Conceito de biomarcadores na área de

Ciências Biológicas

• Biomarcadores ou marcadores biológicos são entidades que podem

ser medidas e indicam a ocorrência de uma determinada função
normal ou patológica de um organismo ou uma resposta a um agente
químico ou condição ambiental.
Utilização de biomarcadores
• Medicina: Indica presença ou severidade de doença, toxicidade a
micotoxinas, macrófagos
• Ecofisiologia:
• Ecotoxicologia: respostas de toxicidade
• Resistencia:

• Outras áreas: geologia (origem biológica),

 Biomarcadores para
avaliação ecotoxicológica
Análises de toxicidade:
- Avaliação de contaminação ambiental:
água, sedimento, solo, ar

- Avaliação de toxicidade de um composto químico ou formulado:

como agem em organismos não-alvos ou quais os sítios-alvos nas
espécies alvo.

• Organismo coletado X bioensaios de exposição

 Elementos inorgânicos - Metais
1. Essenciais e traço
2. Microcontaminantes ambientais
3. Essenciais/traço e microcontaminantes
Estabilização da camada de valência

Oxidação e redução
Metais tendem a perder elétrons (oxidação)
Ametais tendem a ganhar elétrons (redução)

Eletrólitos
Substâncias se comportam como íons (ânions
e cátions) em meio aquoso que geram
corrente elétrica
NaCl -> Na⁺ + Cl ⁻
 Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos HPAs
São formados pela combustão incompleta da matéria orgânica (C-H - outros )

Entrada

Bioacumulação
Eliminação

intermediários reativos a moléculas biológicas

Biotransformação
• Reagem com as bases
nucleofílicas do DNA e proteínas
como hemoglobinas gerando Eliminação Reatividade
alterações e mutações
 Agrotóxicos
+15.000 formulações.

Possuem sítio de ação específico ou muitos

sítios
Venenos axônicos
Sistema nervoso
Venenos sinápticos
Inibidores do sítio I
Inibidores de cadeia de transporte de elétrons Inibidores do sítio II
Metabolismo energético Desacopladores da fosforilação oxidativa Inibidores do sítio III
Inibidores da síntese de ATP

Inibidores da formação de cutícula

Interferentes hormonais
Regulação crescimento
Inibidores da síntese de lipídeos
Bloqueadores de alimentação
 Meio de entrada dos compostos químicos
Ingestão Absorção

Tempo de exposição e quantidade do composto (ambientalmente relevante)

 Rotas e depósito dos compostos químicos
Brânquias músculos

Corpo gorduroso

gônadas

Sangue/hemolinfa

Túbulos de Malpighi
 Passagem pela membrana plasmática
Extracelular
N₂
CO₂
Transporte de substâncias: etanol O₂
H₂O

⮚ Difusão simples
⮚ Proteínas
⮚ Vesículas
Difusão facilitada
- Endocitose (fagocitose e pinocitose)
- Exocitose (secreção e excreção)
Intracelular
Transporte passivo Transporte ativo
Fonte: UNESP

Íons (Ca²⁺, Na⁺, H⁺, K⁺, Cl⁻)

Moléculas grandes (glicose, aminoácido)

Vesículas
 Canais, bombas e carreadores
Na+/K+ ATPase, íons

Ca²⁺ ATPase, Na+, Cl-, Ca2+ e K+

H⁺ ATPase Na+, Cl-, Ca2+ e K+

Proteínas

moléculas

Glicose Cl⁻ - HCO₃⁻

Na⁺ - H⁺
Na⁺ - glicose Na⁺ - Ca²⁺
Fonte: casadasciencias.org
 Receptores de membrana e Sinalização celular
Receptores com atividade enzimática 5. Receptor de adesão - Integrinas
Liga moléculas na matriz extracelular,
3. Receptor guanililciclase. modificando sua interação com o
Estimula a formação do 2º citoesqueleto .
2a. Receptor tirosina-cinase mensageiro GMP cíclico.
Ativa por autofosforilação.
1. Receptor associado à Proteína G. 4. Receptor canal
L L Ío
L L L
L L n
L L
R R En
z
G G
Membrana X
plasmática GT cGM
2b. A cinase ativa um Cascata de P P
fator de transcrição cinases
alterando a expressão
gênica. Vias de transdução de sinais
ar
ó rio nucle
t
Receptor: Envol oroso
p
Proteínas ou glicoproteínas com domínio
6. Receptor
extracelular, transmembrana ou nuclear. Proteín nuclear Proteín
a A ligação do a
mRN L mRN
ADN hormônio permite A
DN
A
ao receptor regular A
a expressão de Fonte: medpri.me
genes específicos.
 Entrada do composto químico na célula
Ligantes:

Peptídeos
Hormônios
Ácido nítrico
Éster
Proteínas
Lipídeos
Ca²⁺

Xenobióticos podem
mimetizar hormônios
(HPAs) ou terem a carga
parecida com os íons
(metais pesados).

