UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DAS

RELAÇÕES PARASITO-HOSPEDEIRO

LORRANE SOUZA NEVES

Prevalência, perfil de suscetibilidade e caracterização

molecular de Staphylococcus aureus isolados de uma linha
de ônibus do sistema de transporte público coletivo do
município de Goiânia-GO.

Goiânia
2016
iii
 LORRANE SOUZA NEVES

Prevalência, perfil de suscetibilidade e caracterização

molecular de Staphylococcus aureus isolados de uma linha
de ônibus do sistema de transporte público coletivo do
município de Goiânia-GO.

Dissertação de Mestrado
apresentado ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia das Relações
Parasito-Hospedeiro da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do
título de mestre

Orientadora: Profª. Drª. Juliana

Lamaro Cardoso
Co-orientadora: Profª. Drª. Maria
Cláudia D. P. B. André

Goiânia
2016
ii
iv
v
 Programa de Pós-Graduação em Biologia das Relações Parasito-
Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluno (a): Lorrane Souza Neves

Orientador (a): Juliana Lamaro Cardoso
Co-orientador (a): Maria Cláudia D.P.B. André

Membros:

1. Juliana Lamaro Cardoso

2. Yves Mauro Fernandes Ternes

3. Juliana Alves Parente

Data: 15/07/16

vi
vii
Aos meus amados pais Edivaldo Neves da
Silva e Simone Souza Pereira Neves.

viii
 AGRADECIMENTOS

À Professora Dra. Juliana Lamaro Cardoso, minha orientadora, por

me conceder, mais uma vez, a oportunidade de trabalhar sob sua
supervisão. Obrigada pela orientação, pela paciência, por me estimular na
busca diária do conhecimento e por compartilhar comigo seu aprendizado.
Seu profissionalismo, companheirismo, paixão pelo trabalho e bom humor
me complementou em competência e me fez enxergar horizontes grandiosos
dentro de um mundo que é minúsculo aos olhos, mas excepcional em
importância.

À Professora Dra. Maria Cláudia D. P. B. André, minha co-

orientadora, pelo exemplo de caráter, esforço, ética e competência.
Agradeço pela disponibilidade em sanar dúvidas, pela dedicação ao trabalho
no laboratório e pelos momentos de descontração. Sua ajuda foi de
essencial importância, sem a qual não seria possível a finalização deste
trabalho.

Ao Nelson Dias pelo auxílio durante as etapas de coleta e isolamento

e por suportar as dificuldades do árduo trabalho.

À RMTC pelo apoio prestado e por permitir que as coletas fossem

realizadas em horários flexíveis, dando liberdade e dinamismo para a
pesquisa.

À toda equipe do laboratório: Fernando, Tainá, Barbara, Cyndi,

Jéssica, Robmary e Luana. Agradeço pelos momentos de descontração,
pelas palavras de consolo e paz, pelos ensinamentos diários, pelo estresse,
pela amizade e principalmente por demonstrar o significado do trabalho em
equipe. A presença de vocês foi essencial em minha formação, pois em
conjunto aprendemos a superar as dificuldades, nos tornamos mais fortes,
mais sábios, menos egoístas, mais competentes e motivados.

ix
 Aos meus pais, Edivaldo e Simone, que me forneceram educação
digna. E mesmo diante de anos cheios de dificuldades, me apoiaram em
minhas decisões e sempre buscaram me compreender. A vocês agradeço o
genuíno interesse pela minha formação e felicidade. Penso que nunca
saberei o verdadeiro valor de seus esforços e também nunca saberei como
retribuir. Amo vocês!

Aos meus amados irmãos, Vinícius e Luana, que sempre me

divertem, respeitam e me fazer crer em minha capacidade.

Aos membros das bancas de qualificação e defesa, pela

disponibilidade e por colaborarem para melhoria deste trabalho.

Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Biologia das

Relações Parasito-Hospedeiro por contribuir em meu crescimento,
fornecendo aprendizado de qualidade e estimulado nosso desenvolvimento
no campo científico.

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biologia das

Relações Parasito-Hospedeiro, pela atenção e disponibilidade.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pelo apoio financeiro.

x
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ........................................................ 1

1.1 O SISTEMA DE TRANSPORTE PÚBLICO COLETIVO ................................. 2

1.2 Staphylococcus aureus ........................................................................................ 5

1.2.1 Epidemiologia do Staphylococcus aureus................................................. 7

1.3 VIRULÊNCIA EM S. aureus ................................................................................ 9

1.3.1 Superantígenos (SAgs) ............................................................................ 10

1.3.2 Leucocidina de Panton-Valentine ......................................................... 15

1.3.3 Hemolisinas ................................................................................................ 17

1.4 RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS ........................................................... 18

1.4.1 Mecanismo de Resistência à Meticilina .............................................. 20

1.4.2 HA-MRSA e CA-MRSA.............................................................................. 22

1.4.3 Relação MRSA-Fômites ........................................................................... 26

1.4.4. Fenótipo MLS (Macrolídeos, Liconsaminas e Estreptrograminas) .. 28

2 JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 31

3 OBJETIVOS ................................................................................................................. 33

3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 33

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................. 33

4 MÉTODOS ................................................................................................................... 34

4.1 AMOSTRAGEM ................................................................................................... 35

4.2 PROCEDIMENTOS MICROBIOLÓGICOS ..................................................... 35

4.3 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO .................................................................. 36

4.4 PCR PARA DETECÇÃO DO GENE femA ...................................................... 36

4.5 TESTES DE SUSCETIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS........................... 37

4.5.1 Teste de disco-difusão ............................................................................ 37

4.5.2 Determinação da concentração inibitória mínima............................ 38

xi
 4.6 PCR PARA DETECÇÃO DO GENE mecA ..................................................... 39

4.7 MULTIPLEX PCR PARA TIPAGEM DO SCCmec ......................................... 39

4.8 PCR PARA DETECÇÃO DO GENE lukS-F CODIFICADOR DA

LEUCOCIDINA DE PANTON-VALENTINE................................................................. 41

4.9 MULTIPLEX PCR PARA DETECÇÃO DE GENES CODIFICADORES DE

FATORES DE VIRULÊNCIA ......................................................................................... 42

4.10 ELETROFORESE EM GEL EM CAMPO PULSADO (PULSED FIELD GEL

ELECTROPHORESIS – PFGE).................................................................................... 43

4.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................... 45

5 RESULTADOS............................................................................................................. 46

5.1 PREVALÊNCIA DE CONTAMINAÇÃO/COLONIZAÇÃO POR S. aureus . 47

5.2 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ...................... 48

5.3 DETECÇÃO DO GENE mecA........................................................................... 50

5.4 TIPAGEM DO SCCmec...................................................................................... 51

5.5 DETECÇÃO DOS GENES RESPONSÁVEIS POR CODIFICAR FATORES

DE VIRULÊNCIA ............................................................................................................. 52

5.5.1 Detecção do gene lukS-F (Leucocidina de Panton-Valentine) ............ 52

5.5.2 Detecção dos genes que codificam enterotoxinas, toxinas

esfoliativas, hemolisinas e toxina da Síndrome do Choque Tóxico por
multiplex PCR............................................................................................................. 52

5.6 PFGE ..................................................................................................................... 55

6 DISCUSSÃO ................................................................................................................ 59

7 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 77

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 78

xii
 TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

Figura 1. Terminal Praça da Bíblia. ................................................................................... 3

Figura 2. Plataforma Estação Botafogo. ........................................................................... 4

Figura 3. Mapa completo da linha Leste-Oeste............................................................... 4

Figura 4. Microscopia ótica de Staphylococcus aureus corado pela técnica de

coloração de Gram................................................................................................................ 6

Figura 5. Interação do SAg, TCR e MHC classe II. ...................................................... 11

Tabela 1. Classificação das enterotoxinas estafilocócicas codificadas em MGEs .. 12

Quadro 1. Principais tipos de SCCmec identificados em S. aureus .......................... 22

Figura 6. Comparação dos SCCmec típicos para HA-MRSA (SCCmec II) e CA-
MRSA (SCCmec IV). .......................................................................................................... 24

Quadro 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para tipagem do SCCmec ....... 40

Quadro 3. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a detecção de genes de

virulência em S. aureus ...................................................................................................... 43

Figura 7. Fluxograma dos resultados obtidos. ............................................................... 46

Figura 8. Eletroforese para detecção do gene femA. ................................................... 47

Figura 9. Prevalência de S. aureus identificados estratificado por superfícies. ....... 48

Tabela 2. Perfil de suscetibilidade dos os S. aureus aos antimicrobianos testados 49

Figura 10. Teste de disco-difusão juntamente com o teste D para determinação do

perfil de suscetibilidade e do fenótipo MLSB nos S. aureus isolados. ........................ 49

Figura 11. Determinação da concentração mínima inibitória para os S. aureus

resistentes à cefoxitina por meio de Etest®.................................................................... 50

Figura 12. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR para detecção do
gene mecA. .......................................................................................................................... 51

Figura 13. Multiplex PCR para tipagem de SCCmec. .................................................. 51

Figura 14. Eletroforese para detecção do gene lukS-F responsável pela

codificação da Leucocidina de Panton-Valentine. ......................................................... 52

Tabela 3. Perfis de fatores de virulência encontrados nos S. aureus isolados do

sistema de transporte público de Goiânia-GO................................................................ 53

Figura 15. Eletroforese dos produtos da PCR multiplex I. ........................................... 54

xiii
Figura 16. Eletroforese dos produtos da PCR multiplex II. .......................................... 55

Figura 17. Dendrograma resultante da análise da comparação dos perfis de

restrição dos S. aureus isolados do sistema de transporte público coletivo de
Goiânia. ................................................................................................................................. 56

Figura 18. Dendrograma resultante da comparação entre isolados MRSA do estudo

e clones MRSA mundiais. .................................................................................................. 58

