PROTOCOLO OFICIAL PARA AVALIAO DA VIABILIDADE E EFICINCIA

AGRONMICA DE CEPAS, INOCULANTES E TECNOLOGIAS RELACIONADOS

AO PROCESSO DE FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO EM LEGUMINOSAS.
1. DEFINIES
Para os fins deste protocolo considera-se:
Inoculante produto que contenha micro-organismos com atuao favorvel ao crescimento
de plantas.
Tecnologias conjunto de procedimentos adotados no uso e aplicao de inoculantes.
Cepas grupo de micro-organismos com caractersticas genticas idnticas, distinto de
outros grupos dentro da mesma espcie.
2. CONDIES BSICAS PARA
INOCULANTES E TECNOLOGIAS.

RECOMENDAO

DE

PRODUTOS

2.1. Apresentao de Relatrio Tcnico-Cientfico conclusivo conforme item 4.3.5. O(s)

pesquisador(es) coordenador(es) deve(m) necessariamente pertencer a instituio de
pesquisa oficial ou credenciada e possuir expertise em microbiologia agrcola.
2.2. Os testes devem contemplar a avaliao de qualidade do produto em laboratrio de
acordo com os mtodos oficiais.
Os ensaios de avaliao de eficincia devem ser conduzidos em casa de vegetao e viveiro
ou campo, a depender do modo de ao e da finalidade de uso do inoculantes. Quando as
avaliaes dos produtos forem realizadas apenas em casa de vegetao ou viveiro, os
ensaios devero ser conduzidos por pelo menos quatro vezes, com o emprego de diferentes
cultivares, quando aplicvel.
As avaliaes de campo devero ser conduzidas em, pelo menos, dois locais em condies
edafoclimticas distintas, tecnicamente adequadas cultura, por no mnimo duas safras
agrcolas ou, pelo menos em quatro locais em condies edafoclimticas distintas
tecnicamente adequadas cultura em questo em uma nica safra. Deve ser dada prioridade
conduo dos experimentos em locais representativos da cultura.
Os ensaios que forem implantados mas no puderem ser colhidos por questes que fujam ao
controle dos envolvidos com a pesquisa no sero considerados na totalizao de ensaios
realizados.
A critrio do MAPA podero ser exigidos ensaios de campo para comprovao de eficincia
de novas tecnologias de inoculao.
Eventuais desvios do protocolo mnimo aqui apresentado devero ser justificados
tecnicamente no Relatrio Tcnico-Cientfico conclusivo (item 4.3.5).

3. CONDIES BSICAS PARA RECOMENDAO DE NOVAS CEPAS.

Apresentao de Relatrio Tcnico-Cientfico conclusivo, conforme item 4.3.5, que atenda
a todos os requisitos especificados para avaliao de cepas.
4. AVALIAO DA VIABILIDADE E EFICINCIA AGRONMICA DE CEPAS,
INOCULANTES E TECNOLOGIAS DE INOCULAO.
A metodologia aqui descrita prpria para soja, feijo, caupi e outras leguminosas, com as
devidas adaptaes tcnicas e metodolgicas para cada cultura como, por exemplo,
exigncia climtica, espaamento, poca de plantio, cultivar recomendada, adubao e
calagem.
4.1. Testes de Laboratrio
Cepas: As cepas apresentadas para oficializao devero ser identificadas geneticamente e
caracterizadas morfofisiologicamente.
Produtos: Os produtos formulados utilizados nos testes devero ser caracterizados em
laboratrio quanto identidade, pureza e concentrao de microrganismos, conforme
mtodos oficiais.
Tecnologias: Na avaliao de novas tecnologias que envolvam a exposio das clulas a
condies estressantes dever ser conduzido ensaio laboratorial de sobrevivncia de clulas
sobre sementes, de acordo com mtodo oficial. Os tratamentos que reproduzam condies
estressantes como pr-inoculao ou exposio do inoculante a agentes daninhos s clulas
devero ser comparados com o tratamento controle. O tratamento controle dever
reproduzir a recomendao tcnica, ou seja, determinao da sobrevivncia do microorganismo no mesmo dia da inoculao, sendo as bactrias protegidas dos fatores
estressantes.
4.2. Ensaio em Casa de Vegetao
Os ensaios em casa de vegetao devem ser conduzidos na avaliao de cepas e de produtos
que se destinam ao uso em ambiente protegido.
A apresentao de resultados de avaliao em casa de vegetao de outros produtos
inoculantes e de tecnologias opcional.
4.2.1. Tratamentos
1. Tratamento sem inoculao;
2. Tratamento sem inoculao, com N na concentrao recomendada para a cultura*
3. Tratamentos com inoculao de cepas j recomendadas para a cultura, testadas
separadamente, quando existentes;
4. Tratamentos com inoculao das cepas a serem testadas separadamente.

