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INSTITUTO DE FÍSICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FÍSICA
Maceió
2016
GIVANILDO RODRIGUES DA SILVA
Maceió
2016
Catalogação na Fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecário: Valter dos Santos Andrade
Bibliografia: f. 72-79.
CDU: 539.25
Em memória do meu avô Valeriano e do meu
pai Severino. Dedico esse trabalho em
especial a minha mãe Viliane, e ao meu irmão
Givanaldo, por tudo que fizeram e fazem por
mim e pelo que representam em minha vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelas forças diárias, pelo dom da minha vida, pelas bênçãos concedidas, por
me acalmar nos momentos difíceis e sempre ser meu porto seguro.
Aos meus pais, Severino e Viliane, por todo amor e dedicação. Pelos pilares que
representam na pessoa que sou. Ao apoio incondicional e incentivo em todos os
quesitos de minha vida. A representação, carinho, amor, dedicação que sempre
tiveram comigo, só prova que tudo que eu faça não se compara ao que fizeram e fazem
por minha pessoa. Vocês são meus guerreiros!
Ao meu irmão, Givanaldo, por todo o apoio nas necessidades, pela parceria de sempre,
por ser meu irmão, te amo!
A todos os meus familiares, pelo apoio e incentivo, em especial à tia Ariam, que é uma
segunda mãe pra mim, sou muito grato por tudo que representa em minha vida.
A Ananda que sempre foi uma pessoa muito importante e presente independente da
distância.
A todos os meus amigos, agradeço pelos sorrisos, pelo carinho e apoio de todos.
Larissa, Grazy top, Bruno, Otávio, Pulinha, Lucas, Luana e Mayanne obrigado por
estarem presentes em minha vida mesmo que indiretamente.
Aos meus grandes amigos, desde os tempos de Picos, Leonan, Obedio, Josiel,
Nazareno, Franswilker e a toda galera da casa do sal.
A vocês pela amizade e por serem minhas irmãs: Thamásia e Fabiana vocês não
existem.
Aos meus amigos Cristiano e Camylla do Pará que além de dividirmos despesas,
também compartilhamos muitos sorrisos e bons momentos.
Aos meus amigos cearenses “cabras da peste”, João Paulo e Job, vocês são feras.
Aos amigos que o Instituto de Física me proporcionou, Rubens, Samuel, Elpidio, Rafa e
toda galera do racha.
A todos os colegas e amigos que fiz na UFAL, agradeço pela força e carinho, em especial
a Tainã que sempre me acolheu nos bons e maus momentos. Sua ajuda foi
imprescindível. Obrigado!
A todos meus amigos de Presidente Dutra, Picos e Maceió em geral que eu deixei de
citar.
Ao Samuel, pelo trabalho que desenvolvemos, por toda ajuda e ensinamentos nas
incontáveis horas de laboratório.
A todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
A multi-probe scanning microscopy system was used to study the morphological properties of
cells. Initially, an atomic force microscope was used to characterize and map the surface of
the cell membrane of macrophages. In the present work we investigated the behavior of
murine macrophages in different situations and observed some of the parameters that are
capable of assigning quantitative value, the alterations suffered by the cell membrane. Cells
were adhered to fibronectin films, and also treated with cytochalasin D, to compare with
untreated samples and adhered only to glass. With this procedure it is possible to quantify the
interference of the cellular adhesion to an extracellular matrix, through the parameters of
roughness (mean roughness and quadratic mean roughness) and fractal dimension. The
results of these studies show that cytoskeletal interactions between the cell and the
extracellular matrix can directly affect cell membrane morphology by modifying the cellular
cytoskeletal physical properties. In particular, we analyzed the roughness parameters and
fractal dimension of cells, which are important quantifiers of possible changes in the cell
membrane structure. Finally, we noticed that the technique of atomic force microscopy is
extremely useful for the morphological characterization of biological samples, that the
adhesion of the cell to the extracellular matrix interferes in the changes in the cell morphology
and that in our samples the roughness was a parameter more to quantify these changes than
the fractal dimension.