Fonte: medpri.me
 Metabolismo energético afetado por xenobióticos
Glicólise

Xenobióticos:
Inibidores dos complexos
Espécies reativas de oxigênio Inibidores síntese de ATP
Fonte: biologiaempauta.com Desacopladores da fosforilação oxidativa
 Espécies reativas de oxigênio (EROS) ou nitrogênio (ERN)
Compostos químicos resultantes da oxidação ou redução do O2 desencadeado pelo metabolismo
natural ou reação a xenobióticos.

Radical livre: Espécies não radicalares

.
Compostos oxidantes > Antioxidante
Proteínas
Estresse oxidativo DNA
MP
Outro radical livre
ē
Peróxido de Radical
hidrogênio hidroxila
Danos em DNA,
H202 Catalisado por
OH proteínas e lipídeos
Fe²+ e Cu²+

Perda de um elétron Radical

Átomo
Oxidação e livre
estável redução
de O₂
camim.com.br
 Estresse oxidativo
Compostos oxidantes resultante do X Sistemas de defesa antioxidante
metabolismo de oxigênio

Geração oxidante endógena Comida e nutrição

Exposições externas diversas
- Bioativos
- Peróxido, carbonila, ROS, RNS, RSS, RCS, RSeS - Cofatores: Enzimas: SOD, Redoxinas, GPx, Catalase

Modificações oxidativas Danos oxidativas em

reversíveis biomoléculas

Regulação redox Desregulação da sinalização redox

Sinalização redox

Fisiologia/saúde Patofisiologia/ doença Medicina redox

 Exemplos de EROD e ERN

Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio

Radicais livres biologicamente relevantes Espécies não radicalares biologicamente relevantes
O2•- : superóxido Atua como agente redutor O2 : Oxigênio singlet
HO : hidroxila
•
DNA, proteínas, H2O2: peróxido de hidrogênio Proteínas e lipídeos
carboidratos e lipídeos
ROOH: hidroperóxidos
ROO• : peroxila Membranas lipídicas orgânicos
RO• : alcoxila HOCl:ácido hipocloroso
NO: monóxido de ONOO: peroxinitrito
nitrogênio (óxido nítrico)
 Estresse oxidativo e reação de Fenton
Presença de metais livres como ferro + H202 desencadeiam a reação de Fenton e Haber-
Weiss gerando o radical OH , que é altamente reativo com macromoléculas biológicas e
não possui sistema enzimático de defesa.
 Atividade enzimática e inibidores
Enzimas catalisam reação convertendo uma substância (substrato) em um produto, sendo específicas.

Enzimas atuam em cadeia,

num determinado conjunto
de reações que formam as
vias metabólicas.

Xenobióticos: afetam a expressão na

enzima, afetam a conformação e o
sítio ativo.

Sítios de ligação

Fonte: Prof. Adriane M. F. Milagres - USP

 Célula nervosa e xenobióticos
Potencial de ação
Repouso Bombas de Na⁺ - K⁺ K⁺ dV – canais de K⁺ Repouso
3 Na⁺ 3 Na 3 Na
⁺ dependentes de voltagem 3 Na ⁺
ATP K⁺ ⁺
2K⁺ 2K⁺ ATP 2K⁺

X
ATP 2K⁺
K⁺ Estímulo K⁺ ATP
K⁺

X
Na⁺ + + -+- Na⁺ K⁺ K⁺ K⁺ K⁺ K⁺

-- --
X
K⁺ Na⁺ Na⁺ Na⁺ Na⁺

-- --
X
+++
Na⁺

++++
--

Na⁺

-- --

++++
Na⁺ Na⁺

X
X
-70 mV K⁺ Na⁺ dV – canais de Na⁺
Canais de vazamento K⁺ +35 mV K⁺ -90 mV K⁺
dependentes de voltagem K⁺ -70 mV