xiv
 SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

ACME – Arginine Catabolic Element

APC – Antigen-Presenting Cell

ATCC – American Type Culture Collection

BEC – Brazilian Endemic Clone

CA-MRSA – Community-associated Methicillin-resistant Staphylococcus

aureus

CDC – Centers for Disease Control and Prevention

CIM – Concentração Inibitória Mínima

CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

cMLSB– constitutive MLSB phenotype

DTA – Doenças Transmitidas por Alimentos

ECN – Estafilococos Coagulase Negativa

ET – Esfoliative Toxin

HA-MRSA – Hospital-associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

HLA – Hemolisina α

HLB – Hemolisina

IC 95% - Intervalo de Confiança 95%

iMLSB – inducible MLSB phenotype

MGE – Mobile Genetic Element

MLSB – Macrolide, Lincosamide and Streptogramin B

MRSA – Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

MSSA – Methicillin-susceptibleS. aureus

NTED – Neonatal Toxic Shock like Exanthematous Diseases

ORF – Open Reading Frame

xv
OSPC – Ocean Southwest Pacific Clone

PBP – Penicillin Binding Protein

PCR – Polymerase Chain Reaction

PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis

PMN – Célula Polimorfonuclear

PVL – Panton-Valentine Leucocidin

RMTC – Rede Metropolitana de Transporte Coletivo

SAg – Superantigen

SCCmec – Staphylococcal Cassette Chromosome mec

SE – Staphylococcal Enterotoxin

SEl – Staphylococcal Entetotoxins like Enterotoxins

SFP – Staphylococcal Food Poisoning

SSSS – Staphylococcal Scalded Skin Syndrome

SSTI –Skin and Soft Tissue Infection

TCR – T-Cell Receptor

TSS – Toxic Schock Syndrome

TSST-1 – Toxic Shock Syndrome Toxin 1

xvi
 RESUMO

Staphylococcus aureus é um importante agente de infecções relacionadas

com a assistência à saúde e à comunidade. As superfícies ambientais,
especialmente as que estão em frequente contato com as mãos, podem
atuar como reservatórios de micro-organismos, funcionando como fômites
na disseminação microbiana. No sistema de transporte coletivo, superfícies
de contato com as mãos podem operar como veículos de transmissão,
auxiliando na dispersão de S. aureus na comunidade. O objetivo do estudo
foi determinar a prevalência de S. aureus e S. aureus resistente a meticilina
(MRSA) em ônibus, terminais e plataformas da maior linha de carregamento
do sistema de transporte público do município de Goiânia-GO, analisar o
perfil de suscetibilidade e de virulência e avaliar a similaridade genética entre
os S. aureus isolados. Foram coletados 852 swabs das barras fixas verticais
e horizontais dos 90 ônibus circulantes na linha Leste-Oeste, além das
catracas de todas as plataformas e terminais ao longo da linha. O isolamento
de estafilococos foi realizado por técnicas padronizadas e a identificação da
espécie, pela detecção do gene femA. Os S. aureus identificados foram
submetidos a testes de suscetibilidade a antimicrobianos, PCR convencional
para detecção dos genes Meca e lukS-F, multiplex PCR para detecção de
genes para fatores de virulência, tipagem de SCCmec e PFGE. A
prevalência de contaminação das barras fixas e das catracas por S. aureus
foi de 17,7% (151/852). MRSA foi detectado em 0,5% das amostras. O
fenótipo conhecido como iMLSB foi detectado em 41,0% (62/151) dos
isolados. Vários perfis de virulência foram detectados em 43 isolados
(28,5%). A análise de PFGE revelou grande diversidade genética de cepas
circulantes, inclusive MRSA semelhante ao USA300 e outro ao USA800. Os
resultados sugerem que os S. aureus e MRSA, possuindo perfis de
suscetibilidade e virulência diferenciados, estão inseridos na comunidade,
podendo ser transmitidos entre indivíduos por intermédio de fômites,
colocando a população usuária do serviço em risco.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus, MRSA, Transporte coletivo,

virulência, MSSA, fômites.

xvii
 ABSTRACT

Staphylococcus aureus is an important agent of health care and community

infections. Environmental surfaces, especially those in frequent contact with
the hands, can serve as reservoirs of microorganisms, working as fomites in
microbial spread. In the public transportation system, contact surfaces with
hands can act as transmission vehicles, assisting the dispersion of S. aureus
in the community. The aim of this study was to determine the prevalence of
S. aureus and methicillin resistant S. aureus (MRSA) in buses, terminals and
platforms of a larger route of the public transportation system in the city of
Goiânia-GO, to determine the susceptibility and virulence profiles and assess
the genetic similarity among S. aureus isolates. We collected 852 swabs
fromhandrails of buses and ratchets of platforms and terminals that compose
the East-West line. The isolation of staphylococci was done by standard
techniques and species identification by detection of the femA gene. S.
aureus identified were submitted to antimicrobial susceptibility testing,
conventional PCR for detection of mecA and lukS-Fgenes, multiplex PCR to
detect virulence factors genes, SCCmec typing and PFGE to assess the
genetic similarity among strains. The contamination prevalence of handrails
and ratchets by S. aureus was 17.7% (151/852). MRSA was detected in
0,5% of samples. The phenotype known as iMLSB was detected in 41.0%
(62/151) of the isolates. Several virulence profiles were detected in 43
(28.5%)isolates, PFGE analysis revealed extensive genetic diversity of
circulating strains, including MRSA strains similar to USA300 and USA800.
The results suggest that S. aureus and MRSA strains, showing different
susceptibility and virulence profiles are circulating in the community. They
may be transmitted between individuals through fomites, putting the user
population of the service at risk.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus, MRSA, public transport, virulence,

MSSA, fomites.

xviii
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

Animais e seres humanos possuem uma microbiota endógena.

Trata-se do complexo conjunto de micro-organismos que habita o corpo e
estabelecem relações interespecíficas não causando danos ao indivíduo e
muitas vezes cumprindo um papel importante na sobrevivência destes. A
microbiota normal do corpo humano é abundante e habitualmente não
provoca doença, além disso, participa do metabolismo dos produtos
alimentares, provê fatores de crescimento, protege contra infecções por
micro-organismos altamente virulentos e estimula a resposta imune (Cho &
Blaser 2012; Colladoet al. 2012).
No entanto, sabe-se que a maioria das doenças infecciosas no
homem é causada por patógenos oportunistas, organismos que tipicamente
compõem a microbiota humana, mas que em condições propícias
estabelecem infecção. Bactérias como Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli e espécies de Salmonella,
apesar de constituírem a microbiota autóctone podem ser importantes
agentes de processos infecciosos (Von Graevenitz 1977; Collado et al.
2012).
A exposição de um indivíduo a um micro-organismo pode levar a um
dentre três resultados: colonização transitória, colonização permanente ou
infecção. A colonização assintomática caracteriza no indivíduo o estado de
“portador”. Os micro-organismos que colonizam o homem não prejudicam as
funções normais do corpo, enquanto que a infecção ocorre quando há
invasão, desenvolvimento e multiplicação do agente infeccioso em sítios
normalmente estéreis do hospedeiro. As lesões provocadas por essas ações
e pela resposta imunológica do indivíduo resultam em um processo
patológico, o que caracteriza a doença (Murray et al. 2009).
A transmissão de bactérias patogênicas de portadores ou pessoas
infectadas ocorre por diversas vias: ar, vetores, fonte comum e
primariamente via contato (direto ou indireto) (Morganet al. 2013; Derde et
al. 2014, Hogan et al. 2015). Entretanto, tem sido observado que os micro-
organismos possuem capacidade de sobreviver por dias ou meses em

1
objetos inanimados (fômites) assumindo assim, papel importante como
agentes de transmissão. As pessoas estão continuamente em contato com
uma ampla variedade de superfícies que podem servir como veículos ou
reservatórios de micro-organismos patogênicos, isso potencializa o
mecanismo de transmissão por contato indireto, destacando os fômites
como veículos de transmissão cruzada (Gerba & Pepper2009).
Entre as superfícies ambientais, aquelas que frequentemente estão
em contato com as mãos são particularmente importantes na transmissão
indireta de micro-organismos. As mãos albergam uma microbiota altamente
diversificada, tanto quantitavamente como qualitativamente, atuando como
veiculadora de agentes microbianos, portanto, essa troca microbiológica
entre indivíduos e fômites pode facilitar a ocorrência e disseminação de
doenças infecciosas (Judahet al. 2010). Neste contexto, as superfícies de
contato com as mãos em veículos do sistema de transporte público coletivo
podem ser potenciais fontes ambientais de patógenos para os seus usuários
(Yehet al. 2011; Fernandes et al. 2012; Iwao et al. 2012).

1.1 O SISTEMA DE TRANSPORTE PÚBLICO COLETIVO

A grande maioria das áreas urbanas de médio e grande porte possui

algum tipo de transporte público urbano. Sendo ele parte essencial da
cidade, idealmente, deve constituir o meio de locomoção primário garantindo
melhor qualidade de vida e assegurando o direito de ir e vir de seus
cidadãos. Exercendo seu papel, o transporte público coletivo permite o
acesso do cidadão contemporâneo às necessidades básicas de
deslocamento como ir ao trabalho, escola, áreas de lazer, hospitais e
cidades vizinhas (Oliveira 2003).
Na cidade de Goiânia o serviço de transporte público está
organizado em uma rede de serviços denominada Rede Metropolitana de
Transporte Coletivo (RMTC), que é responsável por assegurar a
universalidade, acessibilidade e mobilidade da população. A RMTC abrange
18 municípios que formam a região metropolitana de Goiânia, atendendo
uma área territorial de 6.576 km2. A estatal Metrobusencontra-se vinculada à

2
prestação de serviços à RMTC por força de contratos de concessão, ela é a
empresa responsável pela maior linha de carregamento da região
metropolitana de Goiânia, a linha Leste-Oeste, ou Eixo-Anhanguera (RMTC
2013).
No cenário atual do sistema de transporte público da Região
Metropolitana de Goiânia, a linha Leste-Oeste, que possui extensão de 13,5
Km, ostenta papel de distinção como principal eixo de estruturação, de
interconexão de linhas e distribuição da demanda da RMTC, sendo a linha
de maior carregamento do sistema, transportando aproximadamente
200.000 passageiros em dias úteis (Metrobus 2014).
Ao longo da Avenida Anhanguera, por onde circula a linha Leste-
Oeste, estão implantados cinco terminais de integração de passageiros
(figura 1) onde fazem integração de aproximadamente 80 linhas (35,0% do
total da rede), além de 19 estações elevadas (plataformas) de embarque e
desembarque de passageiros (figura 2), localizadas na parte central da via.
A linha serve a regiões de elevada concentração populacional, com
destaque para a região central de Goiânia e municípios vizinhos como
Aparecida de Goiânia, Goianira, Trindade e Senador Canedo. Dos 18
municípios que compõem a Rede Metropolitana de Transporte Coletivo, 15
deles possuem linhas que se integram diretamente nos terminais do Eixo
Anhanguera, cujos moradores realizam em média 300.000 viagens/mês
(Metrobus 2014).

Figura 1. Terminal Praça da Bíblia (principal terminal de integração da região Leste de Goiânia).

3
 Figura 2. Plataforma Estação Botafogo (estação elevada ao longo da linha Leste-Oeste).

Noventa ônibus circulam diariamente pela linha Leste-Oeste, sendo

a maior frota operacional do sistema e a com maior produtividade. A linha
trafega pelo centro da capital, bairro de Campinas e Setor Universitário
(figura 3), que são os três maiores polos de atração de viagem de todo o
sistema, portanto, transporta uma grande quantidade e heterogeneidade de
pessoas, passando por diferentes bairros, fazendo seu papel de distinção
como principal eixo corredor do sistema de transporte público coletivo da
região metropolitana de Goiânia (Metrobus 2014).

Figura 3. Mapa completo da linha Leste-Oeste. As plataformas estão representadas em azul e os terminais
em laranja.Fonte: METROBUS 2014. Disponível em: http://www.sgc.goias.gov.br/upload/arquivos/2013-
10/mapa-eixo.jpg

4
 Em geral, a população usuária dos serviços de transporte em massa
é constituída por pessoas de classes sociais diferenciadas, com graus de
conhecimento e noções de educação higiênico-sanitárias variadas. A grande
aglomeração e circulação de pessoas nos veículos de transporte público
aliada às práticas higiênicas insuficientes contribuem para que o ambiente
do sistema de transporte coletivo seja um fator de risco para a segurança e
saúde da população usuária, pois potencializa o processo de disseminação
e transmissão de patógenos. Neste sentido, as superfícies de contato com
as mãos nos ônibus, plataformas e terminais de integração podem servir
como reservatório de micro-organismos, atuando como fômites de
disseminação microbiana (Murta & Massara 2009; Fernandes et al. 2012;
Mendes et al. 2015).
Muitos grupos de pesquisa têm se dedicado a demonstrar a
importância dos fômites na epidemiologia de bactérias, vários deles têm
detectado níveis variados desses micro-organismos nos sistemas de
transporte coletivo e outras superfícies (Stepanović et al. β008; Otter &
French 2009; Eibicht & Vogel 2011; Lutz et al. 2014). No Brasil, alguns
trabalhos têm recuperado bactérias como Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Estafilococos Coagulase Negativa (ECNs), além de fungos e formas
de resistência de parasitos de superfícies dos veículos do transporte público
em massa (Rodrigues et al. 2006; Mendonça et al. 2008; Borges et al. 2009;
Murta & Massara 2009; Fernandes et al. 2012).
Dentre os micro-organismos citados o S. aureus recebe destaque
por ser comumente associado a infecções humanas. Esse micro-organismo
tem sido frequentemente isolado desses veículos em diversas partes do
mundo e a prevalência de contaminação é bastante variável (Simões et al.
2011; Conceição et al. 2013; Lutz et al. 2014, Mendes et al. 2015).

