Sequenciamento: novas

tecnologias

mcarazzo@lge.ibi.unicamp.br
Marcelo Falsarella Carazzolle
23/07/2012
 Tecnologias de sequenciamento
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas)
- Sequências em torno de 500 bp
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998), n. 5375, 363-365
- Nature 437 (2005), 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)
- Sequências em torno de 400 bp
- Short reads sequencing (Solexa e Solid)
- 4000Mbp/24 horas
- Sequências em torno de 100 bp
 Sanger sequencing
anelamento dos primers

denaturação
Exemplo de gel utilizado nos seqüenciadores de gel (ex.: 377). A diferença de
tamanho permite a separação dos grupos de fragmentos, e esta
“distribuição normal” da passagem dos fragmentos é representada pelo
eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqüência (read).
Filme sequenciamento
 background

- A identificação dos picos é feita através de uma transformada de fourier do sinal

- A nota está ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a altura do
background
 Analisando o cromatograma
Região de qualidade alta

• Picos bem definidos e grandes.

• Linha de base boa.
• Distância entre picos anterior e posterior constante.
Região de qualidade média – poucas ambigüidades

• Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio.

• Linha de base boa a razoável.
• Distância entre picos anterior e posterior razoável.
Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade

• Picos mal definidos e de tamanho pequeno.

• Linha de base confusa.
• Distância entre picos anterior e posterior inconstante.
Sequenciamento produz sequencias em torno de 500bp

Onde q é a nota phred e P é a probabilidade encontrar uma base errada

:
- Nota phred = 20 => 1 base errada a cada 100 (99%)
- Nota phred = 30 => 1 base errada a cada 1000 (99.9%)
Pyrosequencing
Fita simples

Câmera de CCD

Reação de
degradação

Filme sequenciamento
Science 281 (1998), n. 5375, 363-365
Shotgun do genoma inteiro ou cDNA
DNA genômico Quebrar em pedaços
aleatórios ~2000pb (shotgun)

Ligação do
adaptador e
separação em fita
simples
- O adaptador permite que o DNA se ligue em esferas
minúsculas (diâmetro de 28 µm). Apenas um DNA é ligado em
cada esfera
- As esferas são envolvidos em gotas de óleo que contêm todos
os reagentes necessários para amplificar o DNA
- Cada gota contendo a esfera é mantida isolada para evitar
contaminação e consegue produzir 10 milhões de cópias numa
reação de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reação de pirosequenciamento produz
1011 moléculas de ATP gerando mais de 109 fótons, num
comprimento de onda de 560 nm, e num período de 3-4
segundos. Facilmente detectado por uma câmera de CCD
Nature 437 (2005), 326-327
O sequenciador 454 Câmara de fluxo
contendo as amostras
e as fibras ópticas
(1,6 milhões/slide)

Câmera de Bombeamento
CCD de fluídos

Computador

Nature 437 (2005), 376-380

 Pirograma

Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt

Solexa sequencing
Solid sequencing
Projetos de ressequenciamento

http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=1000-genomes-project
FIM