Saída de mais carga positiva faz

com que o interior seja negativo Despolarização Repolarização + Hiperpolarização

Liga-se a enzima que degrada

Entrada na célula mimetizando neurotransmisoor

a
En z i m
ín a
Na⁺ Na⁺ Prote
Xenobiótico
Canal
iônico
Canal sempre aberto
ou bloqueando Interfere nos receptores de membrana
 Célula muscular e xenobióticos
Potencial de ação

Xenóbióticos podem:
• Se ligar aos canais;
• Passar pelos canais; Potencial da placa motora
• Afetar mitocôndrias
• Se ligar a AChE - hiperexcitação pela entrada de Na⁺;
• Dano nos canais de Ca²⁺ e ATPases para contração – Altera citoesqueleto
Excitatório
fadiga muscular

Fonte: BiosLogus
Na⁺ desencadeia potencial de ação e despolariza a membrana muscular

Fonte: edisciplinas.usp.br
 Resposta pós-sináptica
• Sinal pode ser excitatório ou inibitório dependendo do receptor.

Xenobióticos podem se ligar a

esses receptores afetando a
resposta.

Fonte: medpri.me
 Sistemas com altas taxas de trocas iônicas
- Digestório
- Renal
- Respiratório
- Excretor

Xenobióticos passam por canais e transportadores, afetam células produtoras de muco

intestinal, afetam enzimas digestivas, metabólicas e detoxificadoras, estresse oxidativo, se
acumulam na forma de grânulos. Danos teciduais.

Silva, Peres e da Silva, 2012

 Sistema endócrino reprodutor
Xenobióticos como desreguladores endócrinos: não produção de exoesqueleto em artrópodes,
efeitos estrogênicos em machos, alteração na produção de ovos e vitelo, redução da quantidade
de esperma, vitelogenina em machos.

Gônadas de peixe

Hormônio cerebral
Protoracicotrópico
(HPTT)

Macho Fêmea Ecdisona

Receptor de ecdisona
(proteína EcR e proteína USP
é ativado por ecdisteróides.

Redução do HJ
Ecdisotropina estimula produção
de precurssores da
Hormônio gema do ovo no
juvenil corpo gorduroso
Complexo retrocerebral diptera
Richardi et al.
2013
 Expressão gênica e xenobiótico

Alteram cadeia de sinalização

RNA polimerase

Receptor de núcleo
Ribossomo

Alteração da enzima de metilação e acetilação

Dobramento da proteína
Estimula ativação de genes para detoxificação

Ativação da via de morte celular

Altera a função de alguma das enzimas
 Mutação no DNA por Adutos
• Formados quando ocorre uma ligação covalente de uma substância
com as bases nitrogenadas do DNA
Hidrocarboneto policíclico aromático

(Oliveira, 2012) (Bernardo et al., 2016)

 Danos oxidativos em DNA e RNA
A 8-oxoguanina é uma das lesões de DNA mais comuns resultantes de espécies reativas de
oxigênio que modificam a guanina, resultando em substituições de G a T e C a A no genoma.
Como avaliar as alterações causadas pelos compostos químicos?
Biomarcadores

Qual tipo de resposta?

• Neurotoxicidade
• Genotoxicidade
• Biotransformação
• Metabolismo energético
• Estresse oxidativo
Procura protocolos
Procura pesquisas com o grupo com metodologias
que você está trabalhando estabelecidas

• desregulação endócrina
• histopatológico
• Endpoints • Adaptação de protocolos
• Desenvolvimento de
novos protocolos
 Biomarcadores de neurotoxicidade
Efeitos de pesticidas em organismos não-alvo ou busca do sítio-ativo do princípio ativo de um novo pesticida

Análise atividade de acetilcolinesterase

Exemplos:
• Neurocomportamento
• Receptores
• Enzimas
• Transdução do sinal nervoso
 Biomarcadores de neurotoxicidade
Análise atividade de acetilcolinesterase - AChE
Ex: Espectrofotometria de absorbância

Controle

Tratamento 1

Iodeto de + reagente DTNB (gera cor

acetiltiocolina (ATC) na reação com colina)

Tratamento 2

Produtos: colina e ácido acético

Tratamento 3

AChE presente
na amostra
 Atividade enzimática e biotransformação
Enzimas catalisam reações convertendo uma substância (substrato) em um produto.