1.2 Staphylococcus aureus

O nome do gênero Staphylococcus é derivado do termo grego

Staphylé, que significa “cachos de uva”, pois refere-se ao padrão de
crescimento dos estafilococos que se assemelha a cachos de uva. Essas

5
bactérias são cocos Gram-positivos pertencentes à família
Staphylococcaceae, que na microscopia ótica podem se apresentar
isoladamente, dispostos aos pares ou em cadeias curtas (figura 4). Em sua
maioria tem tamanho aproximado entre 0,5 e 1,5 µm de diâmetro, são
imóveis, anaeróbios facultativos e capazes de crescer em meio contendo
elevada pressão osmótica (preferencialmente altas concentrações de NaCl,
até 10%) (Kloos 1997; Murray et al. 2009).

Figura 4. Microscopia ótica de Staphylococcus aureus

corado pela técnica de coloração de Gram.
Fonte:http://pt.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus

Dentro do gênero Staphylococcus a espécie mais virulenta e

conhecida é o Staphylococcus aureus, que pode ser diferenciada das outras
espécies de Staphylococcus por algumas características como pigmentação
da colônia, fermentação do manitol, teste positivo da coagulase e da
desoxirribonuclease (Anvisa 2013).
Essa bactéria tem o ser humano como seu principal reservatório,
sendo que seu nicho ecológico preferencial são as narinas anteriores,
entretanto, pode ser encontrado na pele, períneo e membranas mucosas
(Cursino et al. 2012; Dastgheyb & Otto 2015). Em adição, tem se verificado
que o S. aureus possui capacidade de sobreviver em superfícies inanimadas
por consideráveis períodos de tempo, de dias a meses, aumentando o risco
de transferência para o organismo humano (Desai et al. 2011; Zarpellon et
al. 2015).

6
1.2.1 Epidemiologia do Staphylococcus aureus

Os seres humanos são comumente colonizados pelo S. aureus,

sendo esse um evento mais comum que a infecção. A colonização pode
ocorrer logo após o nascimento e recorrer a qualquer momento durante toda
a vida do indivíduo. Aproximadamente 20,0% da população é portadora
persistente de pelo menos uma cepa de S. aureus, uma ampla proporção,
em torno de 60,0%, são portadores intermitentes com variações constantes
do tipo de cepa colonizadora e até 20,0% são não portadores, ou seja,
indivíduos que praticamente não são colonizados (Wertheim et al. 2005).
O S. aureus atua como agente de ampla gama de infecções, desde
as localizadas e superficiais até as profundas, sistêmicas e potencialmente
fatais (Tong et al. 2015). Em geral, as doenças causadas por esse micro-
organismo podem ser decorrentes da invasão direta dos tecidos, da
bacteremia primária, ou ser devido à produção de toxinas e/ou enzimas.
Alguns fatores de risco são tradicionalmente associados à
colonização/infecção por S. aureus como hospitalização ou tempo de
internação prolongado, ser profissional da saúde, uso de drogas injetáveis,
ser portador de diabetes tipo 1, realização de hemodiálise e outros
procedimentos invasivos, viver em aglomeração e imunodebilidade
(Chambers 2001;Chang et al. 2015).
A colonização é o principal fator de risco para infecção, uma vez que
indivíduos colonizados são importantes fontes de S. aureus, auxiliando na
disseminação de cepas entre pessoas. O modo de transmissão primário é
por contato direto com indivíduos infectados ou colonizados, entretanto, o
contato com objetos e superfícies contaminadas merece destaque (Miller &
Diep 2008; Morgan et al. 2013; Angelakis et al. 2014).
A colonização nasal é mais comum entre crianças, dessa forma elas
representam vetores potenciais de disseminação microbiana no ambiente
familiar. Estudos têm demonstrado que pessoas interagindo no mesmo
ambiente que o portador, podem estar colonizadas com cepas
geneticamente indistinguíveis (Fritz et al. 2012; Rodriguez et al. 2014).
A taxa de colonização por S. aureus entre crianças no Brasil é
variável. Na cidade de Goiânia estudos mostraram uma taxa de colonização

7
de 31,0% entre crianças de 2 a 5 anos atendidas em creches (Lamaro-
Cardoso et al. 2009). No estado do Rio de Janeiro um estudo de corte
transversal comprovou que 48,0% das crianças, atendidas também em
creches, estavam colonizadas por S. aureus, sugerindo que crianças
atendidas em creches localizadas em aglomerados subnormais (favelas e
comunidades) são mais propensas à colonização por S. aureus do que
crianças que frequentam creches fora desses aglomerados (Braga et al.
2014).
Estudos de colonização por S. aureus entre adultos são raros no
Brasil. Prates et al. (2009) avaliando estudantes universitários observarama
elevada prevalência, de 40% de portadores de S. aureus, em estudantes de
cursos relacionados a área da saúde, essa atividade desempenhada pode
ter favorecido a prevalência encontrada. Pires et al. (2014) em um
levantamento realizado na população de uma cidade do interior do Brasil,
verificaram que aproximadamente 32,0% dos indivíduos estavam
colonizados por S. aureus, sendo que o estado de portador foi mais comum
entre pessoas mais jovens (média de idade de portadores foi de 28 anos e
de não portadores de 36 de idade) e que estes também estavam propensos
a infecções de pele.
O que a maioria dos estudos indica é que algumas populações são
mais suscetíveisà colonização do que outras, mas em geral, a taxa de
colonização por S. aureus no Brasil gira em torno de 30,0% (Lamaro-
Cardoso et al. 2009; Pires et al. 2014).
A capacidade de colonização e a patogenicidade do S. aureus são
consequências de diversos fatores que dependem da expressão de uma
ampla classe de produtos de genes acessórios, compreendendo proteínas
envolvidas na adesão celular, além de proteínas extracelulares. Esses
produtos são chamados de fatores de virulência, muitos deles atuando de
forma sinergética e coordenada. Alguns parecem especificamente
associados a infecções severas e são produzidos por diferentes cepas de S.
aureus (Jarraud et al. 2002; Tristan et al. 2007).

8
1.3 VIRULÊNCIA EM S. aureus

A base molecular da virulência em S. aureus tem sido um campo

ativo de pesquisas. Consideráveis esforços são tomados para melhorar o
entendimento em torno da patogênese dessa bactéria; o objetivo é encontrar
uma forma de melhorar o prognóstico de pacientes infectados, bem como
diminuir a incidência global das infecções estafilocócicas (Rasigade &
Vandenesch 2014).
Sobre a patogênese do S. aureus, é sabido que as várias cepas
podem se diferir quanto à capacidade de provocar infecção. Tal
variabilidade, algumas vezes, pode ser explicada em nível molecular
(Holtfreter et al. 2007; Otto 2014). Microarranjos realizados com o genoma
do S. aureus revelaram que existe uma divisão do seu material genético.
Aproximadamente 75,0% do genoma dessa bactéria é composto por um
núcleo constante e conservado, as regiões variáveis constituem 10,0%,
enquanto que pelo menos 15,0% consistem em elementos genéticos móveis
(MGEs – mobile genetic elements), que podem ser plasmídeos, fagos, ilhas
de patogenicidade e ilhas genômicas, carreando uma variedade de genes de
resistência e virulência (Lindsay & Holden 2005; Malachowa & DeLeo 2010;
Alibayov et al. 2014b).
Os elementos genéticos móveis podem ser distribuídos por dois
mecanismos distintos: 1) transferência vertical, genes são transferidos da
célula mãe para célula filha e 2) transferência horizontal, que pode ocorrer
pelos mecanismos de recombinação como transformação, conjugação ou
transdução(Thomas &Nielsen 2005; Otto 2014). A transferência horizontal
permite que os MGEs sejam disseminados entre as linhagens,
consequentemente, padrões na distribuição de MGEs entre linhagens
clonais refletem sua mobilidade (Thomas & Nielsen 2005).
O sucesso do S. aureus como patógeno é, em parte, devido à sua
capacidade de expressar uma variedade de fatores de virulência, estruturais
ou secretados, que podem ser responsáveis pela colonização, invasão de
tecidos, evasão da resposta imune e disseminação, os quais, na maioria das
vezes, estão codificados em MGEs (Jiménez et al. 2011).

9
1.3.1 Superantígenos (SAgs)

Alguns importantes fatores de virulência relacionados ao S. aureus

são os chamados superantígenos (SAgs), proteínas secretadas que induzem
forte ativação de subpopulações de linfócitos T. A maioria dos SAgs de S.
aureus são codificados em fagos e ilhas de patogenicidade, outros são
encontrados em plasmídeos ou no cassete de resistência antimicrobiana
SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosomal mec). Os SAgs
estafilocócicos incluem as enterotoxinas, a toxina 1 da síndrome do choque
tóxico e as toxinas esfoliativas. Estima-se que 80,0% de todos os S. aureus
possuam cinco ou seis genes para SAgs, dentre os quais, genes
relacionados as enterotoxinas são os mais prevalentes (Holtfreter & Bröker
2005; Holtfreter et al. 2007; Malachowa & DeLeo 2010; Alibayov et al.
2014b).
As enterotoxinas estafilocócicas (Staphylococcal Enterotoxins – SEs)
são proteínas de baixo peso molecular (26,9 – 29,6 KDa), secretadas no
meio e solúveis em água e solução fisiológica. Pertencem a uma ampla
família de toxinas pirogênicas (toxinas termoestáveis que causam aumento
da temperatura no corpo humano ou animal) que compartilham relações
filogenéticas, estruturais, funcionais e homologia de sequência. A ingestão
de enterotoxinas é importante causa de doenças provocadas por alimentos
contaminados, tendo grande impacto em saúde pública (Cretenet et al.
2011), além de serem responsáveis por um grande número de doenças com
sintomatologia diversa e que podem acometer homens e animais (Krakauer
2013).
A intoxicação alimentar estafilocócica ou SFP (Staphylococcal Food
Poisoning) é caracterizada pelo rápido início dos sintomas (30 minutos – 8
horas) após a ingestão das toxinas pré-formadas, seguido por náuseas,
vômitos, dores abdominais e diarreia (Cretenet et al. 2011; Hait et al. 2014a).
Geralmente a intoxicação não é letal e idosos são mais suscetíveis à
morbidade e mortalidade das gastroenterites provocadas por alimentos do
que indivíduos mais jovens (Balaban & Rasooly 2000).
A estabilidade ao aquecimento é uma das mais importantes
propriedades das SEs em termos de segurança alimentar, além disso, elas

10
são resistentes à inativação por proteases gastrointestinais como tripsina e
pepsina o que permite que elas transitem pelo trato digestório
permanecendo intactas (Tang et al. 2011).
Como superantígenos, as SEs são potentes ativadoras de linfócitos
T podendo interagir com muitas células T de forma não específica. Para isso
requerem a ligação direta cruzada do TCR (T-Cell Receptor – receptor de
células T) no linfócito T e MHC de classe II da célula apresentadora de
antígeno (APC - Antigen-Presenting Cell) (figura 5), causando a ativação da
APC e linfócito T, que se prolifera e produz uma série de citocinas pró-
inflamatórias (IL-2, IFN- e TNF-α) (Holtfreter & Bröker 2005; Krakauer
2013).

Figura 5. Interação do SAg, TCR e MHC classe II. Fonte:

Holtfreter & Bröker 2005

Os genes codificadores das SEs possuem diversas fontes genéticas,

as quais, a maioria estão em elementos genéticos móveis (Alibayov et al.
2014a; Hu& Nakane 2014). A tabela 1 representa as mais de 20
enterotoxinas estafilocócicas que já foram identificadas e purificadas até o
presente momento, mostrando o peso molecular, gene responsável pela
codificação e MGEs que carreiam tais genes. As SEs têm sido divididas em

11
dois grupos: as enterotoxinas clássicas, que possuem atividade emética, e
as novas enterotoxinas ou toxinas semelhantes às enterotoxinas (SEl –
Staphylococcal Entetotoxins Like Enterotoxins), que não possuem atividade
emética em humanos ou em modelo primata comprovada (Pinchuk et al.
2010; Alibayov et al. 2014b; Principato & Qian 2014).