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 13
2 MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA ............................................................................. 16
2.1 Origem do AFM ......................................................................................................... 16
2.2 Princípio de Funcionamento do AFM .......................................................................... 19
2.2.1 Conceito básico................................................................................................................ 19
2.2.2 Formação da imagem de AFM......................................................................................... 20
2.2.3 Detecção da interação ponta-amostra............................................................................ 21
2.3 Forças de Interação Ponta-Amostra ........................................................................... 23
2.3.1 Força de Van der Walls .................................................................................................... 25
2.3.2 Forças eletrostáticas ........................................................................................................ 26
2.4 Modos Básicos de Funcionamento do AFM ................................................................ 27
2.4.1 Modo contato .................................................................................................................. 27
2.4.2 Modo não contato ........................................................................................................... 29
2.4.3 Modo de contato intermitente ....................................................................................... 31
2.5 Cantilever .................................................................................................................. 32
2.6 Ponta......................................................................................................................... 33
2.7 Scanner e Sistema de Realimentação (feedback) ........................................................ 34
2.8 Artefatos nas Imagens de AFM ................................................................................... 34
2.8.1 Artefatos com origem na ponta ...................................................................................... 35
2.8.2 Artefatos com origem nas vibrações ............................................................................... 36
2.9 Microscópio de Força Atômica do GON ...................................................................... 38
3 RUGOSIDADE ............................................................................................................... 40
3.1 Introdução ................................................................................................................. 40
3.2 Propriedades Geométricas da Rugosidade.................................................................. 42
3.3 Parâmetros de Rugosidade ........................................................................................ 46
3.3.1 Parâmetros de amplitude ou altura ................................................................................ 46
3.3.2 Rugosidade média ........................................................................................................... 48
3.3.3 Rugosidade média quadrática ......................................................................................... 50
3.4 Dimensão Fractal como Análise Complementar .......................................................... 50
3.4.1 Dimensão fractal.............................................................................................................. 51
3.4.2 Método da variância ........................................................................................................ 52
3.4.3 Método da potência espectral ........................................................................................ 52
4 AFM NO ESTUDO DE CÉLULAS ...................................................................................... 54
4.1 Microscopia de Força Atômica Aplicada à Biologia Celular .......................................... 54
4.2 Principais Componentes da Célula no Estudo de sua Morfologia ................................. 55
4.2.1 Membrana Celular ........................................................................................................... 56
4.2.2 Núcleo .............................................................................................................................. 56
4.2.3 Citoesqueleto................................................................................................................... 56
4.2.4 Matriz extracelular .......................................................................................................... 57
4.3 Efeitos da Adesão Celular à Fibronectina .................................................................... 57
4.4 Preparação do Substrato e Cultura das Células ........................................................... 58
4.5 Topografia das Amostras ........................................................................................... 59
4.5.1 Medidas de Ra e RMS ...................................................................................................... 62
4.5.2 Discussão dos resultados das medidas de rugosidade.................................................... 66
4.6 Medidas de Dimensão Fractal .................................................................................... 67
4.6.1 Discussão dos resultados das medidas de dimensão fractal .......................................... 69
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................ 71
REFERÊNCIAS................................................................................................................... 73
13
1 INTRODUÇÃO
Uma importante técnica desse grupo é a microscopia de força atômica, que é a técnica
de caracterização usada em nosso estudo. Com seu sistema de posicionamento refinado,
1 Introdução 14
integrado a cerâmicas piezoelétricas, o AFM (Atomic Force Microscope) controla a forma com
que sua sonda toca a amostra, com forças da ordem de piconewtons, sendo capaz de interagir
com qualquer amostra em qualquer meio, e essa interação pode ser interpretada para a
obtenção das imagens.
No segundo capítulo, detalhamos uma visão geral da técnica de AFM. Sua linha
histórica, os princípios básicos de seu funcionamento e seus principais componentes, além
dos modos de operação, forças existente durante a varredura, artefatos que prejudicam as
imagens e um breve comentário sobre o AFM utilizado em nosso laboratório.
Então em 1986 os mesmos criadores do STM juntos com Quate criaram o AFM13, que
além de alcançar resolução atômica corrigia uma lacuna que o STM deixava, ou seja, o AFM
2 Microscopia de Força Atômica 17
fornecia a vantagem de se poder analisar qualquer amostra, fosse ela condutora ou não, desde
materiais duros como cerâmicas a materiais sensíveis como células biológicas.
Figura 2.1: Representação esquemática dos principais componentes que formam os SPM’s.
Apesar de ter sido criado a partir do STM, as ideias iniciais para o advento do AFM, vêm
desde 1929 com Shmalz23 e o seu perfilômetro (equipamento usado para medir a rugosidade
de matérias em escala microscópica), nele a sonda sempre estava em contato com amostra e
por não haver um controle da força aplicada os dois se chocavam muito e ambos
apresentavam danos, apesar disso alcançava uma ampliação superior a 1000 vezes.
Muitos estudos como o de Becker24 foram feitos pra contornar esse problema, mas só
em 1971, Russel Young25 desenvolveu seu perfilômetro Styllus o “topographiner” onde a
interação entre ponta e amostra ocorria sem contato, e tinha um funcionamento muito
parecido com o STM, mas incapaz de conseguir uma resolução atômica como o AFM atual. Na
figura 2.2 podemos observar um modelo esquemático do perfilômetro de Young.
No perfilômetro a sonda foi montada sobre uma cerâmica piezoeléctrica, que se move
na direção z acima da superfície. Outros piezos movem a ponta nos outros eixos em relação à
amostra. O circuito de realimentação eletrônico monitora a emissão de elétrons e foi usado
para conduzir o elemento piezoelétrico do eixo z, e assim manter a distância entre sonda e
amostra com um valor constante26.
