UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA

Laboratório de Biologia Celular e Molecular
CENA
28o Reunião Anual da FERMENTEC 40 anos

19 a 20 de Junho de 2007

DNA: REVELANDO O CÓDIGO DAS BACTÉRIAS

Siu Mui Tsai

Fabiana Cannavan, Bianca Furlan e Ezio Nalin

tsai@cena.usp.br

São Pedro - SP
ESTUDOS DA HEREDITARIEDADE GERARAM OS
PRIMEIROS ESTUDOS SOBRE O DNA

1859 1865 1902 1941 1952 1953

A PRIMEIRA FASE DO DNA: ANOS 50-60

A DUPLA HÉLICE DO DNA

(Rosalind Franklin, 1952; Watson & Crick, 1953)

 (1952)

EXPERIMENTO
HERSHEY & CHASE

A CONTRIBUIÇÃO DE
RADIOISÓTOPOS
FOI FUNDAMENTAL

Proteina do DNA da cápsula

= 35S

Proteina do DNA interno

= 32P
35S Capa 32P DNA
A SEGUNDA FASE DO DNA: ANOS 60-70

AS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

DNA POLIMERASE
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Vetor
Expressão

EXPRESSÃO DE GENES
EM BACTÉRIAS:
INSERÇÃO
DNA

PRODUÇÃO DE PROTEINA
DE EUCARIOTO Proteina
Expressão da Resistência a Antibióticos pela E.coli transformada

Zona
Adesão

RNA
Poli Transcrição

Ribossoma
mRNA
Tradução

Replicação
Proteina Resistência

Absorção de
plasmídio
 TERCEIRA FASE DO DNA:
ANOS 70-80

MANIPULAÇÃO DAS MOLÉCULAS

ELETROFORESE
ELETROFORESE EM GEL (Southern) = 1975
 ANOS 80:

SEQUENCIAMENTO
DO DNA

A CONTRIBUIÇÃO
DOS RADIOISÓTOPOS
FOI FUNDAMENTAL
VISUALIZAÇÃO POR FILME R-X
 A QUARTA FASE DO DNA: 80-90

¾ DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MOLECULARES

¾ MAPAS GENÉTICOS – RFLP

¾ HIBRIDIZAÇÕES in situ

¾ MARCADORES RADIOATIVOS, COLORIDOS

¾ FOSFORESCENTES E FLUORESCENTES
 MÉTODOS BIOQUÍMICOS
ACOPLADOS A MOLECULARES

ELETROFORESE & IMUNOQUÍMICA

SISTEMAS USANDO CAMPO ELÉTRICO
DE ALTA VOLTAGEM : ANOS 80-90
PFG

OFAGE

TAFE

RGE

FIGE

CHEF

PACE

SEPARAÇÃO DE GRANDES MOLÉCULAS EM GEL

A QUINTA FASE DO DNA: 1990-2000

¾ PCR

¾ SÍNTESE ARTIFICIAL DE RNA E DNA

¾ SEQUENCIAMENTO DE GENOMAS

¾ REPAROS DE DNA
 SEQUENCIAMENTO DE DNA - ANOS 90
BASEADO EM FLUORESCÊNCIA MULTI-ESPECTRAL DO DNA
Poç
Poço 1 Poç
Poço 2 Poç
Poço 3

A
C
G
T

Gel de Poliacrilamida Direção da

Eletroforese

Espelho

Espelho
Tubo
Fotomultiplicadorr

Laser
Computador
ALGUNS AVANÇOS RECENTES
Equipamentos & Bioinformática
Sequenciador com sistema de
eletroforese capilar

¾ Mais prático e melhor

qualidade na leitura

¾ Sistema automático de
carregamento das amostras

¾ Menor tempo de análise

¾ Maior rendimento
Programas computacionais
acoplados a equipamentos
 MÉTODOS USANDO MARCADORES
FLUORESCENTES REVOLUCIONARAM
A PESQUISA, CONTRIBUINDO PARA O
USO SEGURO DAS TÉCNICAS
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
VARREDURA E CONFOCAL

Marcadores fluorescentes possibilitam a

localização dos genes
Politene cromossoma

Designação Banda

2F 3A 3B 3C

Deleção 1
Deleção 2

Banda 3A
ISOLAMENTO DE mRNA

MÉTODOS REVOLUCIONÁRIOS

SÍNTESE DE DNA ARTIFICIAL

E QUANTO AO SEQUENCIAMENTO DE GENOMAS?
GENOMAS

Bactérias

Fungos

Lírio

Plantas

Insetos

Anfíbios

Pássaros

Mamíferos

Pares de bases por genoma haplóide

SEQUENCIAMENTO DE DNA
CENA - USP
ANALISE DO SEQUENCIAMENTO

ABI Prism 3100 Genetic Analyzer

(Applied Biosystems / Hitashi)
COMPARAÇÃO SEQUENCIAS COM BLAST 2.0

Conversão a formato
FASTA
Tecnologias emergentes em
sequenciamento de genomas

DNA

Hall, N. J Exp Biol 2007;210:1518-1525

 DNA genômico

(1) Fragmentação

(2b) Circularização e
(2a) Acoplamento a ligante
acoplamento a ligante

(3a) Amplificação
em cápsulas
(3b) Amplificação em cápsulas e-PCR

(4a) Cápsulas aplicadas

em placas
(4b) Cápsulas imobilizadas
em um matriz de acrilamida

(5b) Ligação com um banco de oligos adicionados

(5a) Pirosequenciamento por extensão de primer
em ciclos e leitura de imagem a 4 cores