Tabela 1. Classificação dasenterotoxinas estafilocócicas codificadas em MGEs

Enterotoxinas Peso Gene Elementos Genéticos Acessórios
Molecular
(kDa)
Enterotoxinas SEA 27,1 Sea Prophage-phiNM3, phiSa3mu,
Clássicas phiSa3mw, phiSa3ms, phiMu50A,
phiMu3, phi252B
SEB 28,336 Seb Plasmid-pZA10, SaPI-SaPI3,
SaPIivm10, SaPIishikawa11,
SaPIivm60, SaPIno10,
SaPIhirosaki4, SaPINN54, SaPIPM1
SEC1 27,5 Sec SaPI-SaPIbov1, SaPImw2,
SaPIn1/m1, SaPI68111, SaPIj50
SED 26,360 Sed Plasmid-pIB485-like
SEE 26,425 See Defective prophage
SEG 27,042 Seg egc, chromosome—egc1, egc2,
egc3, egc4
SEH 25,210 Seh Transposon-MGEmwβ/seh/Δseo,
mssa476 seh/Δseo
SEI 24,298 Sei egc, chromosome—egc1, egc2, egc3
SER 27,049 Ser Plasmid-pIB485-like, pF5, plUH02
SES 26,217 Ses Plasmid-pF5, p047A
SET 22,614 Set Plasmid-pF5, p047A
SElJ 28,565 Selj Plasmid-pIB485-like, pF5, plUH02,
pWBG744
SElK 25,539 Selk Prophage-phiSa3mw, phiSa3ms,
SaPI-SaPI1, SaPI3, SaPI5, SaPIj11
Novas SElL 24,593 Sell SaPI-SaPIm1/n1, SaPImw2,
SaPIbov1, SaPI68111, SaPIj50
enterotoxinas
SElM 24,842 Selm egc, chromosome—egc1, egc2, egc3
(ou toxinas
SelN 26,067 Seln egc, chromosome—egc1, egc2,
semelhantes as egc3, egc4
enterotoxinas) SelO 26,777 Selo Transposon-MGEmwβ/seh/Δseo,
mssa476 seh/Δseo; egc,
chromosome—egc1, egc2,
egc3, egc4
SelP 27 Selp Prophage-phiN315, phiMu3A
SelQ 25,207 Selq SaPI-SaPI1, SaPI3, SaPI5, SaPIj11;
prophage-phiSa3mw, phiSa3ms
SelU 27,1 Selu egc, chromosome—egc2, egc3
SelW 27,1 Sew egc, chromosome—egc4
SelV 27,1 Selv egc, chromosome—egc4
SelX 19,343 Slex egc, chromosome
Fonte: Adaptado de Alibayov et al. (2014b).

Pessoas saudáveis podem estar colonizadas com cepas produtoras

de SEs (cepas enterotoxigências) (Chen et al. 2012). A contaminação de
alimentos por tais cepas pode ocorrer de diversas formas: diretamente, por

12
animais infectados (no caso de alimentos de origem animal) ou por
higienização precária durante o processo de produção e armazenamento
dos alimentos (da Silva et al. 2015).A origemde cepas enterotoxigênicas de
S. aureusem alguns relatos de surtos é atribuída às mãos contaminadas de
manipuladores de alimentos e mastite bovina, já que em alguns casos os
alimentos eram de fontes animais (queijo frescal e leite cru) (Michelin et al.
2006; Lima et al. 2013).

A toxina 1 da síndrome do choque tóxico (toxic shock syndrome

toxin 1 – TSST-1) é secretada exclusivamente por cepas de S. aureus
(Lindsay et al. 1998). É o principal fator de virulência em doenças como a
síndrome do choque tóxico (Toxic Shock Syndrome – TSS), escarlatina
estafilocócica e doença exantematosa semelhante ao choque tóxico
neonatal (NTED – Neonatal Toxic Shock Like Exanthematous Diseases)
(Kikuchi et al. 2003; van der Mee-Marquet et al. 2003).
Vinte por cento das cepas de S. aureus são produtoras naturais de
TSST-1, o gene tst, que codifica a proteína, é um gene cromossomal
inserido em um elemento genético acessório que contém as sequências de
tst flanqueadas e conservadas; essas sequências são ausentes em cepas
negativas para TSST-1 (Lindsay et al. 1998).
A principal doença causada por cepas produtoras de TSST é a
síndrome do choque tóxico, uma doença aguda, multissistêmica, que
tipicamente resulta em choque e falha múltipla de órgãos. Apresenta-se
abruptamente com sintomas como desconforto abdominal e mialgia severa,
seguida comumente por confusão, letargia, agitação, sintomas de
hipovolemia (queda da pressão arterial, aumento da frequência cardíaca e
respiratória, membros frios, pele gelada e pálida e fraqueza) e descamação,
que é uma característica tardia da TSS estafilocócica, ocorrendo de 10 a 21
dias do início da doença. Nem todos os pacientes infectados com uma cepa
produtora dessa toxina desenvolvem TSS. A interação entre o sistema
imunológico do hospedeiro e o patógeno pode desempenhar papel
importante na resposta contra bactérias e toxinas (Brosnahan & Schlievert
2011; Low 2013).

13
 Assim como as SEs, a TSST-1 apresenta resistência ao aquecimento
e à ação de enzimas digestivas, retendo sua capacidade antigênica mesmo
após sofrerem ação da tripsina e pepsina. Entretanto, diferentemente das
SEs, a TSST-1 não possui atividade emética (Li et al. 2011).
No Brasil, a presença do gene tst vem sendo detectada em cepas
relacionadas a surtos de intoxicação alimentar (em associação à pesquisa
de SEs), mastite em bovinos e ovinos e em cepas associadas a infecções
(bacteremias, infecções de pele e tecidos moles, etc). Sabe-se que este
gene é existente em isolados resistentes e suscetíveis a antimicrobianos,
entretanto a frequência com que ele é detectado entre as cepas de S.
aureus é bastante variável no país (Souza et al. 2009; Almeida et al. 2013;
Bonesso et al. 2014).
A presença do gene tst muitas vezes é associada à presença de
enterotoxinas devido a relação com as ilhas de patogenicidade, por exemplo
o gene tst pode ser carreado pelas ilhas de patogenicidade SaPI-SaPI1,
SaPIm1/n1, SaPIbov1 e SaPI68111, que ao mesmo tempo podem
transportar os genes sell, sec, selk e selq (Alibayov et al. 2014b).
As toxinas esfoliativas (ETs – Exfoliative Toxins) são outros
importantes fatores de virulência do S. aureus e são os únicos agentes
responsáveis pela síndrome da pele escaldada estafilocócica (SSSS –
Staphylococcal Scalded Skin Syndrome), também conhecida como doença
de Ritter. A SSSS afeta predominantemente bebês lactentes e é
caracterizada pela perda das camadas superficiais da pele, desidratação e
infecções secundárias. A forma localizada da SSSS é conhecida como
impetigo bolhoso; as duas formas compartilham a mesma etiologia e se
diferem apenas pela extensão do dano a pele (Bukowski et al. 2010).
A SSSS se manifesta primeiramente por febre, mal-estar, letargia e
má alimentação. Em seguida, ocorre formação de exantema eritematoso e
de bolhas grandes, frágeis e preenchidas por fluido. As bolhas podem se
romper facilmente por ação mecânica, deixando as partes afetadas do corpo
sem camada protetora da epiderme (Ladhani et al. 1999).
Existem pelo menos dois sorotipos de ETs, ETA (26,9 kDa) e ETB
(27,3), com as duas proteínas compartilhando em torno de 40,0% de
identidade na sequência de aminoácidos (Bailey et al. 1980). Os dois

14
sorotipos provocam perda da adesão celular apenas na camada superficial
da epiderme (Amagai et al. 2000). São proteases de serina altamente
específicas ao substrato, seu alvo é a desmogleína1, uma caderina
desmossomal responsável pela integridade das estruturas adesivas que
mantém a união célula-célula na pele (Amagai et al. 2000; Amagai et al.
2002; Malachowa& DeLeo 2010). A esfoliação ocorre apenas na camada do
estrato granuloso, devido a essa alta especificidade (Arnemann et al. 1993).
Os genes que codificam ETA (eta) e ETB (etb) estão localizadosem
fagos (φETA, φETA2 e φETA3), na ilha genômica νSAγ e em um plasmídeo
de 38,2 kb chamado pETB.Os genes possuem similaridade de identidade de
52,0% e tem sido demonstrado que a expressão desses genes é regulada
pelo gene agr(Acessory Gene Regulator, considerado o regulador global da
transcrição genética de diversos fatores de virulência) (Malachowa & DeLeo
2010; Singh & Ray 2014).
A prevalência dos sorotipos varia demograficamente; na Europa,
Estados Unidos e África o sorotipo A é prevalente; apenas no Japão o
sorotipo B demonstrou ser mais prevalente do que o A. No Brasil pouco é
conhecido sobre a prevalência dessas toxinas (Ladhani et al. 2001).

1.3.2 Leucocidina de Panton-Valentine

A Leucocidina de Panton Valentine (Panton-Valentine Leucocidin –

PVL) é uma toxina formadora de poros que causa destruição de leucócitos e
morte de tecidos, a produção dessa proteína extracelular muitas vezes pode
ditar a patogenicidade da cepa de S. aureus, sendo por isso, um fator de
virulência crucial. Os alvos da PVL são os leucócitos fagócitos,
especialmente leucócitos polimorfonucleares (PMNs), os quais são a
primeira linha de defesa contra infecções por S. aureus. A atividade citolítica
dessa toxina é dependente da interação com receptores, por isso algumas
espécies são mais suscetíveis à ação da PVL do que outras (Diep et al.
2010; Löffler et al 2010; Spaan et al. 2013).
Pesquisadores relatam que o efeito tóxico da PVL é resultado da
ação sinérgica de duas proteínas, a lukF-PV e lukS-PV, essas proteínas são
codificadas por dois genes contíguos e co-transcritos (lukF-PV e lukS-PV),

15
os quais podem ser transmitidos entre cepas por meio de fagos lisogênicos.
O bacteriófago ՓSLT pode converter cepas PVL- em PVL+ (Prévost et al.
1995; Narita et al. 2001; Vandenesch et al. 2012).
A presença da PVL em S. aureus está associada com infecções
primárias de pele e pneumonia necrotizante em jovens, predominantemente
em pacientes imunocompetentes (Lina et al. 1999; Boyle-Vavra & Daum
2007; Hanratty et al. 2015). Essa toxina é expressa em uma pequena
porcentagem de isolados Wild-type (cepas em condições naturais, sem
mutações ou aquisição de genes exógenos), 2,0-3,0%, mas é altamente
prevalente em S. aureus isolados de infecções necrotizantes (Lina et al.
1999; Kuehnert et al. 2006).
Recentemente a PVL foi associada a cepas CA-MRSA (Community-
associated Methicillin-resistant S. aureus), que são relacionadas a ambientes
comunitários. É provável que essas linhagens codifiquem esse fator de
virulência por carrear o loci para PVL mais frequentemente, isso pode
explicar como em geral, as cepas CA-MRSA são mais virulentas que as HA-
MRSA (Hospital-associated Methicillin-resistant S. aureus), associadas a
infecções nosocomiais (Etienne 2005; Berglund et al. 2008).
No Brasil, desde 2005, relatos de casos de pacientes infectados por
cepas CA-MRSA produtoras de PVL têm sido publicados. As infecções são
relatadas como sendo severas e com diversas manifestações, como
infecções de pele e tecidos moles, endocardite, abscessos e bacteremia
(Ribeiro et al. 2005b; Fortes et al. 2008; Rozenbaum et al. 2009).
Essa relação entre PVL e MRSA tem sido mais extensivamente
demonstrada em países como EUA e Japão, onde esse patógeno parece ser
endêmico (Maeda et al. 2012; Kono et al. 2013; Yamaguchi et al. 2015). No
Brasil alguns estudos têm falhado ao demonstrar tal correlação e a PVL tem
sido encontrada de forma inconsistente entre cepas MRSA e MSSA
(Methicillin-susceptible S. aureus), associadas a infecções nosocomiais ou
de origem comunitária (Lamaro-Cardoso et al. 2009; Schuenck et al. 2009;
Brust et al 2013; Bonesso et al. 2014).
Na maioria dos estudos, a prevalência de PVL entre cepas de S.
aureus são relacionadas ao MRSA, poucos dados são apresentados sobre
essa importante toxina entre isolados suscetíveis. Os dados existentes

16
mostram que os MSSA têm carreado o gene para PVL em uma frequência
variada, de 0 a 15,0%. Além disso, o que se observa, é que esses genes
estão mais presentes entre isolados causando infecções que entre cepas
colonizadoras (Mimica et al. 2011; Damasco et al. 2012; Silva et al. 2013;
Bonesso et al. 2014; Pires et al. 2014; Witzel et al. 2014).

