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Citologia e Histologia Geral

Instituto de Cincias Biolgicas Departamento de Morfologia

Profa Valria Ruiz de Souza

Tcnicas Histolgicas
O termo Tcnicas Histolgicas refere-se ao conjunto de metodologias empregadas para a obteno de material biolgico para estudo ao microscpio.

Preparao do material para estudo aos microscpios de luz e eletrnicos


Seqncia de etapas
Remoo do rgo ou parte dele Fragmentao do rgo em pores menores Fixao

9. Montagem

8. Colorao Desidratao

Incluso a. Em parafina para a ML b. Em plstico para a ME Colocao do corte a. Sobre lminas de vidro para a ML b. Sobre grades e redes metlicas para a ME

Microtomia a. Com navalha de ao para a ML b. Com navalha de vidro ou diamante para a ME

Coleta de Material
Consiste na obteno do fragmento de rgo a ser estudado

O rgo retirado do animal anestesiado e recortado em fatias de no mximo 3 mm de espessura.

Fixao
Processo que se destina a matar as clulas, procurando manter sua estrutura preservada, o mais prximo possvel do que seria no animal vivo.

Deixar o fragmento coletado no lquido fixador, por tempo determinado, de acordo com a soluo utilizada. Os lquidos fixadores variam desde uma substncia qumica isolada, como o lcool, o formol, at as misturas fixadoras, como o Bouin.

Incluso
A incluso consiste em colocar o corte em frma, cobrindo-o com parafina lquida, que se fundir temperatura ambiente. Antes de incluir necessrio desidratar a pea, diafanizla e mergulh-la em parafina lquida.

Desidratao - O material imerso em vrios banhos de lcool, em ordem crescente de concentrao, at o lcool absoluto. Diafanizao O material imerso em xilol, para clareamento. Imerso em parafina O material mantido em parafina lquida, a 58 graus (em estufa), por tempo determinado.

Preparao do material para estudo aos microscpios de luz e eletrnicos


Seqncia de etapas
Remoo do rgo ou parte dele Fragmentao do rgo em pores menores Fixao

9. Montagem

8. Colorao Desidratao

Incluso a. Em parafina para a ML b. Em plstico para a ME Colocao do corte a. Sobre lminas de vidro para a ML b. Sobre grades e redes metlicas para a ME

Microtomia a. Com navalha de ao para a ML b. Com navalha de vidro ou diamante para a ME

Microtomia
Consiste na obteno de cortes finos, que sero corados para observao

O bloco de parafina contendo o fragmento colocado no suporte do micrtomo; aps regular a espessura dos cortes em micrmetros, so retiradas fitas de parafina contendo o material.

Planos de observao das clulas


(Dependentes do corte)

(Cedido pela Profa. Gleydes G. Parreira)

Corte histolgico do fgado, observado ao microscpio de luz.

Desenho esquemtico da organizao microscpica do fgado.

Microtomia
Consiste na obteno de cortes finos, que sero corados para observao

.... so retiradas fitas de parafina contendo o material.

A colocao da fita de parafina em banho-maria a 40oC distende os cortes, que so recolhidos em lminas de vidro.

Colorao
necessrio corar para que clulas e tecidos possam ser identificados. Antes de corar necessrio desparafinizar e hidratar o corte.

Colorao e Montagem
Consiste em mergulhar a lmina contendo o corte no(s) corante(s), de acordo com o que se deseja corar; Na montagem, uma gota de resina colocada sobre a lamnula e esta pressionada sobre a lmina, protegendo o corte histolgico.

Corantes

Microscopia
Observao de clulas e tecidos ao microscpio

A lmina deve ser colocada na platina do microscpio, com a lamnula voltada para a objetiva. O foco deve ser ajustado para cada lente objetiva, utilizando-se os parafusos macro ou micromtrico.