De modo resumido o papel desses componentes pode ser descrito da seguinte forma.
A sonda do AFM é uma ponta afiada que se localiza na extremidade do cantilever fixa a ele.
Essa ponta é colocada em contato ou muito próximo da superfície que se deseja verificar. A
partir disso ocorrem interações altamente localizadas entre a ponta e a amostra.
Figura 2.4: Movimento tridimensional (eixos x, y e z) da ponta sobre a amostra. A imagem topográfica obtida é
construída pelas informações das linhas varridas. As linhas azuis sobrepostas à imagem topográfica de AFM
correspondem aos movimentos de ida e são geralmente chamadas de “Traço”, enquanto que as linhas vermelhas
correspondem aos movimentos de volta e são chamadas de Retraço. Cada ponto de medida tem uma posição x,
y e z bem definida o que permite a reconstrução fiel da estrutura lida pela ponta 29.
As imagens obtidas através do AFM são geradas devido à varredura da ponta sobre a
amostra. Nesta varredura existem forças que interagem com a ponta, essa interação muda
com as diferentes variações topográficas e podem ser verificadas graças às deflexões do
cantilever. Esta deflexão é detectada por meio da reflexão de um ponto de laser em um diodo
foto-sensível de quadrante (PSD) que registra as variações na posição do laser no decorrer da
varredura (que é devidamente posicionado no centro do PSD antes de começar a varredura).
Portanto, enquanto a ponta varre a amostra, o laser ocupa diferentes posições sobre o PSD,
devido às deflexões que o cantilever sofre. Estas diferentes posições são registradas pelo
programa Nano Workshop (NWS) (produzido pela própria Nanonics Imaging Ltd) que converte
essas diferentes posições em variações na altura.
Figura 2.6: Diferentes etapas de uma varredura com detecção a laser. a) laser devidamente posicionado; b) ponta
afastada pelas forças tem o laser detectado acima da posição central pelo PSD; c) ponta atraída pelas forças tem
forças detectadas abaixo da posição central do PSD; d) ponta oscilando, ora atraída ora repulsiva, também oscila
no PSD.
seu sinal amplificado e traduzida em uma variação de altura, que possibilita ao sistema a
formação da imagem32. Na figura 2.7 observamos um diapasão de quartzo.
Figura 2.8: Gráfico das forças de interação entre ponta e amostra em função da distância entre elas.
Tanto as forças atrativas de Van der Waals quanto as eletrostáticas de repulsão de, são
descritos pelo potencial de Lennard-Jones34, que descreve a interação entre os átomos da
ponta e da amostra e pode ser descrito pela expressão a seguir:
𝛼 𝛽
𝑈(𝑧) = ( − 6) (2.1)
𝑧¹² 𝑧
Dipolo-dipolo induzido: Se dão pela interação de uma molécula polar e uma apolar, o
campo de um dipolo permanente induz uma polaridade na vizinhança da molécula
apolar, essas são as chamadas forças de indução (ver figura 2.9b).
Figura 2.9: Forças de van der Walls. a) Forças de orientação; b) Forças de indução; c) Forças de dispersão.
A energia livre para a interação de Coulomb entre duas cargas 𝑞1 e 𝑞2 é dada por:
𝑞1 𝑞2
𝐸𝑒𝑙 = (2.3)
4𝜋𝜀𝜀0 𝑟
Figura 2.10: Esquema do comportamento das forças entre amostra e sonda em função da distância, de acordo
com os diferentes modos do microscópio de força atômica.
íon-íon, que diminui com o aumento da separação ponteira-amostra, a ponta sofre uma força
de repulsão da ordem de 10−9 a 10−7 N37.
A dependência dessa distância das forças repulsivas íon-íon, garante um dos principais
benefícios da técnica de contato a grande resolução espacial atingida. Neste método o
cantilever sofre deslocamentos graças à força de repulsão provocada pelos átomos da
amostra, essa força provoca a deflexão do cantilever que é calculado segundo a lei de Hooke
como:
𝐹 = 𝑘𝑐 ∆𝑧𝑐 (2.4)
onde 𝐹 é a força (N), 𝑘𝑐 é a constante elástica do cantilever (N/m) e ∆𝑧𝑐 (m) é a deflexão do
cantilever.
O cantilever atua na região repulsiva das forças por isso a constante elástica do mesmo
deve ser baixa para que o cantilever tenha mais flexibilidade e danifique menos as amostras.
De fato por estarem sempre em contato, tanto a amostra como a ponta correm o risco de
danificação, principalmente quando se trabalha com amostras moles ou fracamente
adsorvidas, elas são deformadas com certa facilidade, e isso pode causar problemas de
distorção na amostra, ou mesmo remoção do substrato38; 39, por isso esse modo de operação
é indicado para amostras vigorosamente aderentes à superfície como o trabalho de Murphy40.