* O nitrognio dever ser parcelado semanalmente.

Exemplos de requerimento do nutriente por planta: Soja: 700mg; Feijo e Caupi: 350mg
4.2.2. Estgios de avaliao: as cepas ou produtos devem ser avaliados em vasos de
Leonard e vasos com solo, com no mnimo quatro repeties para cada tratamento,
conforme descrito:
4.2.2.1. Vasos de Leonard ou sistemas semelhantes que permitam o cultivo sob condies
de substratos estreis: Colocar sementes desinfestadas e ou plntulas em vasos Leonard
autoclavados preenchidos com um substrato e soluo nutritiva de Norris 1, ou soluo
equivalente. Inocular conforme os objetivos de cada estudo.
4.2.2.2. Vasos com solo: Plantar as sementes desinfestadas em vasos com solo,
preferencialmente livre ou com baixas populaes de rizbios e baixo teor de nitrognio.
Em solos com teores elevados de matria orgnica adicionar palha de arroz ou milho na
proporo de 1 a 3 gramas de palha por quilograma de solo seco, ou realizar outro
procedimento para imobilizao do N de fonte orgnica. Inocular conforme os objetivos de
cada estudo.
Observao: Cuidados normais de assepsia devem ser observados durante o preparo dos
vasos, inoculao e conduo dos testes.
4.2.3. Parmetros mnimos a serem avaliados:
Especificamente para seleo de cepas deve-se avaliar o nmero e a massa de ndulos secos
(g/planta ou vaso). Na seleo de cepa e na avaliao de inoculantes devem tambm ser
avaliados a massa seca da parte area (g/planta) de plantas cortadas no ponto de insero
dos cotildones e nitrognio total na massa seca (mg de N/planta). A eficincia nodular (mg
de N da massa seca de planta/mg de ndulos secos) pode ser calculada a partir dos
parmetros determinados. Opcionalmente pode ser medido o teor de clorofila nas folhas.
Aos 35-40 dias aps emergncia fazer o corte das plantas e separar as razes da parte area
no ponto de insero dos cotildones. Separar os ndulos das razes, contar, secar em estufa
a 65 at atingir massa constante, apresentado o resultado em g/planta ou vaso. Secar a parte
area das plantas, como descrito anteriormente, pesar, moer e determinar os teores de N na
massa seca. Apresentar os resultados da massa seca das plantas em g/planta ou vaso, N total
na massa seca em mg de N/planta. De posse dos parmetros N total na massa seca (mg) e
massa seca de ndulos (mg) determinar a eficincia nodular que igual a mg de N total da
massa seca dividido por mg de ndulos secos.
4.3. Ensaios no Campo
A rea a ser utilizada para instalao do experimento deve ser preparada e ter suas
caractersticas qumicas e fsicas determinadas. Se possvel fazer anlise foliar da cultura
anterior para facilitar a adubao com os macro e micronutrientes necessrios.