MICROSCOPIA PTICA

Ampliao total = aumento da objetiva + aumento da ocular Resoluo: separao de detalhes


Limite de resoluo: menor distncia que deve existir entre dois pontos para que eles apaream individualizados Limite de resoluo do microscpio ptico: 0,2m

MTODOS HISTOQUMICOS PARA EVISENCIAR SUBSTNCIAS PRESENTES NAS CLULAS COLORAES DE ROTINA: HE,Tricrmico de Gmori

COLORAES ESPECFICAS: Intensidade de cor proporcional concentrao DNA: feulgen Polissacardeos (glicognio): PAS RNA: ribonuclease Catecolaminas: formaldedo (fluorescente) Protenas: milton (tirosina) diaminoazobenzeno (triptofano)

TCNICAS HISTOLGICAS (rotina) CORANTES BSICOS: azul de toluidina, hematoxilina CORANTES CIDOS: eosina, orange G, fucsina cida Outros corantes: impregnao pela prata e ouro

E P

E CI

Tecidos epitelial e conjuntivo Corante: hematoxilina e eosina CI

E
100m

E P P P E P P

Tecidos epitelial e conjuntivo Corante: tricrmico de gmori

100m

Tecidos epitelial e conjuntivo Corante: periodic acid shiff (PAS)


E P

CC
100m

TCNICAS HISTOQUMICAS CONCEITO: substncia, radical, grupamentos qumicos PRINCPIOS: compostos no difusveis bom fixador produtos insolveis no se difundem nos reagentes Especificidade e sensibilidade CROMFORO E FLUORFORO Fixao insolvel corada ou fluorescente (histoqumica)

SUBSTNCIAS IDENTIFICVEIS: a)ons: Fe+3 ioniza Fe preso protenas ferrocianeto de K + Fe+ fosfato nitrato de prata b) lpides: sudam IV vermelho sudam negro

SUBSTNCIAS IDENTIFICVEIS: c) Carboidratos

Radical vic-glicol glicognio, glicoprotena neutra, sialomucina


Radical carboxila glicosaminoglicana(GAG) cido carboxilada, sialomucina Radical sulfato GAG cido sulfatada

SUBSTNCIAS IDENTIFICVEIS: d) cidos nuclicos: DNA, Feulgen, RNA

e) Protenas: aa, imunocitoqumica, ag/ac fluorescente

EXEMPLOS 1.PAS (periodic acid shiff) *obteno do reativo de shiff (fucsina bsica + c. Sulfuroso = shiff) *Oxidao do vic-glicol peridico aldedo carb. com vic-glicol + cido shiff + aldedo = PAS +

*Reverso da cor do shiff

Problema: e os outros carboidratos?


Teste: amilase salivar enzima gliconeoltica PAS(?) PAS + : Alcian Blue AB + = sialomucina, tambm PAS + AB- = glicoprotena neutra, somente PAS+

Microscopia de fluorescncia

ANTIGEN

epitope

V
P

Hematoxilina e eosina

100m

Imunolocalizao de colgeno VI Microscopia de fluorescncia E

E P

100m

Microscopia Eletrnica

Microscpio Eletrnico de Transmisso

Microscpio Eletrnico de Varredura

MICROSCPIO ELETRNICO DE TRANSMISSO


Alta resoluo!

Preparao do material para estudo aos microscpios de luz e eletrnicos


Seqncia de etapas
Remoo do rgo ou parte dele Fragmentao do rgo em pores menores Fixao

9. Montagem

8. Colorao Desidratao

Incluso a. Em parafina para a ML b. Em plstico para a ME Colocao do corte a. Sobre lminas de vidro para a ML b. Sobre grades e redes metlicas para a ME

Microtomia a. Com navalha de ao para a ML b. Com navalha de vidro ou diamante para a ME

Preparao de material para observao ao ME


Fixao

Glutaraldedo e

Tetrxido de smio

Incluso
A incluso de material biolgico para observao ao ME feita em resinas como epon, araldite.

Ultra-microtomia

O micrtomo deve ser regulado para obteno de cortes semi-finos e finos.

Colorao/Contrastao

Cortes semi-finos Telinhas contendo os cortes finos

Aquecimento de um ctodo Liberao de eltrons Focalizao dos eltrons

Reflexo dos eltrons pelo objeto IMAGEM

Imagem observada

Micrografia eletrnica de ncleo celular

C N

C
1 m

N
C L
2 m

MET

MEV

MICROSCPIO ELETRNICO DE VARREDURA


Anlise em 3D

Aquecimento de um ctodo Liberao de eltrons Focalizao dos eltrons

Bobina de varredura
Desvio dos eltrons IMAGEM

MEV