Método de quantificação de etanol por reação colorimétrica

1) Preparar solução estoque de etanol absoluto em água destilada, na concentração de x mg/mL. Adicionar X volume de água destilada, tarar a balança e Pesar o etanol absoluto. Para
cada mL de solução final, deve ser pesado x mg de etanol absoluto.
2) Preparar as amostras líquidas. As amostras fermentadas pelas leveduras devem ser filtradas no mínimo 4 vezes em papel filtro qualitativo. Importante trocar de papel filtro a cada
filtração. Em casos de amostras muito coloridas, após filtrar com papel filtro, filtrar em carvão ativado para remover os compostos que promovem a cor do extrato bruto. Realizar isto para cada
amostra. Se durante as leituras a concentração de etanol nas amostras for superior ao máximo da curva padrão, realizar o processo de diluição em água destilada.
3) Preparar solução estoque de dicromato de potássio (4 g) 40 mg/mL em água destilada.
4) Preparar tampão acetato de sódio pH 4,3 e molaridade de 150 mM.
5) Preparar solução estoque de ácido sulfúrico 1 N, dissolvendo 54 mL do ácido concentrado em 1000 mL de água destilada.
6) Reação de cor da amostra: uma alíquota (volume a se definir pelo teor de álcool e pela curva padrão) da amostra; 5 mL de dicromato 40 mg/mL; 5 mL de tampão pH 4,3; e 25 mL
de ácido 1N devem ser vertidos em balão volumétrico de 50 mL. Devem ser misturados suavemente por 60 segundos e deixados em repouso por 120 min (ausência de luz) para resultar em
coloração esverdeada (maior concentração de etanol, maior intensidade de verde, pela redução do cromo a cromo IV). Depois, realizar a leitura a 578 nm em espectrofotômetro. O branco da
reação pode ser água destilada (se a amostra não apresentar coloração) e leitura imediata assim que misturar à amostra aos reagentes no balão volumétrico.
7) Curva padrão de etanol: Preparar uma solução estoque de etanol (40 mg/mL) e realizar sucessivas reações colorimétricas como descrito à cima, para diferentes concentrações de
etanol conhecidas (Tabela 1) e determinar a ABS. É importante ressaltar que o tampão no pH 4,3 ajuda a manter a reação de cor mais estável, o que não é observado em outros valores de pH.
O tempo em que a reação de cor é máxima é a 90 min, mas pode deixar por 120 min se for o caso.

[Etanol] mg/mL Volume (uL) Volume H2O (uL) Volume Cr estoque (uL) Volume Tampão (uL) Volume ácido (uL) ABS 1 ABS2 ABS3
(BRANCO) 0 0 600 200 200 1000
0,5 7,5 592,5 200 200 1000
1 15 585 200 200 1000
1,5 22,5 577,5 200 200 1000
3 45 555 200 200 1000
5 75 525 200 200 1000
8 120 480 200 200 1000
10 150 450 200 200 1000
12 180 420 200 200 1000
15 225 375 200 200 1000
18 270 330 200 200 1000
25 375 225 200 200 1000
30 450 150 200 200 1000
35 525 75 200 200 1000
40 600 0 200 200 1000

8) Caso seja necessário, pode-se colocar para reagir o etanol padrão e realizar o espectro de varredura UV de 480-680 nm para averiguar o comprimento de onda em que a cor verde do
Cr (IV) absorve maior intensidade de luz. Importante que, o tempo de reação seja de 150 min, para garantir que a reação finalizou.
9) Utilizar cubetas de acrílico para estas medidas, devido o ácido sulfúrico ser corrosivo para materiais à base de silicatos. Este método foi validado por outros autores, logo apresenta
elevada confiabilidade. A validação foi realizada em CG. No nosso caso, a validação será realiza apenas paras as amostras em HPLC.