O solo a ser utilizado no dever apresentar populao estabelecida do rizbio em estudo.

Na impossibilidade de atendimento deste requisito a populao dever ser quantificada e
includa no relatrio tcnico-cientfico.
Os experimentos devero ser delineados a campo em blocos ao acaso com no mnimo
quatro repeties. A semeadura das parcelas dever ser feita de forma a evitar contaminao
entre as parcelas experimentais. As parcelas experimentais devero ter uma dimenso que
possibilite uma rea til experimental suficientemente representativa. No caso especfico da
soja e feijo as parcelas devero ter tamanho mnimo de 24,0 e 10 m 2, rea til mnima de
6,0 e 4,0 m2, respectivamente, observados distncia mnima entre parcelas de um metro para
evitar contaminaes. Sugere-se para soja: parcelas de 4 x 6 m (oito linhas espaadas de 0,5
m) colhendo as 4 linhas centrais ou 5 x 5 m (dez linhas espaadas 0,5 m) colhendo as seis
linhas centrais, deixando sempre um metro de bordadura nas cabeceiras.
4.3.1. Tratamentos:
O experimento de campo dever conter, no mnimo, os seguintes tratamentos:
Tratamento 1. Ausncia de fertilizante nitrogenado e de inoculao;
Tratamento 2. Controle com N-mineral;
Tratamento 3. Inoculao padro com inoculante turfoso contendo ao menos uma das cepas
recomendadas para a cultura, quando existente.
Tratamento 4. Demais tratamentos a serem testados seguir a recomendao tcnica do
proponente.
Observaes:
Tratamento 2. As seguintes doses e formas de aplicao de nitrognio so recomendadas:
Soja - 200 kg de N/ha, sendo 50% na semeadura e 50% na florao ou aos 35 dias aps
emergncia, por ocasio da coleta de plantas;
Feijo - 80 kg de N/ha, sendo 20 kg no plantio e 60 kg aos 20-25 dias aps emergncia;
Caupi - 70 kg de N/ha, sendo 35 kg no plantio e 35 kg aos 20-25 dias aps emergncia;
Tratamento 3. A inoculao padro consiste em umedecer as sementes com gua aucarada
a 10%, usando no mximo 300 ml por 50 kg de sementes, e aplicao de acordo com a
recomendao tcnica (em nmero de UFC por semente) de um inoculante turfoso com
populao mnima legalmente estabelecida. O clculo do nmero de clulas por semente
deve tomar por base que um kg de semente de soja tem 7000 sementes e um kg de feijo ou
de caupi tem 5000 sementes. Para outras espcies, considerar o nmero de sementes por
quilograma. As sementes inoculadas devem secar em local fresco e arejado e a semeadura
deve ser feita imediatamente aps a secagem, em perodo no superior a duas horas. Como a
maioria dos produtos qumicos pode ser txica quando em contato direto com a bactria, os
insumos usados para tratamento de sementes (micronutrientes, fungicidas e inseticidas)
devem ser evitados ou, se utilizados, no devem ter contato direto com o inoculante. No
caso de ser necessria a aplicao de micronutrientes, recomenda-se que a aplicao seja
feita por pulverizao foliar antes da florao na mesma dose recomendada para as
sementes ou segundo as recomendaes tcnicas para cada cultura e regio.

