Universidade Federal de Santa Catarina

Departamento de Química
Seminário Bioquímica Estrutural

Natan Filippi– 201604456

Florianópolis, Outubro de 2016
Mycobacterium tuberculosis

• 1/3 da população mundial está contaminada;

• Maior causa de morte em portadores do HIV, causando ¼ de todas
as mortes;
• Aeróbico (pulmões),é um parasita intracelular facultativo e é
considerada um bacilo;
• Resistente a antibióticos β-lactâmicos.
β-lactam
• Em geral, os antibióticos β-lactâmicos
trabalham através da inibição da biossíntese
da parede celular bacteriana;

• A penicilina faz parte dessa família;

• são o grupo de antibióticos mais utilizados;

The β-lactam core structures. (A) A

penam. (B) A carbapenam. (C) An
oxapenam. (D) A penem. (E) A
carbapenem. (F) A monobactam.
(G) A cephem. (H) A carbacephem.
(I) An oxacephem.
Beta-Lactamase - BlaC
• São as enzimas responsáveis pela
resistencia aos β-lactam;
• Elas atuam na abertura do anel de
quatro membros por hidrólise;
• Estas enzimas contêm resíduos
catalíticos de Ser70, Lys73, e Glu166
• Estes resíduos foram avaliados como
importantes através de estudos
cristalográficos e de bactérias
mutantes.
Substratos estudados
Materiais e Métodos

• A concentração do sítio ativo foi determinada por titulação

com clavulanato (inibidor estequiométrico).

• Experimentos conduzidos a 25 °C, nos seguintes tampões:

sodium acetate (pH 4.0−5.5), MES
(pH 5.5−6.7), HEPES (pH 6.7−7.8), and TAPS (pH
7.8−8.7).

• pH vs Cinética – Cefoxitin e Nitrocefin

Materiais e Métodos
• Cinética do estado estácionário - Cefoxitin e Nitrocefin (monitorado
por consumo dos substratos por UV-vis)
• Pré Cinética do estado estacionário – Stopped Flow

• Efeito isotópico cinético do solvente (H O x D2O) - Cefoxitin e

2
Nitrocefin
Mecanismo proposto de abertura do
anel

Qual etapa determina a velocidade da reação ?

Cinética vs pH A diminuição em elevados
valores de pH se refere a
desprotonação de algum
dos grupos da enzima e
pode refletir na formação do
complexo enzima-substrato.

O Formato de sino sugere

que existe a participação de
ácido e da base no sítio ativo
da enzima.

Quando fagocitado, o pH
diminui, mas a β-lactamase
continua funcionando !
Efeito Isotópico Cinético do
Solvente

Não foi feito para o Meropenen porque tem baixo Km e baixo Kcat
Nitrocefin – acilação (k2) – RDS - efeito isotópico do solvente pequeno
Cefotoxin – deacilação (k3) – RDS - efeito isotópico do solvente grande
Evidencias Mecanisticas
Velocidade inicial vs razão de água deuterada

Proton inventories of (A) nitrocefin with 2 nM BlaC and (B) cefoxitin with 350
nM BlaC measuring the initial velocity with varying levels of D2O in 100 mM
MES (pH 6.3).
Evidencias Mecanisticas
Burst kinetic isotope effects
• K2 e k3 não foram determinados para o nitrocefin pela sua rápida hidrólise;
• SKIE não determinado para o meropenem por ter Km e kcat pequenos, bem como seu
produto de hidrólise ter absortividade molar pequena;
• Nitrocefin é o único substrato que apresenta a etapa de acilação (k 2) como determinante,
• O alto SIKE na acilação do meropenem pode ser pela isomerização de um anel 1Δ para
um 2Δ-pirrolinico, com o auxilio de um próton do meio.
Conclusão
The M. tuberculosis blaC-encoded β-lactamase exhibits a very broad pH
dependence that allows it to act effectively at a range of pH values that the
organism encounters, including the low pH levels that it encounters intracellularly
after macrophage capture.
The pH dependence of kcat is reporting on the required ionization states of
Glu166 and Lys73 for effective acylation (k2) of the enzyme (for nitrocefin) or for
deacylation (k3) of the covalent enzyme−β-lactam complex (for the slower cefoxitin
and Meropenem).
A BlaC é uma enzima altamente promíscua, tendo boa afinidade por todos os
substratos estudados, e sendo responsável pela resistência a antibóticos β-
lactâmicos.