Universidade Federal do Amazonas

Programa de Pós Graduação em

Biotecnologia

Genilton de Oliveira Cardenes

Orientador: Edmar Vaz de Andrade

Fator de impacto: 2.476

 Introdução
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 Os hidrocarbonetos derivados do petróleo abrangem uma ampla gama
de alcanos lineares de diferentes tamanhos, ciclo-alcanos e
hidrocarbonetos aromáticos de origem natural.

 Duas etapas importantes

 Transporte de compostos alcanos para dentro da célula
 Reação catalisada por uma monooxigenase, que converte alcanos em
alcanóis, também chamados de hidroxilases. Estas enzimas constituem um
conjunto de oxigenases de membrana integrais de ferro não heme,
coletivamente denominadas alcano hidroxilase. 
 Introdução
3
 Atualmente existem três categorias de alcano Hidroxilases

 Monooxigenase, ativa em alcanos de cadeia curta (C1–C4)

 Alcanos de cadeia média(C5–C16)

 Hidroxilases mal caracterizadas que oxidam alcanos de cadeia longa

(> C16)
 Introdução
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 Genoma de Dietzia cinnamea P4 que esta disponível no banco de
dados NCBI

  Primeiro genoma de uma espécie de Dietzia que foi sequenciado e

anotado. A anotação identificou diversas enzimas de genes
envolvidos na degradação de compostos hidrocarbonados, como n -
alcanos, compostos bifenil e benzênicos.

 Descreve a organização genética de genes no cromossomo da cepa

P4, e o perfil de degradação de n -hexadecano, avaliando os níveis
de transcrição de genes alk  durante o crescimento por RT-PCR
 Material e Métodos

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Estirpes bacterianas e condições de
crescimento

Dietzia cinnamea P4

Meio BH + Glicose(1g/L)
+Hexadecano

Glicose

pHs 4,0, 5,0, 7,0 e 9,0

35 ºC e 45 ºC

6
A análise de sequência de genes
de interesse e visualização de
sua organização no genoma da
cepa P4 foi realizada usando o
programa Artemis.
Domínios conservados foram
realizadas usando o conjunto
BLAST e os domínios
transmembranares foram
identificados usando THMMH
Material e Métodos
kit RNeasy Mini (Quiagen, Valencia,
CA, USA)
 Síntese de cDNA 
kit de síntese de cDNA
(Bioline, Boston, Ma, EUA)
RT-PCR cDNA
Power SYBR Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, Análise de bootstrapping foi
EUA) usada para avaliar a
topologia da árvore
filogenética
A análise filogenética dos
genes analisados ​
Os alinhamentos entre as sequências de
estruturado usando o
aminoácidos deduzidas foram realizados
programa MEGA4
por Clustal W
 Resultados e discussão
7

Figura 1: Organização genética de genes degradativos de alcanos da cepa P4 de Dietzia cinnamea alinhados ao

segmento homólogo de Dietzia sp. E1. Gene da álcool desidrogenase de cadeia curta, (ORF5) gene transportador
bifuncional do lípido ABC , (ORF6) gene de alcano 1-monooxigenase, (ORF7), gene regulador da transcrição da
família do tipo TetR e (ORF8) (b) Genes de organização de Dietzia sp. E1.
Resultados e discussão

 Figura 2: Alinhamentos múltiplos de alcanos hidroxilase completos de (E1) Dietzia sp. E1, (de acordo com ACN62569 );
(K44) Dietzia sp.K44, (acess. AAV68403 ); (ITRH 56) Dietzia sp. ITRH56, (acess. ACH99228 ); (P4) D. cinnamea P4,
(H0B) Dietzia sp. H0B, ( conforme ACR56752 ); (CF8) Nocardioides sp. CF8, ( conforme AAK31348 ); (NRRL)
Prauserella rugosa NRRL B-2295, (acess. CAB51024 ) e (DQ12-45-1b) Dietzia sp. DQ12-45-1b (conforme AEM66518).
Três caixas His conservadas (a), (b) e (d), motivo HYG (c) e dois motivos de sequência Rub CXXCG (e) e (f).
Resultados e discussão
9

 Figura 3: Árvore filogenética de junção de vizinhos baseada no alinhamento de sequências de aminoácidos de alcano
monooxigenase relacionada de cepas de actinomicetos. Os números de acesso do GenBank são fornecidos entre
parênteses. Somente valores de bootstrap superiores a 50% de 1.000 replicações são mostrados. A barra representa 0,1
substituições de aminoácidos por sítio.
Resultados e discussão
10

 Figura 4: Crescimento de Dietzia cinnamea P4 em n - hexadecano como única fonte de carbono em diferentes condições
de pH (4,0 a 9,0) e temperaturas (a) 35 ºC e (b) 45 ºC.
Resultados e discussão
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 Figura 5: Níveis de expressão dos genes putativos alkU , alkB-rub , transportador lipídico e acox da cepa Dietzia
cinnamea P4 em n - hexadecano como única fonte de carbono em diferentes fases de crescimento. Os níveis de expressão
relativa foram determinados com RT-PCR quantitativo em tempo real. Os dados são representativos de dois experimentos
independentes.
Resultados e discussão
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 Cepa P4 de crescer em uma ampla gama de n -alcanos de diferentes
tamanhos (C 11 a > C 36 ), petróleo bruto e hidrocarbonetos
aromáticos

 Este estudo foi o primeiro a descrever um esboço de anotação de um

genoma de Dietzia .

 No presente estudo, mostramos o perfil transcricional de genes

envolvidos para usarCompostos de n -hexadecano como única fonte
de carbono e energia sob diferentes condições de pH (7,0–9,0) e
temperatura (35 ºC a 45 ºC).
Resultados e discussão
  Três ORFs putativas diretamente envolvidas no transporte e
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degradação de n -alcanos:
 transportador lipídico putativo,
 Monooxigenase alcano
 Regulador transcricional TetR. 
 A alcano monooxigenase descrita neste estudo é fundida a uma
enzima rubredoxina

 A estreita relação entre as sequências de cepa P4 e E1 AlkB pode

indicar um papel semelhante na assimilação de hidrocarbonetos em
relação aos tamanhos preferidos de alcanos.
14 Obrigado

O trabalho foi apoiado pela

PETROBRAS. Agradecimentos ao CNPq pela bolsa
concedida a L. Procópio para vir ao laboratório de
Groningen