Na figura 2.11 podemos observar o esquema do modo de operação em contato.
As imagens são geradas graças ao movimento vibracional do cantilever que com ajuda
do elemento piezelétrico, que vibra com uma frequência 𝜔𝑑 , bem próximo da frequência de
𝑑2𝑧 𝑚𝜔0 𝑑𝑧
𝑚 2+ ( ) + 𝑚𝜔0 2 𝑧 = 𝐹0 cos(𝜔0 𝑡) (2.5)
𝑑𝑡 𝑄 𝑑𝑡
𝑚𝜔0
onde, é o termo que indica a intensidade do amortecimento do movimento, e da qual a
𝑄
solução estacionária é :
𝐹0 ⁄𝑚
𝐴0 = (2.7)
𝜔 𝜔 2
2
√𝑄(𝜔0 − 𝜔𝑑 2) + ( 0𝑄 𝑑 )
𝜔0 𝜔𝑑
∅ = tan−1 ( ) (2.8)
𝑄(𝜔0 2 − 𝜔𝑑 2 )
Q é o fator de qualidade do cantilever que depende do meio em que ele está operando, e
podemos observar que quando tivermos um sistema ressonante temos 𝜔0 = 𝜔𝑑 teremos
amplitude máxima. Na figura 2.12 podemos observar o esquema do modo de operação não
contato.
As imagens são geradas pelo mapeamento que dos deslocamentos verticais do scanner
para manter a amplitude constante durante a varredura. Diferente do modo de contato, o
controle da força no contato intermitente entre a ponta e a amostra permite que a sonda
varra materiais macios como, por exemplo, amostras biológicas macias, sem que haja
danificações na amostra ou quebra na ponta48.
2.5 Cantilever
são as mais utilizadas em experiências com AFM: a forma retangular, sendo esta a mais
comum, e a forma de “V”. A Figura 2.14 apresenta duas imagens obtidas por um microscópio
eletrônico de varredura de microcantilevers de dois tipos de cantilevers mais utilizados.
Figura 2.14: Imagens obtidas por um SEM de microcantilevers. (a) cantilever em forma de “V”. (b) cantilever em
forma retangular.
2.6 Ponta
Existem diferentes tipos de scanners que se diferem tanto em sua forma quanto nas
suas propriedades: há os que têm forma de tubo, com altas frequências de ressonância e
desenho mais rígido e os em forma de tripoide que possuem maior alcance de varredura, mas
são menos estáveis. Altas frequências de ressonância são requeridas com o objetivo de
aumentar a velocidade de varredura sem o risco de aparição de vibrações espúrias,
contribuindo assim para uma reprodução sonora sem distorções. O sistema de realimentação,
também conhecido como feedback, é a reação a um estímulo que serve para avaliar os
resultados da transmissão utilizado para acompanhar a topografia da superfície geral ou baixa
frequência associado com inclinação entre o scanner e a amostra50.
Na figura 2.16 temos a comparação entre pontas de formatos diferentes varrendo uma
superfície de determinada altura, a linha determina o perfil obtido ao final da varredura.
Figura 2.16: Artefatos com origem na ponta. Comparação entre pontas de geometrias diferentes.
Apesar dos artefatos apresentados com as pontas diferentes e suas convoluções com
a superfície, as sondas conseguem reproduzir com exatidão os dados topográficos de altura
da amostra.
Na figura 2.17 temos outra comparação entre pontas de formatos diferentes atuando,
só que agora em uma superfície com um buraco, a linha à direita de cada ponta determina o
perfil obtido ao final da varredura.
Figura 2.17: Comparação das linhas de varredura e obtidas com uma ponta de raio de curvatura maior (Esquerda)
e uma sonda afiada de raio de curvatura menor (Direita) em uma amostra comum (buraco).
Vibrações de um andar
Essas vibrações podem ocorrer no andar de um prédio, que pode vibrar para cima e
para baixo com frequência abaixo de 5Hz, e podem interferir nas medidas. Também, podem
ser iniciadas por um evento externo, como um elevador em movimento, um trem passando,
ou mesmo pessoas andando em fora do laboratório AFM. Em suma, as vibrações devem ser
controladas onde o AFM está instalado, caso contrário, estas podem causar estrutura
periódica em uma imagem.
Vibrações acústicas
Vibrações acústicas podem causar artefatos em imagens de AFM. O som pode ser
causado por um avião passando por cima de um edifício ou até mesmo os tons de voz de uma
pessoa. O ruído de ventiladores de resfriamento de outros instrumentos também pode causar
artefatos em imagens de AFM.