1.3.3 Hemolisinas

S. aureus produzem duas principais hemolisinas que são distintas no

aspecto molecular e que possuem importantes papéis na patogênese da
bactéria. As hemolisinas são referidas normalmente como toxinas (α- e -
toxinas). A α-hemolisina (HLA) é uma proteína formadora de poros
comumente referida como α-toxina devido à sua ampla especificidade
celular, promovendo não somente lise de eritrócitos, mas também de uma
série de leucócitos e apresentam respostas distintas de intoxicação (Berube
& Wardenburg 2013).
A HLA é secretada como um monômero solúvel capaz de se ligar a
membrana da célula do hospedeiro se transformando em um heptâmero.
Essa estrutura cria um poro na membrana permitindo o efluxo de K+e outras
pequenas moléculas e o influxo de Na+, Ca2+e moléculas com pequeno peso
molecular. A citólise não é a única consequência da ação da HLA. Existe um
grande número de respostas celulares à intoxicação sublítica, como
alteração na sinalização celular, resposta inflamatória, secreção de citocinas
e interação entre células (Berube & Wardenburg 2013; Otto 2014).
A -hemolisina (HLB) de S. aureus é uma esfingomielinase
secretada dependente de Mg2+ que degrada a esfingomielina presente na
membrana celular de eritrócitos, leucócitos, neurônios e outras células
teciduais, causando ruptura (Vandenesch et al. 2012). O gene para HLB, hlb,
está presente em uma numerosaquantidade de cepas de S. aureus isoladas
particularmente de animais. Em humanos, demonstrou-se que esse gene
está presente em 13,0 e 11,0% das cepas isoladas de sepse e de
portadores nasais, respectivamente (Aarestrup et al. 1999). O gene hlb

17
estálocalizado no cromossomo e codifica um polipeptídio de 330
aminoácidos, com peso molecular de 39 kDa, que subsequentemente é
clivado para formar a proteína secretada de 35 kDa (Dinges et al. 2000).
HLB não lisa a maioria dos tipos celulares do hospedeiro, contudo,
deixa as células suscetíveis para uma diversidade de agentes líticos como a
PVL e HLA (Vandenesch et al. 2012). De fato, os danos celulares
provocados pela produção da HLB variam de acordo com a espécie do
hospedeiro. Sugere-se que a virulência primária da HLB está relacionada às
atividades de modulação dos processos do hospedeiro que afetam a
patogênese da bactéria, em vez de lisar diretamente as células (Hayashida
et al. 2009). Os efeitos da HLB estão comumente relacionados com
infecções crônicas de pele em humanos e mastite bovina (Walev et al.
1996).

O gene para HLA pode estar presente na grande maioria dos isolados
de S. aureus (Aarestrup et al. 1999). No entanto, o gene codificador da HLB
encontra-se em um local preferencial da inserção de bacteriófagos, essas
inserções rompem o gene da HLB. Bacteriófagos que têm como alvo o gene
hlb, ao se inserirem no gene, introduzem também componentes do cluster
de evasão imune (genes de estafiloquinases, sea,selp, genes de proteínas
inibidoras do complemento e quimiotaxia). A maioria dos isolados clínicos
humanos carreiam de 2 a 4 componentes desse cluster sendo, portanto, hlb
negativos (Vandeneschet al. 2012). Tem-se demonstrado que a expressão
dessas toxinas é controlada pelo agr e depende de uma série de fatores
ambientais, como temperatura, osmolaridade e concentração de CO 2
(Dinges et al. 2000).

1.4 RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS

A grande capacidade de adquirir genes de resistência, seja por

transferência horizontal ou por mutação, é um dos principais fatores que
torna o S. aureus um patógeno relevante e consequentemente alvo de
muitos estudos (Deurenberg et al. 2007; Chambers & DeLeo 2009).

18
 O surgimento de S. aureus resistentes se deu após o início da
chamada “era antibiótica”, que começou em meados de 1940, com o
estabelecimento do uso da penicilina na prática clínica. Contudo, poucos
anos após seu uso, já haviam registros de cepas resistentes em hospitais e
em menos de uma década, se tornava um problema notável dentro da
comunidade. Desde então, o número de antibióticos efetivos no combate a
infecções por essa bactéria tem diminuído em consequência da emergência
de cepas resistentes (de Lencastre et al. 2007; Deurenberg et al. 2007).
A resistência à penicilina em S. aureus ocorreu primeiramente pela
produção de -lactamases, enzimas com capacidade de hidrolisar o anel -
lactâmico, transformando o antibiótico em um elemento inativo. As -
lactamases são codificadas por genes acondicionados em plasmídeos que
podem ser transferidos para bactérias sensíveis, disseminando a resistência
dentro da comunidade bacteriana (Nikolaidis et al. 2014). Dessa forma, a
efetividade da penicilina foi virtualmente anulada uma década após a
introdução do seu uso para o tratamento de infecções (de Lencastre et al.
2007).
Após o desenvolvimento da primeira penicilina semissintética
resistente às -lactamases (meticilina) e sua introdução na prática clínica em
1960, foi observado o mesmo fenômeno. Em 1961 surgiram relatos de cepas
de S. aureus resistentes à meticilina, os chamados MRSA (do inglês
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) (Ayliffe 1997).
Surtos de infecções causados por MRSA foram relatados nos EUA
no final dos anos 70, na década seguinte essas cepas já se tornaram
endêmicas (Peacock et al. 1980). No Brasil, um clone epidêmico tem sido
extensivamente disseminado nos hospitais brasileiros, o chamado clone
endêmico brasileiro (BEC – Brazilian Endemic Clone),estando entre os cinco
principais clones globais de MRSA, além de ser tipicamente multirresistente
(Rossi 2011).
Com o advento dos clones MRSA e descobertas de novos alótipos
de SCCmec houve a introdução do uso da vancomicina para o tratamento de
infecções causadas por tais cepas, o que levou a emergência de cepas com
resistência intermediária a este antimicrobiano e em seguida, altamente
resistentes (Chambers & Deleo 2009).

19
 O surgimento de isolados resistentes diminui as opções terapêuticas
em casos de infecção. Para bactérias multirresistentes existem poucos
antibióticos disponíveis no mercado e a expectativa em relação à descoberta
de novas opções terapêuticas não são animadoras (Lindsay & Holden 2005).

1.4.1 Mecanismo de Resistência à Meticilina

O mecanismo de resistência à meticilina por si próprio é incomum,

envolvendo a aquisição do gene mecA, o único determinante de uma
proteína ligadora de penicilina adicional, anômala de 78 KDa denominada
PBP 2a (Penicillin Binding Protein) (ou PBPβ’). As PBPs são peptideoglicano
sintases essenciais para a síntese da parede celular da grande maioria das
bactérias. Antibióticos -lactâmicos normalmente se ligam às PBPs,
resultando no rompimento da síntese da camada de peptideoglicano e
consequentemente na morte da célula bacteriana (Frère& Page 2014).
A PBP 2a possui baixa afinidade pela maioria das penicilinas
semissintéticas, como a meticilina, naficilina e oxacilina, e pode atuar como
substituto das PBPs estafilocócicas nativas (Souza et al. 2005; de Lencastre
et al. 2007). Desde que estes antibióticos não sejam capazes de se ligar a
PBP 2a, a célula continua a sintetizar peptideoglicano e a síntese da parede
celular não se altera,garantindo a sobrevivência do micro-organismo em
situações que normalmente seriam letais (Deurenberg et al. 2007).
O gene mecA foi primeiramente clonado e sequenciado juntamente
com os genes que controlam sua expressão e repressão,
mecR1(codificando a proteína transdutora de sinal MecR1) e mecI
(codificando a proteína repressora de sinal MecI), respectivamente. Quando
se notou que o mecA poderia ser amplamente disseminado entre
estafilococos, surgiu a hipótese de que ele poderia ser carreado por um
elemento genético móvel (IWG-SCC 2009).
Assim, surgiram estudos sugerindo que Staphylococcus aureus
suscetíveis à meticilina, chamados MSSA (Methicillin-susceptible
Staphylococcus aureus), se tornaram cepas MRSA pela aquisição de um
elemento genético móvel denominado SCCmec (Staphylococcal Cassette
Chromosome mec) (Ito et al. 1999; Katayama et al. 2001). O SCCmec é o

20
único vetor conhecido para o gene mecA, entretanto é capaz de carrear uma
variedade de determinantes de resistência e virulência para o S. aureus
(Deurenberg et al. 2007; de Lencastre et al. 2007; Rodríguez-Noriega& Seas
2010).
O SCCmec é integrado ao cromossomo na terminação γ’ de uma
ORF X (Open Reading Frame) em um sítio específico que é localizado
próximo à origem de replicação do cromossomo do Staphylococcus spp.
(Katayamaet al. 2000). O complexo SCCmec recebe uma classificação
definida de acordo com a combinação da classe do complexo do gene mec e
do tipo de complexo do gene ccr, essas são as chaves do elemento
SCCmec, responsáveis pelo fenótipo de resistência aos -lactâmicos e pela
integração e excisão do SCCmec, respectivamete (IWG-SCC 2009).
O complexo ccr (cassette chromosome recombinases) é composto
pelo gene ccr(codifica recombinases que catalisam a inserção/excisão do
cassete ao cromossomo) e ORFs(Katayama et al. 2000; Boundy et al. 2013).
Atualmente são descritos três tipos de ccr filogeneticamente distintos, ccrA,
ccrB, e ccrC, com similaridade na sequência de DNA em torno de 50%. Os
complexosccr identificados em S. aureus incluem os tipos 1, 2, 3, 4 e 5
(IWG-SCC 2009).
A organização genética dos elementos próximos ao mecA
(mecRI,mecIe sequências de inserção) define o complexo do gene mec. Em
S. aureus,três principais classes do complexo do gene mec têm sido
descritas: classe A, B, e classe C com dois complexos mec distintos, o C1e
C2 (Katayama et al. 2001).
Baseados nesses dados já foram descritos 11 tipos de SCCmec,
entre os quais 8 tipos são os mais prevalentes e citados como mostra o
quadro 1.
Outro componente do complexo SCCmec é chamado de região J
(Joining region). Existem três regiões J componentes do elemento SCCmec,
estas não são componentes essenciais, entretanto podem carrear
determinantes de resistência adicionais (Milheiriço et al. 2007; IWG-SCC
2009).