Recomendao Geral: Sempre usar a mesma populao de clulas para a inoculao padro
e para os inoculantes ou cepas em teste. No caso de inoculantes lquidos, o total de lquido a
ser aplicado nas sementes no deve ultrapassar 300 ml por 50 kg de sementes.
4.3.2. Parmetros mnimos a serem avaliados a campo:
4.3.2.1. Caracterizao qumica e fsica do solo
Devem ser realizadas as anlises qumicas necessrias verificao do requerimento de
adubao. A classificao do solo e sua classe textural devero ser informadas.
4.3.2.2. Populao de rizbio
O solo da rea experimental dever ter a populao de rizbios determinada.
4.3.2.3. Nodulao
Coletar cinco plantas com as razes intactas, da rea central da segunda linha de cada
parcela, imediatamente antes da florao (no caso da soja aos 30 - 35 dias aps emergncia).
Apresentar resultados para nmero de ndulos por planta (no/planta) e massa de ndulos
seca por planta (mg/planta).
4.3.2.4. A avaliao da biomassa e nitrognio total da parte area das plantas
Deve ser feita por ocasio da coleta de ndulos.
4.3.2.5 Rendimento de Gros
O rendimento de gros deve ser corrigido para 13% de umidade e expresso em kg/ha.
Determinar os teores de N nos gros e expressar em mg/kg e o N total nos gros expressar
em kg de N/ha.
4.3.2.6. Demais parmetros
Culturas florestais: Produo de biomassa de plantas (parte area e/ou razes), conforme
especificao da cultura, altura de plantas, dimetro de caule, sobrevivncia das mudas e
concentrao do(s) nutriente(s).
Forrageiras: Produo de biomassa de plantas (parte area e/ou razes), conforme
especificao da cultura, altura de plantas, concentrao do(s) nutriente(s) em estudo.
4.3.3. Anlise estatstica
Os resultados devem ser submetidos anlise de varincia e, quando o teste
significativo a 5%, as mdias dos tratamentos devero ser comparadas por um
mdia adequado, tambm ao nvel de 5% de significncia. Se o teste de F
significativa a 5% mas apresentar significncia a 10%, as mdias dos tratamentos
ser comparadas pelo teste de mdia, tambm ao nvel de 10% de significncia.

F for
teste de
no for
devero

4.3.4. Interpretao dos Resultados

Para recomendao de inoculantes e/ou outras tecnologias, estes devem apresentar resposta
igual ou superior inoculao padro e/ou s tecnologias j recomendadas,

respectivamente, e superior ao controle sem inoculao nos quatro ensaios. Para

recomendao de nova cepa, esta deve apresentar resposta igual ou superior a pelo menos
uma cepa j recomendada para a mesma cultura, e superior ao controle sem inoculao nos
quatro ensaios. No caso da conduo de um maior nmero de experimentos, o numero de
casos positivos deve representar pelo menos 70% do total.
A produtividade mnima a ser considerada para que o resultado do experimento seja
considerado vlido deve ser de 2000 kg/ha para soja, de 1000 kg/ha para feijo e de
500kg/ha para Caupi,.
4.3.5. Relatrio Tcnico-Cientfico
O relatrio tcnico-cientfico deve ser redigido em lngua portuguesa, em papel timbrado da
instituio e seguir as orientaes deste protocolo contendo: reviso bibliogrfica
enfatizando o objetivo do trabalho, descrio completa da metodologia, resultados obtidos e
concluso clara sobre a eficincia e recomendao do produto ou tecnologia testada, assim
como a(s) assinatura (s) do(s) pesquisador(es) responsvel(is). Anlise dos custos variveis
entre os controles e o produto ou a tecnologia testada poder ser includa, a critrio da
requerente.
1

NORRIS, D.O., DATE, R.A. 1976. Legume bacteriology. In: SHAW, N.H., BRYAN,
W.W. (Eds.) Tropical pasture research - principles and methods. Brisbane: CAB. p.134173.
Protocolo elaborado com base no Protocolo para anlise da qualidade e da eficincia
agronmica de inoculantes, cepas e outras tecnologias relacionada ao processo de fixao
biolgica do nitrognio em leguminosas descrito nos Anais da 13 Reunio da Rede de
Laboratrios para Recomendao, Padronizao e Difuso de Tecnologia de Inoculantes
Microbianos de Interesse Agrcola (RELARE). Londrina: EMBRAPA SOJA, 2007. 212 p.
(Documento/Embrapa Soja, n.290).