Detectar este tipo de interferência é bastante simples; o usuário deve isolar o AFM a
partir das fontes de ruído ou removê-los, e olhar para uma mudança nos sinais registrados. A
solução para que as imagens de AFM não apresentem esses erros é, em alguns casos, o
isolamento da fonte de ruído. A figura 2.18 mostra a comparação entre uma imagem obtida
com a presença de ruído acústico e sem a presença dele.
Figura 2.18: Efeito de ruído acústico em uma imagem. Direita: imagem e linha de perfis medidos enquanto o
ruído acústico estava presente na sala; Esquerda: Imagem que foi medido sem a presença de ruído acústico.
O movimento dos scanners deve também ser de cadeia linear, de modo que as
distâncias medidas a partir das imagens apresentem o menor grau de erro. Sem correção, as
características trarão algumas imperfeições, como dar a ideia de que são menores de um lado
e maiores do outro lado da imagem. Isso acontece quando há mudança drástica na região de
varredura e o scanner não consegue responder automaticamente acontecendo um atraso na
resposta como na figura 2.19. Para contornar essa situação basta reiniciar a varredura e
aguardar que o scanner normalize seu movimento.
Figura 2.19: Imagens de AFM. a) imagem distorcida no início da varredura. b) imagem subsequente sem
distorção. No retângulo verde podemos ver a distorção delimitada.
Figura 2.20: Sistema SPM do GON. (a) Visão externa do sistema SPM do GON. (b) Visão interna mostrando o
microscópio invertido Olympus 4π e o Nanonics Multiview 4000TM . (c) Nanonics Multiview 4000TM.
3 RUGOSIDADE
3.1 Introdução
Sobretudo porque permite o estudo e a avaliação de características das superfícies tais como:
o desgaste da superfície, a qualidade do escorregamento, a qualidade de aderência que a
estrutura oferece às camadas protetoras, resistência à corrosão, a aparência delas, entre
outras52.
Estas irregularidades da superfície dos materiais podem estar ligadas a alguns fatores
que alteram a superfície do material tais como53:
Partículas de sujeira
Figura 3.1: Representação de alguns fatores que podem contribuir para a rugosidade da superfície.
Figura 3.2: Representação da luz sendo espalhada na superfície ao incidir numa superfície rugosa.
Superfície geométrica
Uma superfície geométrica corresponde a uma superfície ideal, onde por definição não
existem erros rugosidades. É uma superfície que não existe, mas suas dimensões são
importantes porque surgem como referência. Podemos observar isso na figura 3.3.
Superfície real
Os desvios da superfície que limitam o corpo em relação à superfície geométrica
caracterizada pelos picos e vales, é uma rugosidade idealizada, chamada de superfície real. Na
figura 3.4 temos uma representação dessa superfície.
Superfície efetiva
A superfície efetiva é aquela medida por uma determinada técnica. Tem forma bem
próxima da superfície real, quanto mais precisa for a medida da rugosidade mais a superfície
efetiva será igual a real. Na figura 3.5 temos o desenho de uma superfície efetiva.
Perfil geométrico
O perfil geométrico corresponde à intersecção de um plano perpendicular com a
superfície geométrica, por definição esse perfil é uma reta perfeita, como na figura 3.6.
Perfil real
Corresponde ao perfil real a intersecção de um plano perpendicular com a superfície
real, esse perfil nos mostrará uma linha irregular, como na figura 3.7.
Perfil efetivo
O perfil efetivo é o perfil obtido após a medição do perfil real, nele estão presentes as
ondulações da superfície e o perfil de rugosidade. Como mostra a figura 3.8, a linha em
vermelho mostra a ondulação da superfície sobreposta a rugosidade
Perfil de rugosidade
O perfil de rugosidade é obtido a partir das medidas adquiridas no perfil efetivo e
consegue mostrar os desvios da superfície a partir da linha média. Na figura 3.9 podemos
observar um perfil de rugosidade.
A rugosidade pode ser caracterizada por vários parâmetros como, por exemplo, os de
amplitude, espaçamento e híbridos55. Em nosso trabalho para calcular a rugosidade usamos
apenas os parâmetros de amplitude que para o nosso estudo é o mais significativo.
Figura 3.10: Perfil de rugosidade com áreas (A1, A2, A3, A4, A5, A6) separados pela linha média.
Rt – Amplitude Total do Sistema, corresponde ao somatório do mais alto pico com o mais
profundo vale, dentro do comprimento que está sendo avaliado.
Rp – Amplitude máxima de pico corresponde ao maior valor da altura de um pico com
relação à linha média.
Rv – Amplitude máxima de vale corresponde ao maior valor da profundidade de um
vale com relação à linha média.
Figura 3.12: Principio de medição para obtenção da Ra nas etapas A, B e C. A, temos as alturas dos picos e vales
traçadas (z1, z2 ... zn, obtidos a partir da linha média). B, transposição dos vales para o eixo. C, obtenção do
parâmetro rugosidade média absoluto.