21
 Quadro 1. Principais tipos de SCCmec identificados em Staphylococcus aureus
Tipo do SCCmec Complexo do gene ccr Complexo do gene mec
I 1(ccrA1B1) B
II 2(ccrA2B2) A
III 3(ccrA3B3) A
IV 2(ccrA2B2) B
V 5(ccrC1) C2
VI 4 (ccrA4B4) B
VII 5(ccrC1) C1
VIII 4 (ccrA4B4) A
Fonte: International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements (IWG-SCC 2009).

1.4.2 HA-MRSA e CA-MRSA

Cepas MRSA foram originalmente isoladas de hospitais e ambientes

relacionados aos cuidados com a saúde, além de pacientes que
frequentavam essas instituições. A aquisição dessas cepas estava
relacionada a fatores de risco como hospitalização ou realização de cirurgia,
residência em instalações de cuidados em longo prazo, submissão à
hemodiálise, uso de dispositivos médicos percutâneos, cateteres e uso
prolongado de antimicrobianos (Chambers 2001). MRSA associados à
ambientes nosocomiais (HA-MRSA – Hospital-associated Methicillin-
resistant S. aureus) foram causa de muitos surtos de infecções em hospitais
dos Estados Unidos em 1970 e 1980 e se tornou um patógeno endêmico
sendo um problema mundial de saúde pública (David & Daum 2010; Tenover
et al 2011).
Contudo, desde 1990 houve um grande aumento de relatos de
casos de infecções por MRSA em indivíduos saudáveis e em populações
sem exposição prévia aos fatores de riscos relacionados ao sistema de
saúde. Essas infecções eram causadas por novas cepas geneticamente
distintas das tradicionais cepas de HA-MRSA (Mediavilla et al. 2012). Os
chamados CA-MRSA (Community-associated Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus) têm sido responsáveis pelo aumento de importante
proporção de casos observados nas últimas décadas, sendo rapidamente
disseminados entre a população geral, podendo acometer pacientes com ou

22
sem exposição prévia a ambientes hospitalares (David & Daum 2010; Otter
& French 2011).
Dessa forma, as distinções de MRSA baseadas em epidemiologia
clínica e suscetibilidade estão se tornando menos relevantes. Os termos CA-
MRSA e HA-MRSA são usados para direcionar a atenção para as diferenças
genotípicas de determinados isolados de MRSA, bem como as
características epidemiológicas e clínicas das infecções causadas por eles
(David & Daum 2010, Mediavilla 2012).
Nos Estados Unidos, CA-MRSA é importante causa de infecções de
pele e de tecidos moles (Skin and Soft Tissue Infections – SSTI), e tem
grande impacto em doenças provocadas por MRSA em geral. A rapidez com
que essas cepas se disseminam é notória. Além dos Estados Unidos, esse
patógeno tem sido relatado em diversas localidades como Canadá, Ásia,
América do Sul e Europa, incluindo países que historicamente possuem
baixa prevalência de MRSA como Noruega, Dinamarca, Finlândia e Países
Baixos. Em geral, os isolados são diversificados e um número crescente de
clones tem sido identificados (Chambers & DeLeo 2009).
Cepas HA-MRSA e CA-MRSA possuem distinções genotípicas. HA-
MRSA raramente possuem o gene para PVL e carreiam SCCmec
relativamente grandes e pertencentes aos tipos I, II ou III, são geralmente
multirresistentes, pois transportam determinantes de resistência adicionais.
No SCCmecII, por exemplo, o transposon Tn554 codifica resistência aos
macrolídeos, lincosaminas, estreptograminas do tipo B e espectinomicina e o
O pUB110, um plasmídeo integrado, possui o gene de resistência a
tobramicina (figura 6). Em contraposição, isolados CA-MRSA possuem
SCCmec menores, sendo mais comumente do tipo IV e V, os elementos do
SCCmec carreiam o mecA que presumivelmente possui maior mobilidade,
sendo resistentes a poucas classes de antibióticos não -lactâmicos e
frequentemente possuindo o gene para PVL (David & Daum 2010).

23
 Figura 6. Comparação dos SCCmec típicos para HA-MRSA (SCCmec II) e CA-MRSA
(SCCmec IV). Fonte: Chambers & DeLeo (2009)

Além disso, infecções por CA-MRSA tendem a ocorrer em pacientes

previamente saudáveis e mais jovens. Essas cepas têm sido associadas
predominantemente a infecções de tecidos moles, mas também estão
ligadas a síndromes clínicas severas como pneumonia necrotizante e sepse.
Em contradição, HA-MRSA são isolados em grande número de pacientes
mais velhos, com uma ou mais condições de comorbidade e normalmente
são causas de pneumonia, bacteremia e infecções invasivas. Em geral, os
resultados clínicos de infecções causadas por CA-MRSA são piores do que
aquelas provocadas por HA-MRSA, indicando que estas cepas são mais
virulentas (Chambers e DeLeo 2009).
Cepas CA-MRSA têm evoluído em diferentes áreas geográficas e
diferentes clones são isolados em todas as partes do mundo. Nos Estados
Unidos o clone de MRSA mais comumente isolado é o USA300, um CA-
MRSA identificado como a cepa MRSA mais prevalente em pelo menos 48
estados de 1999 a 2001 (King et al. 2006; Liu et al. 2008). Em 2005 foi
responsável por 29% das doenças invasivas provocadas por MRSA no país
(Johnson et al. 2007). Em São Francisco (EUA) um estudo realizado entre
2004 e 2005 indicou que esse clone foi responsável por 78,5% das infecções
por MRSA tidas como comunitárias (Liu et al. 2008; David & Daum 2010).
No Canadá, o USA300 foi primeiramente relatado por um grande
programa de vigilância que o identificou como causa de um surto de SSTI
em Alberta no ano de 2004. De 2003 a 2005 foi relatado como causas de
SSTIs em Toronto e Vancouver, desde então diversos relatos indicando

24
diferentes taxas de prevalência do USA300 vêm sendo divulgados nos
Estados Unidos e Canadá (David & Daum 2010).
USA300 se disseminou por todo mundo e já foi identificado em
países da Europa, no Japão e Austrália (Mediavilla et al. 2012). Na América
do Sul uma variante do USA300 tem se estabelecido e foi relatada como
linhagem genética predominante e exclusiva na Colômbia, MRSA-ST8-IV
(Reyes et al. 2009).
Vários relatos de casos de infecções por CA-MRSA foram descritos
no Brasil. No ano de 2004 foram relatados os primeiros casos dessas
infecções. As cepas isoladas possuíam SCCmec tipo IV e genes para PVL,
enterotoxinas e -hemolisina, as quais foram responsáveis por infecções
associadas à pele e tecidos moles em pacientes sem exposição prévia aos
fatores de risco associados ao HA-MRSA. As cepas foram geneticamente
relacionadas ao Oceania Southwest Pacific Clone (OSPC), possuindo gene
lukS-PV e seo, localizado no locus egc (Ribeiro et al. 2005a). Gelatti et al.
(2009) também descreveram um relato de caso de infecção grave causada
por uma cepa CA-MRSA no sul do Brasil, o paciente apresentou infecção em
tecidos moles, sepse e pneumonia secundária. A cepa infectante possuía
SCCmec IVc, genes para PVL e também foi relacionada ao OSPC.O caso
causou preocupação visto que um surto ocorrido em um país vizinho,
Uruguai, foi atribuído ao mesmo clone (Ma et al. 2005; Gelatti et al. 2009).
MRSA tem sido extensivamente isolado de pacientes com infecção
no trato respiratório, uma vez que HA-MRSA com SCCmec tipo III parece
ser prevalente entre pacientes com fibrose cística.Relatos de até 49% das
infecções estafilocócicas em pacientes com essa doença são causadas por
cepas carreando esse tipo de SCCmec. Outro tipo prevalente é o SCCmecII,
causando além da fibrose cística outras manifestações de infecções no trato
respiratório (Reiter et al. 2010).
Assim, como demonstrado em diversas localidades do mundo, no
Brasil, a colonização por MRSA é frequente em pessoas que estão em
constante contato com ambientes hospitalares, sendo baixa dentro da
comunidade. Ribeiro et al. (2005b) relataram taxa de colonização por MRSA
dentro de um hospital de 35,0%, enquanto que a taxa de colonização entre
pacientes que visitavam a sala de emergência foi de apenas 0,7%. Ainda

25
nesse estudo a colonização por CA-MRSA foi de 0,15%, evidenciando que
apesar da colonização por S. aureus ser um evento frequente, portadores de
MRSA na comunidade são raros.
Na cidade de Goiânia um estudo sobre colonização descreveu taxa
de apenas 1,2% de portadores de MRSA entre crianças atendidas em
creches. Neste trabalho relatou-se o primeiro caso de MRSA portando
SCCmec tipo V no Brasil, entretanto apesar de ser uma cepa compatível a
CA-MRSA não foi possível estabelecer a epidemiologia da aquisição desse
isolado devido ao fato de que a criança havia sido exposta a fatores de risco
para HA-MRSA (Lamaro-Cardoso et al. 2009).

1.4.3 Relação MRSA-Fômites

Enquanto enormes esforços são feitos para melhorar a vigilância das

infecções nosocomiais, muitos estudos são ainda necessários para apoiar
diretrizes de controle das infecções na interface entre hospitais e
comunidade. Essa interface é vulnerável às infecções por MRSA devido à
falta de comunicação e conhecimento, profissionais qualificados e apoio
financeiro (Eibicht & Vogel 2011).
Contribuindo para o aumento dessa vulnerabilidade e
potencializando a dispersão de bactérias entre e intra-ambiente hospitalar e
comunitário, estão as superfícies ambientais e demais fômites que
desempenham papel importante na transmissão e disseminação do S.
aureus. A detecção efetiva de bactérias patogênicas de superfícies
ambientais é importante para prevenção e controle de surtos (Miller & Diep
2008; Lutz et al. 2014).
A colonização de superfícies inanimadas tem sido bem
documentada. O S. aureus é transmitido de portadores e pessoas infectadas
para os fômitese uma vez que se estabelece, exibe grande capacidade de
sobrevivência, podendo continuar viável por dias a meses em ambientes
adversos ao seu desenvolvimento, sendo altamente resistente à dessecação
(Williams & Davis 2009; Desai et al. 2011).

26
 Eibicht e Vogel (2011) demonstraram que veículos de emergência
médica podem se tornar contaminados com MRSA após transporte de
pacientes infectados ou colonizados, mesmo que em curto período de
tempo. Isso pode ser importante evidência de como essas bactérias podem
se disseminar de ambientes hospitalares para comunidade e vice-versa,
uma vez quetais veículos trafegam entre esses ambientes. Ademais, além
do paciente, podem ser transportados nestes veículos, profissionais de
saúde, acompanhantes e demais pessoas, que se tornam veiculadores dos
micro-organismos ao serem colonizados ou infectados pelas cepas
presentes nos fômites.
Surtos de infecções por MRSA com recorrência comum, foram
relatados entre atletas e estiveram associados à exposição a vários fômites
contaminados, como banheiras de hidromassagem, lâminas de barbear e
toalhas compartilhadas, além de bancos, vestimentas e até mesmo uma
barra de sabão (CDC 2003; Begier et al; 2004; Kazakova et al. 2005;
Nguyen et al. 2005). Em hospitais, MRSA têm sido isolados de teclados de
computadores e torneiras dentro de unidades de terapia intensiva, pagers,
estetoscópios, camas, torniquetes e outras superfícies (Bures et al. 2000;
Singh et al. 2002; Hardy et al. 2006;Whittington et al. 2009, Mehmood et al.
2014).
Tem se demonstrado que MRSA podem colonizar superfícies
ambientais nas casas de pessoas saudáveis, e que os fômites no ambiente
domiciliar podem ter papel importante na recorrência de infecções de pele
em pessoas pré-dispostas ou não. Essa contaminação ambiental reforça a
ideia da transmissibilidade, pois, superfícies, moradores, animais de
estimação e visitantes podem se tornar colonizados ou infectados, gerando
uma cadeia de transmissão que pode ser facilmente quebrada com
informação e uso de boas práticas de higienização (Miller et al. 2015)
Dentre as superfícies ambientais comunitárias, aquelas relacionadas
ao sistema de transporte público são de particular interesse. No Brasil, na
maioria das cidades, os sistemas de transporte recebem elevado número de
pessoas diariamente, o que favorece a aglomeração, e fazc om que o
contato entre mãos e superfícies se torne intenso, propiciando a transmissão
de micro-organismos (Rodrigues et al. 2006).