Algumas enzimas biotransformam em substâncias mais hidrossolúveis e excretáveis,

ou ainda metabólitos intermediários mais reativos
Ambiente

Xenobiótico

(CHOI et al. 2000);AITKEN; ROMAN, 2008;MONTELLA et al. 2012;

Oxidação
Fase I Redução
-Esterases Hidrólise
-CYP450

Organismos
metabólitos Danos ao DNA

Biotransformação
conjugação
Fase II

PALAKSHA & SHAKUNTHALA, 2015)

-GST Glutationa
+ xenobiótico
Glutationa
Substância
hidrofílica

Bastos, 2006 Excreção

 Biomarcadores de biotransformação
Ex: Espectrofotometria de absorbância Ex: Expressão gênica -
PCR em tempo real

Esterase
alfa

Esterase Quantificação da Quantificação da

beta absorbância gerada pelo expressão relativa do
produto da reação da gene de interesse
enzima ao substrato

GST
Biomarcadores de estresse oxidativo

Transferrina
Ferritina β-caroteno
Metalotioneína Licopeno

Trx1
Msr1
Catalase
Grx1
SOD
tocoferol
GPx
 Biomarcadores de estresse oxidativo
↑ Metabolismo = ↑ consumo de oxigênio
↑ consumo de oxigênio = ↑ produção de espécies reativas. Exemplos de
biomarcadores:

Análise direta de metabólitos

(iii) Análise bioquímica de LPO

Enzimas que catalisam

as espécies reativas

Ex.: SOD, CAT,

citocromos c
 Biomarcadores de estresse oxidativo
Enzimas antioxidante/neutralizam espécies reativas de oxigênio (EROS)

• Superóxido dismutase (SOD): Catalisa

a dismutação do ânion superóxido em
peróxido de hidrogênio.

• Catalase (CAT): Decompõe o peróxido

de hidrogênio em água e oxigênio. Ânion Peróxido de
superóxido hidrogênio
(GILLE; SIGLER, 1995; CHOI et al., 2000; QU et al., 2014; LEI et al., 2015)
 Biomarcadores de estresse oxidativo
Peroxidação lipídica - LPO

Ex: Espectrofotometria de absorbância LPO: degradação oxidativa dos lípideos. É o processo através do qual os
radicais livres capturam elétrons dos lípidos nas membranas celulares.

Analisa a concentração de hidroperóxidos:

produtos primários da peroxidação lipídica
Estresse oxidativo e sinalização celular
 Biomarcadores genotoxicidade
Exemplos:

Ensaio cometa Micronúcleos Aberrações cromossômicas

Ghisi 2010
 Biomarcadores genéticos - expressão gênica

Extração Tratamento com

DNAse
Quantificação e Quantificação e Transcrição reversa - RNA em
integridade DNA/RNA integridade de RNA cDNA

Cálculo da expressão relativa do gene de

PCR em tempo real - amplificação e interesse
quantificação do gene de interesse
 Biomarcadores - Endpoint

● Desenvolvimento: atraso, adiantamento

● Razão sexual: proporção macho/fêmea anormal
● Reprodução: Estéril, redução/aumento de ovos/filhotes
● Crescimento: atrofia, aumento/redução de tamanho
● Alimentação
● Locomoção
 Bioacumulação
Bom parâmetro para correlacionar com as alterações!

- Quantidade do composto no organismo

- Compostos predominantes
- Misturas de compostos
- Correlação com alterações de biomarcadores
 Breve levantamento de metodologias para análises

• Espectrofotometria de absorbância e fluorescência

• Imunohistoquímica/Imunocitoquímica
• Espectroscopia por fluorescência de raios-x
• Histologia Eosina-hematoxilina
• Western blotting
• RT-PCR
• Elisa
• Microscopias diversas
 Como escolher biomarcadores e metodologias?

• Levar em consideração a especificidade

• Preço das metodologias
• Estrutura para realização

- Integração de biomarcadores
- Integração de dados físico-químicos para correlação
Biomarcadores para avaliação
de resistência a pesticidas
 Célula nervosa
Potencial de ação
Repouso Bombas de Na⁺ - K⁺ K⁺ dV – canais de K⁺ Repouso
3 Na⁺ 3 Na 3 Na
⁺ dependentes de voltagem 3 Na ⁺
ATP K⁺ ⁺
2K⁺ 2K⁺ ATP 2K⁺

X
ATP 2K⁺
K⁺ Estímulo K⁺ ATP
K⁺

X
Na⁺ + + -+- Na⁺ K⁺ K⁺ K⁺ K⁺ K⁺

-- --
X
K⁺ Na⁺ Na⁺ Na⁺ Na⁺

-- --
X
+++
Na⁺

++++
--

Na⁺

-- --

++++
Na⁺ Na⁺

X
X
-70 mV K⁺ Na⁺ dV – canais de Na⁺
Canais de vazamento K⁺ +35 mV K⁺ -90 mV K⁺
dependentes de voltagem K⁺
Saída de mais carga positiva faz -70 mV
com que o interior seja negativo Despolarização Repolarização + Hiperpolarização