1 𝑥=𝐿
𝑅𝑎 = ∫ |𝑧(𝑥)|𝑑𝑥 (3.1)
𝐿 𝑥=0
A rugosidade média, Ra, é uma integral do valor absoluto do perfil de rugosidade. Ela
é a área delimitada pelo perfil de rugosidade e pela linha média, dividido pelo comprimento
de avaliação (L), z (x) é a da altura para cada ponto da linha do perfil utilizado na medida.
A rugosidade média é um parâmetro bem definido que pode ser facilmente medido, e
apresenta uma boa variação das alturas na superfície do material e é o parâmetro mais
utilizado para inspeções técnicas nas fabricações de materiais. Porém valores muito distantes
da média podem ser ocultados e com isso os defeitos podem ser escondidos. As formas locais
das irregularidades dos materiais não são definidas e perfis distintos podem apresentar o
mesmo valor de Ra57. Na figura 3.13 temos diferentes perfis de rugosidade que apresentam o
mesmo valor de rugosidade média.
1 𝐿
𝑅𝑀𝑆 = √ ∫ |𝑧²(𝑥)|𝑑𝑥 (3.2)
𝐿 0
RMS é uma medida mais sensível aos picos e vales que se afastam da média do que Ra, isso
porque tem as medidas de altura elevadas ao quadrado o que aumenta o efeito das
irregularidades melhorando a sua determinação, porém também não define as formas das
irregularidades60.
A auto complexidade, também chamada de estrutura fina, refere-se ao fato que uma
pequena parte de um fractal tem os mesmos detalhes que o todo, isto é, não existe a perca
de complexidade entre qualquer uma das partes e o todo. A dimensão fractal está associada
a dimensões fracionárias, já a geometria euclidiana, a dimensões inteiras63; 64.
Figura 3.17: célula de macrófago e sua análise quantitativa e gráfica da dimensão fractal pelo método da
variância.
Tal mensuração é feita através da divisão da superfície em caixas quadradas de igual tamanho,
e a variância é calculada para uma dada caixa em particular. A dimensão fractal é desta forma,
calculada pela expressão 𝐷 = 3 − 𝛽/2, sendo 𝛽 a inclinação da linha de ajuste com os dados,
quando plotados em um gráfico log-log.
Figura 3.18: célula de macrófago e sua análise quantitativa e gráfica da dimensão fractal pelo método da potência
espectral.
Neste capítulo abordaremos o uso da microscopia de força atômica para o estudo de amostras
biológicas. Apresentaremos os principais componentes da célula envolvidos em nosso estudo,
em seguida mostraremos como a adesão celular, a uma matriz extracelular afeta a rugosidade
e a dimensão fractal da membrana plasmática.
Nas últimas décadas o AFM13 tem emergido como uma ferramenta poderosa para
obter detalhes nanoestruturais e propriedades biomecânicas de amostras biológicas29; 65. O
AFM é capaz de mapear e medir diversas alterações na membrana celular, como por exemplo,
a morfologia, as propriedades mecânicas, a rigidez, a viscoelasticidade celular entre outras.
O AFM teve seu surgimento em 1986 e surgiu com a proposta inicial para a obtenção
de imagens topográficas de superfícies, o que ainda é muito utilizado, até os dias atuais,
porque é capaz de descrever de forma quantitativa os detalhes morfológicos sem a
necessidade de preparações preliminares, permitindo a observação em tempo real e com alta
resolução de alterações morfológicas causadas por diversos estímulos66; 67; 68.
Para termos uma ideia, células cancerígenas, por exemplo, diferem de células normais
em seu crescimento, na morfologia, na organização do citoesqueleto e nas interações com a
matriz extracelular70; 71 e a microscopia de força atômica é uma ferramenta muito útil para
detectar e compreender essas diferenças.
Uma única célula pode constituir um organismo e por isso a célula é a unidade
estrutural mínima que define um ser vivo e é formada por uma enorme quantidade de
diferentes moléculas e organelas e são capazes de exercer as funções básicas da vida. A
expressão gênica, estrutural e organizacional, desses componentes determinam os diferentes
tipos de células (desde organismos unicelulares a organizações complexas como tecidos e
mamíferos multicelulares), suas funções, sua comunicação com o meio ambiente circundante,
seu ciclo de vida76.
As interações de células com a matriz extracelular e com seus vizinhos (tecidos, meio)
têm uma grande influência sobre uma vasta variedade de processos biológicos, incluindo a
adesão e migração celular77 e a topografia das amostras pode ser um fator regulador biológico
importante para poder caracteriza-las78; 79.