27
 MRSA tem sido isolado em ônibus e outras superfícies relacionadas
ao transporte público em diversos países, como EUA, Japão e Portugal. A
prevalência de contaminação dessas superfícies é variada e está
relacionada a diversos fatores, como frequência de limpeza, rota que os
ônibus percorrem (abastecendo instituições relacionadas à assistência a
saúde), quantidade de passageiros transportados e interessantemente essa
prevalência parece estar relacionada com a colonização da população local
(Otter & French 2009; Simões et al. 2011; Iwao et al. 2012; Conceição et al.
2013; Lutz et al. 2014).
Stepanović et al. (β008) em um estudo sobre contaminação de
ônibus em uma cidade da Sérvia, não encontraram nenhum MRSA,
entretanto, encontraram estafilocococos coagulase negativa resistentes à
meticilina, mostrando que bactérias presentes nesses ambientes podem
também ser importantes fontes de genes de resistência antimicrobiana.
No Brasil, MRSA presentes nessas superfícies recebem pouco
destaque, todavia, alguns estudos têm detectado diferentes tipos de micro-
organismos nas superfícies do sistema de transporte, sustentando a ideia de
tais superfícies como fômites (Rodrigueset al. 2006; Fernandes et al. 2012).

1.4.4. Fenótipo MLS (Macrolídeos, Liconsaminas e Estreptrograminas)

Além da resistência aos -lactâmicos, grande atenção deve ser dada

aos macrolídeos (como a eritromicina, azitromicina e espiramicina),
lincosamidas (clindamicina e lincomicina) e estreptograminas do tipo B
(como a quinupristina). Esses antimicrobianos são coletivamente chamados
de MLSB e apesar de serem quimicamente distintos apresentam
mecanismos de ação similares, ou seja, inibição da síntese proteica
bacteriana pela ligação ao rRNA 23S, que faz parte da subunidade 50S do
ribossomo bacteriano (Adaleti et al. 2010; Saderi et al. 2011).
Esses agentes são utilizados como alternativa em caso de infecção
por cepas resistentes aos antibióticos de primeira escolha, como é o caso de
infecções provocadas por MRSA e em pacientes com hipersensibilidade a
penicilina (Adaleti et al. 2010; Seifi et al. 2012; Hatkar et al. 2014).

28
 A clindamicina é o agente mais comumente escolhido devido às
suas excelentes propriedades farmacocinéticas. Sua eficácia foi confirmada
em tratamentos de diversas infecções, como infecções de pele, tecidos
moles, no sistema respiratório, ossos e articulações. Porém, uma importante
questão relacionada ao tratamento com a clindamicina é o risco de falência
terapêutica, causada principalmente pela resistência induzível (Seifi et al.
2012; Hatkar et al. 2014).
Os antibióticos MLSB possuem três mecanismos de resistência: 1)
modificação do sítio alvo, 2) inativação enzimática do antibiótico e 3) bomba
de efluxo. Dentre esses, o mecanismo mais comum é a modificação do sítio
alvo mediada pelos genes erm (ermA, ermB e ermC – erythromycin
ribosome methylase) que podem ser expressos constitutivamente
(constitutive MLSB phenotype – cMLSB) ou por meio de indução (inducible
MLSB phenotype – iMLSB). Os genes erm codificam enzimas que conferem
resistência aos antimicrobianos MLSB pela metilação do resíduo A2058,
localizado no domínio V conservado do RNA ribossomal 23S o que reduz a
ligação do agente antimicrobiano ao ribossomo. Esse fenômeno conduz à
resistência cruzada desses antibióticos e produz o fenótipo MLSB (Coutinho
et al. 2010).
A resistência induzível é observada quando o mRNA inativo é
transcrito e, na presença de um indutor, torna-se ativo produzindo metilases,
assim os isolados são resistentes somente aos macrolídeos de 14
(eritromicina e claritromicina) e 15 (azitromicina) átomos de carbono que
constituem o anel lactonado. Por outro lado, nas amostras com resistência
constitutiva, o mRNA relativo à metilase é ativo, sendo desnecessária a
presença de um indutor, nesse caso, os isolados são resistentes a todos os
macrolídeos, lincosaminas e estreptograminas tipo B. Esta resistência
dissociada é decorrente das diferenças observadas nas habilidades
indutoras dos antibióticos MLS, ou seja, somente os macrolídeos de 14 e 15
átomos de carbono são indutores efetivos na síntese das metilases (Amorim
et al. 2009).
As cepas com fenótipo cMLSB podem ser detectadas pelo teste de
disco-difusão de rotina, enquanto as cepas com fenótipo iMLS B são
detectadas por um teste específico. Cepas iMLSB mostram resistência à

29
eritromicina e sensibilidade à clindamicina, semelhantes às cepas contendo
o fenótipo MS, que permite resistência somente aos macrolídeos e
estreptograminas B, mas não à clindamicina. Baixos níveis de eritromicina
são os mais efetivos indutores da resistência em cepas iMLSB. Com base
nesse fato, um método especial de disco-difusão chamado teste D (ou D-
test) foi desenvolvido para detecção deste fenótipo. Trata-se de um simples
teste de disco-aproximação, no qual um disco de eritromicina é colocado
próximo ao disco de clindamicina ou lincomicina na placa de antibiograma.
Em cepas iMLSB a resistência à clindamicina é induzida pela eritromicina
que se difunde através do ágar, o que leva a deformação ou achatamento do
halo de inibição do crescimento em volta do disco de clindamicina, o halo
fica com o formato da letra D (Fiebelkorn et al. 2003). Dessa forma, todos os
isolados que apresentarem o fenótipo iMLSB devem ser reportados como
resistentes a essas três classes de antimicrobianos (CLSI 2015).

30
2 JUSTIFICATIVA

O transporte público coletivo na cidade de Goiânia possui uma

infraestrutura deficienteque é utilizada por milhares de pessoas diariamente.
O uso do transporte por indivíduos colonizados,a impossibilidade de realizar
a higienização das mãos durante e imediatamente após o deslocamento e o
contanto potencializado entre as mãos dos passageiros e fômites são fatores
que tornam o ambiente propício para a dispersão de bactérias e outros
micro-organismos (Miller & Diep 2008; Lutz et al. 2014).
Dados de surtos de infecções com surgimento na comunidade
sugerem que o contato entre pele e fômite seja uma importante e comum
rota para a aquisição de cepas bacterianas infectantes (Begier et al. 2004;
Miller & Diep 2008). S. aureus e MRSA têm sido identificados como
contaminantes de diversas superfícies fora de ambientes hospitalares, como
móveis das casas de pacientes e de profissionais de saúde (Scott et al.
2008), áreas públicas de hospitais (Manning et al. 2004), veículos de
emergência médica (Eibicht & Vogel 2011) e em destaque, veículos de
transporte público. Os ônibus e demais superfícies de contato que fazem
parte da estrutura do sistema de transporte público são possíveis rotas de
transmissão de importantes bactérias, como S. aureus e MRSA (Stepanóvic
et al. 2008; Otter & French 2009; Simões et al 2011; Iwao et al. 2012;
Conceição et al. 2013).
Entretanto, no Brasil, há uma escassez de dados sobre a
prevalência e epidemiologia de micro-organismos, especialmente deS.
aureus, circulantes em superfícies nas linhas dos transportes públicos
coletivos. Portanto, o entendimento da patogenicidade, disseminação e
distribuição clonal desses micro-organismos no sistema de transporte
público em Goiânia-GO pode servir como importante ferramenta, elucidando
se a utilização do transporte é um fator de risco para colonização e infecção
por S. aureus.
Os dados resultantes podem atestar se as empresas responsáveis
pelo transporte e população usuária fazem uso de práticas higiênico-

31
sanitárias eficientes. Espera-se que o trabalho contribua para
implementação de medidas educacionais e de prevenção da contaminação e
disseminação de micro-organismos no sistema de transporte, como a
execução de métodos de limpeza e desinfecção de superfícies mais
eficientes, além de oferecer aos passageiros alternativas para higienização
das mãos no decorrer ou ao fim do uso do transporte.
Assim, acredita-se, que a conseqüência de todos os esforços em
conjunto, seja a quebra da transmissão cruzada de patógenos e diminuição
do risco à saúde dos usuários, além da melhoria da qualidade do serviço de
transporte público oferecido à população da cidade de Goiânia.

32
3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Estimar a prevalência de contaminação/colonização microbiológica

por Staphylococcus aureus e MRSA nas barras fixas dos ônibus e catracas
das plataformas e terminais da linha Leste-Oeste do sistema público de
transporte coletivo do município de Goiânia-GO.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Isolar e identificar S. aureus das amostras obtidas das barras fixas dos
ônibus e catracas das plataformas e terminais;
 Determinar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos dos S. aureus
identificados;
 Caracterizar por meio de tipagem molecular as cepas encontradas;
 Avaliar o relacionamento genético das cepas circulantes no transporte
público coletivo de Goiânia.

33
4 MÉTODOS

Figura 7. Fluxograma da metodologia.

FOX-R – isolados resistentes à cefoxitina; CIM – Concentração Inibitória Mínima; lukS-F – gene para
Leucodicina de Panton-Valentine; FV – fatores de virulência; PFGE – Pulsed field Gel Electrophoresis.

34
4.1 AMOSTRAGEM

As coletas das amostras foram realizadas na linha Leste-Oeste da

RMTC do município de Goiânia-GO, no período de agosto de 2012 a julho
de 2013. Uma listagem com os números de identificação de todos os ônibus
(90) que trafegavam pela linha foi fornecida pela METROBUS para facilitar o
controle da coleta. Amostras das barras fixas verticais e horizontais das 04
portas de entrada/saída dos 90 ônibus que abastecem a linha, bem como
das catracas de entrada e saída de todos os terminais (05) e das
plataformas (19), que se encontram dispostas ao longo da linha, foram
coletadas com o auxílio de swabs estéreis.
Os swabs foram umedecidos em caldo BHI (Brain Heart Infusion -
caldo infusão de cérebro e coração) (Becton, Dickinson and Company,
Sparks, MD, EUA), firmemente friccionados no local a ser coletado em
movimentos rotatórios, acondicionados em tubos estéreis contendo 2 mL do
mesmo caldo e imediatamente encaminhados ao Laboratório de
Bacteriologia Aplicada do IPTSP/UFG para posterior processamento. As
amostras foram coletadas em dias úteis, após o horário de pico, entre 9 e 11
horas no período matutino e 14 e 17 horas no período vespertino. A coleta
nos ônibus foi realizada com o veículo em tráfego.
Para a coleta das amostras uma autorização foi emitida junto à
RMTC e Metrobus, permitindo que as coletas fossem realizadas em todos os
ônibus, terminais e plataformas da linha.