Hall, N. J Exp Biol 2007;210:1518-1525

 Leitura e acoplamento de contigs pelo 454

Goldberg, Susanne M. D. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 11240-11245

Copyright ©2006 by the National Academy of Sciences

 UNIVERSIDADE – EMPRESA:

A INTERAÇÃO NECESSÁRIA

INVESTIMENTO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA:

ALGUNS RESULTADOS EM SÃO PAULO
Sequenciamento dos ORFs
da Xylella fastidiosa
revelaram os seus genes
gerando mais de 300 artigos
nacionais e internacionais

(Programa ONSA/FAPESP)
INVESTIMENTOS EM BIOTECNOLOGIA:

EMPRESA: FERMENTEC

INSTITUIÇÃO: USP – São Paulo (CENA)

 CENA/USP & FERMENTEC

¾A análise taxonômica de mais de 200 isolados da

coleção da Fermentec pelo CENA/USP desde 2004,
tem contribuido para a identificação de isolados
(cultura pura) e de contaminantes nos processos de
fermentação.

¾ A técnica possibilitou o controle de qualidade do banco

de bactérias e leveduras da empresa, através do
sequenciamento completo do gene 16S rRNA e 18S rRNA.

¾ Com base nesses dados, é possível contribuir para o

controle de contaminantes com segurança e eficiência.
 CENA/USP & FERMENTEC
ISOLADOS SEQUENCIADOS

¾ Lactobacillus sp.: L. plantarum, L. fermentum,

L. casei, L. paracasei, L.buchneri,
L. zeae, L. sobrius)

¾ Bacillus sp. (B. subtilis, B. pumilis, B. anthracis)

¾ Acetobacter sp.

¾ Clostridium beijerinckii, Staphylococcus pasteuri

Weissella cibaria, Leuconostoc mesenteroides

¾ Leveduras
 T-RFLP – Estudo de Comunidades Microbianas
Uso no Controle de Qualidade de Contaminantes

Análise de Dados
Tabelas do Peak Scanner ou GeneMapper são exportadas
no formato .txt e formatadas no Microsoft Excel para
posterior análise multivariada em pacotes estatísticos
PCR em Tempo Real para identificação de genes
microbianos em solo e amostras ambientais

40
RHA1(fcb)
Ciclos PCR (Ct)

35 TaqMan-16SrDNA
y = 44.7855 - 3.1985 x
r ² = 0.998
30

25 TaqMan-fcb
y = 41.368 - 3.348 x
r ² = 0.982
20

15
102 103 104 105 106 107

CFUs g -1 solo
EMPRESA: VOTORANTIM – Novos Negócios

INSTITUIÇÕES: UFSCAR- São Carlos (CANAVIALIS)

USP – São Paulo (ALLELYX)
UNICAMP (SCYLLA)
CanaVialis foi fundada em março de 2003 por um time de
pesquisadores da Universidade Federal de São Carlos com 30
anos de experiência no melhoramento convencional de cana-de-
açúcar.

CANAVIALIS É A ÚNICA EMPRESA PRIVADA DE

BIOTECNOLOGIA DE CANA-DE-AÇÚCAR (PLANTA)

¾O programa de melhoramento genético convencional de

cana-de-açúcar pretende, com o auxílio de novas tecnologias
e foco empresarial, acelerar o desenvolvimento de novas
variedades.

¾Empresa estabelece interações com universidades e

instituições de pesquisa no desenvolvimento de processos e
produtos
 Com estas parcerias, pretende-se utilizar a
engenharia genética na geração de novas
variedades, complementando seu programa de
melhoramento clássico.

Sofwares de Bioinformatica Plantas geneticamente modificadas

Novas
Variedades
Rápida Liberação
 Seleção Melhores Mudas p/
viveiro
2,2 milhões de de clones clones na
primario
CanaVialis

sementes/ano nas biofábrica

com processo condições Uso comercial
de seleção Validação das
específicas
científico e variedades nas
da usina
racional condições da
usina

INTERAÇÃO DOS PROGRAMAS COM AS USINAS

Fase experimental
Tradicionais

Fases clonais: seleção visual nas Estações nas usinas Uso

Experimentais
comercial

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ANOS
 As linhas de pesquisa da CanaVialis e Alellyx buscam endereçar
os principais problemas do mercado atuais e futuros

CanaVialis Alellyx

1. Variedades com alto teor de 1. Aumento do teor de açúcar

açúcar 2. Resistência a vírus
2. Variedades superprecoces 3. Resistência à seca
3. Variedades para novas 4. Inibição de floração
fronteiras agrícolas 5. Variedades resistentes a
4. Variedades adaptadas a herbicidas e insetos
colheita e plantio mecanizados
5. Energy Cane (Biomassa)
 Biotecnologia
1. Marcadores moleculares para
o mapeamento genético
2. Marcadores moleculares para
a proteção de cultivares
3. Introgressão de novas
características a partir de
germoplasma exótico
4. Bioinoculantes para aumentar
a produção
Tecnologia da Informação
1. Softwares para otimização de
cruzamentos
2. Softwares para gerenciamento
da produção de mudas
3. Softwares para avaliação de
novas variedades
4. Softwares para monitorar o
desempenho de novas
variedades
 Os resultados alcan çados at
alcançados é o momento
até
mostram que os investimentos em
biotecnologia e a utiliza ção de pessoal
utilização
especializado que tem como celeiros as
universidades e institui ções de pesquisa
instituições
brasileiras têm sido uma boa estrat égia para
estratégia
o desenvolvimento cient ífico e tecnol
científico ógico na
tecnológico
agricultura e pecu ária
pecuária

Obrigada!