑦−𝑎
𝑥=
𝑏
𝑥 = [𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎] µ𝑔/𝑚𝐿 ∙ 103 − 𝑚𝑔/𝑚𝐿.

4. Referência
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry,
v. 72, p. 248–254, 1976.