4.2.2 Núcleo
O núcleo da célula geralmente é localizado em seu centro apesar de que em algumas
células ele apresenta formatos bem distintos. O núcleo é a maior organela da célula e contem
quase todo o material genético (DNA) da célula. O núcleo é delimitado por duas membranas
lipídicas perfuradas por poros nucleares (que mantém a comunicação entre o núcleo e o
citoplasma) e concentra nessa delimitação os seus principais componentes como a cromatina
o nucléolo e o nucleoplasma81. Estudos mostram que os componentes da estrutura celular
estão diretamente ligados ao citoesqueleto e indiretamente ligado à membrana celular
através das integrinas82. Deste modo fatores que modificam o citoesqueleto podem significar
possíveis alterações na estrutura e em modificações na morfologia da célula.
4.2.3 Citoesqueleto
É uma rede emaranhada tridimensional de filamentos de proteínas que se estende por
todo o citoplasma é responsável pela movimentação e direcionamento das estruturas internas
além de peça importantíssima na manutenção e organização da morfologia celular. Os seus
principais componentes são os filamentos intermediários os microtúbulos e os filamentos de
actina81.
exemplo, na fagocitose das células e tem se mostrado como um fator importante na mecânica
do citoesqueleto83. Com isso alterações provocadas ao citoesqueleto podem significar
alterações em sua rigidez celular e em sua morfologia.
Integrinas
As integrinas são proteínas de adesão que mediam sinais por meio da membrana
plasmática respondendo a fatores internos e externos, estabelecem assim uma forma de
comunicação com o citoesqueleto88. Quando os sinais são transmitidos para o interior da
célula podem resultar em uma reorganização do citoesqueleto. E quando os sinais são
originados do interior podem se mover pelas integrinas determinando a adesão celular e
regulando a união da integrina ao ligante89; 90.
impulsionam seus movimentos podem sofrer modificações causadas pela adesão celular a
MEC ou por tratamentos a que seja submetida, pensando nisso estudamos a influência da
MEC nas características das superfícies de macrófagos através do AFM.
Os macrófagos são células imunológicas com alto fator fagocitário e tem formação
envolvida com a resposta a células mortas e infecções. Apresentam-se como os elementos de
defesa imediata contra objetos desconhecidos ao organismo. Os macrófagos derivam
indiretamente de células da medula óssea (depois entram na circulação sanguínea como
monócitos) e a sua principal função é: alertar o sistema imunológico, apresentando antígenos
a organismos nocivos e fagocitando agentes infecciosos90. A ativação dos sinais dos
macrófagos pode ser verificada por meio da adesão e espalhamento sobre a MEC91.
A fibronectina se adere à membrana através das integrinas que ligam a MEC com o
citoesqueleto intracelular, essa adesão é importante na regulação do crescimento celular,
diferenciação e migração celular94. Essa interação permite que as integrinas estabeleçam
contato com os filamentos de actina e esse contato permite a ativação de sinais que regulam
a reorganização do citoesqueleto95. E essa reorganização tem uma influência importante nas
alterações morfológicas das células.
Para a preparação dos substratos utilizados neste trabalho, lamínulas de vidro (16 mm
de diâmetro) foram limpas, mergulhadas por 12 horas em etanol (70%), em seguida, lavadas
com água destilada. Para a preparação dos substratos revestidos com fibronectina, 200mL de
fibronectina (5𝜇g/mL) foi depositada sobre as lamínulas de vidro limpas e deixou-se difundir
completamente durante toda a noite a 4°C. Todos os substratos foram lavados em tampão
fosfato salino (PBS), seguido de incubação a 37°C com solução a 1% de BSA/PBS (soro de
albumina bovino/PBS) para bloquear as ligações não específicas de proteínas.
Figura 4.3: Imagens de AFM de macrófagos (células diferentes) em cultura por 1 sobre, a) vidro, b) fibronectina,
c) Citocalasina D e d) Fibronectina + citocalasina D.
Figura 4.5: célula sem tratamento de edição (esquerda) e com tratamento de edição (direita) do software WSxm.
Com isso o programa WSxM permite o cálculo das rugosidades das regiões escolhidas.
Desta forma obtivemos 25 valores tanto para Ra quanto para RMS, por grupo de células com
e sem correção da inclinação do substrato. A partir destes valores foi calculada uma média
das rugosidades por grupo, estimadas pelas distribuições de alturas das regiões escolhidas nas
imagens de AFM.
Figura 4.6: Gráficos das rugosidades médias obtidas com tratamento e sem tratamento de edição no software
WSxM. A barra de escala representa o desvio padrão. E os percentuais representam as variações com relação ao
vidro (controle). Exceto o tratamento de fibronectina + citocalasina que tem seu percentual com relação ao
tratamento com fibronectina.