Na⁺ Na⁺

a
En z i m
ín a
K⁺ K⁺ Prote

nd rias
itocô Canal
m iônico
 Deltametrina – modo de ação
Impulso normal Impulso com piretroide
Na⁺ Na⁺ = xenobiótico

Na⁺ Na⁺
Estímulo químico

K⁺ K⁺ +++
+++ Na⁺ ín a
+++ Prote
+++ Na⁺
+++
Na⁺ Canal
Despolarização - repolarização iônico

Canais Na⁺ dV abertos por mais tempo

Na dV: Quatro Despolarização prolongada - Hiperexcitação

domínios (I-IV), cada
um com seis
segmentos helicoidais
que atravessam a
membrana (S1-S6) Os piretroides atuam mediante sua ligação a
uma das subunidades dos canais de sódio
S1 a S4: sensor de voltagem
S5 e S6: módulo de poros
presentes nos neurônios dos insetos.
 Redução da sensibilidade aos inseticidas
(a) Modificações comportamentais, onde o inseto reconhece a
presença do inseticida reduz ou evita o contato

(b) Redução na penetração cuticular, modificações na sua composição

(c) Resistência metabólica, super expressão de genes - enzimas de

detoxificação

(d) Modificação nos sítios alvos dos inseticidas

 Resistência gênica
Mutações em sítios alvos do piretróide – canal Na dV
Mutações kdr (knockdown resistance) e ção l
l
Se tura
Em Aedes no Brasil: Val1016Ile e Phe1534Cys na
Aedes aegypti

Linss et al. 2014

 Correlação sítio ativo do piretroide e
mutações de resistência
Du et al., 2015)

Topologia do canal de sódio Ae. aegypti. (A) Os resíduos de detecção de

piretróides são indicados para PyR1 (círculos abertos) e PyR2 (círculos cinza),
respectivamente. As mutações que são detectadas em populações de campo
resistentes a piretróides estão sublinhadas.
 Resistência metabólica l e ção l
Se tura
na

• Superexpressão ou mudança conformacional de enzimas que estão envolvidas

nos processos de metabolismo, sequestro e excreção de inseticidas.

Moyes et al. 2017

Deltametrina: 750 genes relacionados a P450, GSTE2 e GSTE7

• Alto custo de aptidão: realocação de recursos energéticos

Biomarcadores
• Análise dos Genes KDR
• Analise de expressão gênica das enzimas
• Análise de atividade enzimática
Referências
• O’Reilly AO, Khambay BPS, Williamson MS, Field LM, Wallace BA, Davies TGE (2006) Modelling
insecticide-binding sites in the voltage-gated sodium channel. Biochem J 396:255–263
• Du Y, Nomura Y, Zhorov BS, Dong K (2015) Rotational symmetry of two pyrethroid receptor sites in
the mosquito channel. Mol Pharmacol 88:273–280
• Faucon F, Dusfour I, Gaude T, Navratil V, Boyer F, Chandre F, et al. Identifying genomic changes
associated with insecticide resistance in the dengue mosquito Aedes aegypti by deep targeted
sequencing. Genome Research. 2015; 25: 1347–59. https://doi.org/10.1101/gr.189225.115 PMID:
26206155
• Linss, J.G.B., Brito, L.P., Garcia, G.A. et al. Distribution and dissemination of the Val1016Ile and
Phe1534Cys Kdr mutations in Aedes aegypti Brazilian natural populations. Parasites Vectors 7, 25
(2014). https://doi.org/10.1186/1756-3305-7-25
• Brito LP, Linss JG, Lima-Camara TN, Belinato TA, Peixoto AA, Lima JB, Valle D, Martins AJ. Assessing
the effects of Aedes aegypti kdr mutations on pyrethroid resistance and its fitness cost. PLoS One.
2013 Apr 8;8(4):e60878. doi: 10.1371/journal.pone.0060878. PMID: 23593337; PMCID:
PMC3620451.
• Moyes CL, Vontas J, Martins AJ, Ng LC, Koou SY, Dusfour I, et al. (2017) Contemporary status of
insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses infecting humans. PLoS Negl Trop Dis
11(7): e0005625. https://doi.org/ 10.1371/journal.pntd.0005625