Os dados neste capítulo são apresentados como média ± desvio padrão (média±DP),
e quando citados dados com ou sem filtro fazem referencia a utilização ou não da edição do
programa WSxM, que corrige as inclinações do substrato.
células aderidas ao vidro. A rugosidade média do grupo aderido a fibronectina sem edição
aumentou 11,33% com relação ao grupo de células aderidas ao vidro e sem edição
apresentando Ra de 72,5±8,0 nm. Enquanto o grupo aderido a fibronectina com edição teve
Ra de 75,7±6,4 nm e aumentou 16,06% com relação ao grupo de células aderidas ao vidro e
com edição. Ou seja, a fibronectina afetou a rugosidade da célula provocando um aumento
da rugosidade média.
Figura 4.7: Gráficos das rugosidades médias quadráticas obtidas com tratamento e sem tratamento de edição
no software WSxM. A barra de escala representa o desvio padrão. E os percentuais representam as variações
com relação ao vidro (controle). Exceto o tratamento de fibronectina + citocalasina que tem seu percentual com
relação ao tratamento com fibronectina.
Para a rugosidade média quadrática percebemos que todos os valores RMS com filtro
foram maiores que os valores sem filtro até mesmo na amostra controle (vidro) em que o RMS
do vidro com filtro vale 76,9±7,5 nm e o RMS sem filtro vale 76,7±6,9 nm.
Como esperado também temos que todos os valores RMS são maiores que os valores
Ra para cada grupo de células. As células aderidas a fibronectina aumentaram as suas
rugosidades. A RMS da fibronectina com filtro aumentou 17,28% com valor de 90,2±9,2 nm e
a RMS da fibronectina sem filtro teve valor de 87,0±8,0 nm e aumentou 13,37% com relação
aos seus respectivos controles com e tratamento aderidos ao vidro.
Também com relação ao vidro as amostras aderidas ao vidro tratadas com citocalasina
D tiveram queda em suas RMS. A RMS das células apenas tratadas com citocalasina D com
filtro foi de 63,8±7,2 nm e caíram 17,05% com relação ao controle em vidro e o mesmo grupo
sem filtro teve RMS de 53,1±8,5 nm tendo queda de 30,73% com relação ao controle em vidro
sem filtro.
Podemos perceber que as interações entre célula e MEC mediada pelo citoesqueleto,
podem de acordo com nossas medidas influenciar nas alterações na morfologia da membrana
celular e também que com o tratamento das imagens com o filtro “flatten”, do programa
WSxM, interfere nos valores de rugosidade, tendo em vista que todos os grupos que foram
tratados apresentaram maiores valores para os valores Ra e RMS da rugosidade.
Como já explicado cada grupo contém 5 células, obtivemos a dimensão fractal média
por grupo de células (vidro, fibronectina, citocalasina com fibronectina e citocalasina).
Calculamos os valores médios por grupo para as imagens de erro e de amplitude, as análises
dos métodos de dimensão fractal foram realizadas pelo software Gwyddion que é um
programa livre e de código aberto para visualização e análise de dados SPM 99. Através desse
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4 AFM no Estudo de Células 68
Figura 4.8: Resultados das medidas de dimensão fractal média por grupo. a) imagens de erro e b) imagem de
amplitude.
Na figura 4.8 estão expostos os valores da dimensão fractal média por grupos de
diferentes situações, calculados por dois métodos o da variância e o da potência espectral.
Com o método da potência espectral, aplicado nas imagens de erro todos os grupos
alcançaram valor maior para a dimensão fractal média, do que os resultados no método da
variância também nas imagens de erro. A dimensão fractal média pelo método da potência
espectral no grupo controle aderido ao vidro, foi de 2,756 e a do grupo aderido a fibronectina
teve leve queda alcançando 2,728. O grupo aderido ao vidro e tratado com citocalasina,
obteve o maior valor, sendo este de 2,774. O grupo aderido a fibronectina e tratado com
citocalasina muito próximo ao apenas aderido a fibronectina tendo dimensão fractal igual
2,72.
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Tabela 4.1: Resultados das medidas de dimensão fractal média usando as imagens do erro e da amplitude de
cada grupo. As setas indicam o crescimento ou decaimento com relação a situação controle.
5 CONCLUSÃO
Quatro parâmetros foram utilizados para avaliar a rugosidade das amostras, sendo
dois deles métodos de dimensão fractal e os outros dois parâmetros de rugosidade. Na análise
via dimensão fractal conseguimos perceber alterações na complexidade da membrana,
sobretudo pós analise das imagens de erro e amplitude do AFM que detectaram essas
mudanças. A partir dos diferentes valores que a dimensão fractal assumiu nas diferentes
situações a que os macrófagos foram submetidos, e quanto maior os valores obtidos para a
dimensão fractal, maior a complexidade da membrana. Os valores encontrados pelos
métodos da potência espectral e da variância se correlacionam, havendo apenas uma
pequena dessemelhança nos resultados obtidos no grupo de células aderidas ao vidro e
tratadas com citocalasina D.
5 Conclusão 72
REFERÊNCIAS
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