4.2 PROCEDIMENTOS MICROBIOLÓGICOS

Os procedimentos laboratoriais para isolamento e identificação

presuntiva de S. aureus foram realizados de acordo com as técnicas
recomendadas pela Anvisa (2013). No laboratório, o caldo BHI/swab foi
homogeneizado por 10-15 segundos em vórtex e incubado por 24 horas a
37°C. Após essa incubação, foi realizada a semeadura do caldo BHI/swab
em ágar manitol salgado e TSA (Triptic Soy Agar) (Himedia, Mumbai, India),
acrescido de 4% de NaCl e oxacilina (6 µg/mL), com incubação a 37°C por

35
24-48 horas. Do ágar manitol salgado foram selecionadas colônias com halo
amarelado, devido à fermentação do manitol, e com morfologia sugestiva de
estafilococos (colônias lisas, cremosas, arredondadas com coloração
variando de branco ou acinzentado a amarelo-alaranjado). A partir do meio
TSA foram selecionadas colônias com as mesmas características
macroscópicas.
Todas as colônias selecionadas foram subcultivadas em ágar
nutriente (Himedia, Mumbai, India) e submetidas ao teste da catalase e
coloração de Gram. Isolados catalase positivos e com características
microscópicas de S. aureus (cocos Gram-positivos, isolados, em pares ou
agrupados em forma de cachos de uva e com tamanho variando de 0,5 a 1,5
µm) foram acondicionados em meio contendo caldo TSB (Triptict Soy Broth)
(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EUA), acrescido de 30% de
glicerol e armazenados em freezer a -80°C para posterior processamento.

4.3 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO

Após subcultivo dos isolados em ágar nutriente (Himedia, Mumbai,

India) e crescimento a 37°C/24 horas, o DNA genômico foi extraído seguindo
protocolo estabelecido por Aires-de-Sousa et al. (2007) com modificações.
Quatro a cinco colônias de bactérias foram suspensas em 50 μL de solução
tampão TE 1X (10mM Tris, 1mM EDTA, pH8), adicionados de βμL de
lisostafina (5 mg/mL) (Sigma, St. Louis, MO, EUA). A suspensão foi
incubada em bloco térmico a 37°C por 30 minutos. Logo após, para
desnaturação, as amostras foram aquecidas em banho-maria a 95°C por 15
minutos e 150μL de H2O milliQ esterilizada foram adicionados à suspensão
que em seguida, foi homogeneizada. Após uma centrifugação de 5 minutos
a 13.000 rpm, o sobrenadante foi utilizado como DNA template para as
reações de amplificação.

4.4 PCR PARA DETECÇÃO DO GENE femA

36
 Todos os cocos Gram-positivos com morfologia sugestiva de S.
aureus foram submetidos à reação de amplificação do gene femA para
confirmação da espécie seguindo protocolo estabelecido por Mehrotra et al.
(2000). A reação foi preparada em um volume final de 50 µL contendo
tampão de reação (20 mM Tris-HCl; 50 mM KCl; pH 8,4) (Promega,
Madison, WI, EUA); 1,5 mM de MgCl2 (Promega, Madison, WI, EUA); 100
μM de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP) (Sigma, St. Louis, MO,
EUA); 0,β μM de cada oligonucleotídeo iniciador (Eurofins Genomics,
Huntsville, AL, EUA); 2,5 U de Taq DNA polimerase (Promega, Madison, WI,
EUA) e β0 ηg do DNA template. A reação de amplificação foi realizada
usando termociclador convencional (Axygen®) seguindo o programa: 5
minutos a 94ºC, seguidos de 35 ciclos de 2 minutos a 94ºC, 50 segundos a
57ºC e 1 minuto a 72ºC e uma extensão adicional de 7 minutos a 72ºC. A
sequência de nucleotídeos iniciadores utilizada foi a seguinte:
femA-F: 5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-γ’
femA-R: 5’- AAAAAAGCACATAACAAGCG-γ’
Como controle positivo foi usado a cepa ATCC 25923 de S. aureus e
como controle negativo a reação sem DNA bacteriano.
A eletroforese dos produtos de amplificação foi realizada em gel de
agarose (Amresco, Solon, OH, EUA) a 1,5% em tampão Tris-Borato-EDTA
1X por 50 minutos a 110 V. O ladder de 50pb (Sigma, St. Louis, MO, EUA)
foi utilizado como marcador molecular. Os géis foram visualizados após
coloração com brometo de etídeo (0,5μg/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA,
EUA) e fotografados sob transiluminação com luz ultravioleta e capturados
com o sistema Molecular Imager GelDocXR (Bio-Rad®).

4.5 TESTES DE SUSCETIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS

4.5.1 Teste de disco-difusão

Amostras identificadas como S. aureus pela detecção do gene femA

foram subcultivadas em ágar nutriente por 24 horas e submetidas ao teste
de disco difusão conforme preconizado pelo CLSI (CLSI 2015). Um inóculo

37
padrão contendo 1,5 x 108 ufc/mL (turbidez da escala 0,5 de MacFarland) foi
utilizado para a semeadura das placas de ágar Müeller-Hinton (Himedia,
Mumbai, India) com o auxílio de um swab estéril. Sobre as placas inoculadas
foram depositados os seguintes discos de antimicrobianos: eritromicina,
clindamicina, quinupristina-dalfopristina, rifampicina, ciprofloxacina,
tetraciclina, penicilina, sulfametoxazol-trimetoprim (Laborclin, Pinhais, PR,
Brasil), cefoxitina e mupirocina (Oxoid, Basingstoke, Hants, UK).
O teste D foi realizado em conjunto ao teste de disco-difusão para
identificação do fenótipo de resistência conhecido como MLS B, sendo o
disco de eritromicina colocado a uma distância de 15 mm da borda do disco
de clindamicina na placa de antibiograma. Após incubação foi observado se
houve achatamento do halo de inibição do crescimento em torno do disco da
clindamicina. Quando houve deformação do halo (que significa que o isolado
possuía resistência induzível) o isolado foi relatado com sendo resistente
aos três antimicrobianos correlatos (eritromicina, clindamicina e
quinupristina-dalfopristina). A resistência constitutiva foi detectada quando o
isolado foi resistente à eritromicina, clindamicina e quinupristina-dalfopristina
sem apresentar deformação do halo de inibição do crescimento.
O controle de qualidade dos antimicrobianos foi realizado com as
cepas ATCC de S. aureus 25923. A leitura dos halos de inibição foi realizada
segundo os critérios estabelecidos pelo CLSI (CLSI 2015).

4.5.2 Determinação da concentração inibitória mínima

Amostras resistentes à cefoxitina detectadas pelo teste de disco-

difusão foram submetidas ao E-test® (Biomérieux, Solna, Suécia) para
determinação da concentração inibitória mínima (CIM) aos antimicrobianos
oxacilina e vancomicina. O teste foi realizado seguindo instruções
recomendadas pelo fabricante. Após subcultivo dos isolados em ágar
nutriente (Himedia, Mumbai, India) por 24 horas/37°C um inóculo padrão foi
preparado e semeado em placas de ágar Müeller-Hinton (Himedia, Mumbai,
India) como descrito no item 4.5.1. Sobre as placas inoculadas foram
depositadas fitas plásticas impregnadas com concentração crescente dos
antimicrobianos a serem testados. As placas foram incubadas em estufa

38
37°C e a interpretação dos resultados obtidos foi realizada após 24 horas de
incubação seguindo critérios estabelecidos pelo CLSI (CLSI 2015). A cepa
ATCC de S. aureus 29213 foi utilizada como controle de qualidade do teste e
das fitas de E-test®.

4.6 PCR PARA DETECÇÃO DO GENE mecA

A detecção do gene mecA foi utilizada como marcador para

identificação de MRSA. Todos os S. aureus resistentes à cefoxitina,
identificados pelo teste de disco-difusão, foram submetidos à PCR para
detecção do gene mecA. O protocolo estabelecido por Murakami et al.
(1991) com modificações foi seguido para realização da tipagem. Os
oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram:
Oligonucleotídeo F 5’- AAAATCGAATGGTAAAGGTTGGC -γ’
Oligonucleotídeo R 5’- AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC -γ’
A mistura da reação foi preparada em um volume final de 50 μL
contendo tampão de reação (20 mM Tris-HCl pH 8,4; 50 mM KCl) (Promega,
Madison, WI, EUA); 1,5 mM de MgCl2 (Promega, Madison, WI, EUA); 80 μM
de cada dNTP (Sigma, St. Louis, MO, EUA); 0,β5 μM de cada
oligonucleotídeo iniciador (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA), 1U de Taq
DNA polimerase (Promega, Madison, WI, EUA) e β0 ηg do DNA template. A
reação de amplificação foi realizada em termociclador (Axygen®) seguindo o
programa: 4 minutos a 94ºC, 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos
a 53ºC, 1 minuto a 72ºC e uma extensão adicional de 4 minutos a 72ºC.
Como padrão de peso molecular foi utilizado o marcador molecular
de 50pb (Sigma, St. Louis, MO, EUA), como controle positivo o DNA extraído
das cepas de S. aureus USA300 e clone Pediátrico e como controle negativo
a mistura da reação sem o DNA bacteriano. Após o término da reação, os
produtos finais da amplificação foram submetidos à eletroforese como
descrito no item 4.4.

4.7 MULTIPLEX PCR PARA TIPAGEM DO SCCmec

39
 A metodologia de PCR multiplex foi utilizada para determinar o tipo
de SCCmec das cepas MRSA identificadas. A técnica foi realizada seguindo
protocolo desenvolvido por Oliveira & de Lencastre (2002) e revisado por
Milheiriço et al. (2007).
A tipagem foi realizada em uma única reação de multiplex PCR
utilizando-se os primers listados no quadro 2.

Quadro 2. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para tipagem do SCCmec dos

Stapylococcus aureus isolados
Especificidade Tamanho
Oligonucleotídeo
Sequência do oligonucleotídeo 5’γ’ (Tipo de do
iniciador
SCCmec, região) amplicon
CIF2 F2 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG
SCCmec tipo I 495
CIF2 R2 ATTTACCACAAGGACTACCAGC
KDP F1 AATCATCTGCCATTGGTGATGC
SCCmectipo II 284
KDP R1 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG
MECI P2 ATCAAGACTTGCATTCAGGC SCCmec tipos II e
209
MECI P3 GCGGTTTCAATTCACTTGTC III
DCS F2 CATCCTATGATAGCTTGGTC SCCmec tipos I, II
342
DCS R1 CTAAATCATAGCCATGACCG e IV
RIF5 F10 TTCTTAAGTACACGCTGAATCG
SCCmec tipo III 414
RIF5 R13 GTCACAGTAATTCCATCAATGC
ccrC F2 GTACTCGTTACAATGTTTGG SCCmec tipo V,
449
ccrC R2 ATAATGGCTTCATGCTTACC complexo ccr
ccrB2 F2 AGTTTCTCAGAATTCGAACG SCCmec tipo II e
311
ccrB2 R2 CCGATATAGAAWGGGTTAGC IV, complexo ccr
SCCmec III J1 F CATTTGTGAAACACAGTACG SCCmec tipo III,
243
SCCmec III J1 R GTTATTGAGACTCCTAAAGC região J1
SCCmec V J1 F TTCTCCATTCTTGTTCATCC SCCmec tipo V,
377
SCCmec V J1 R AGAGACTACTGACTTAAGTGG região J1
MECA P4 TCCAGATTACAACTTCACCAGG mecA(controle
162
MECA P7 CCACTTCATATCTTGTAACG interno)

Para a reação de amplificação foi utilizada uma mistura de reação de

50 µL contendo tampão de reação (10 mM Tris–HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA,
pH 8,0) (Promega, Madison, WI, EUA), 1,5 mM de MgCl2 (Promega,
Madison, WI, EUA); 40 µM de cada dNTP (Sigma, St. Louis, MO, EUA); 0,2
µM dos primers KDP F1 e KDP; 0,4 µM do primers CIF2 F2, CIF2 R2, RIF5
F10, RIF5 F13, SCCmecIII J1 F, SCCmecIII J1 R, SCCmecV J1 F e
SCCmecV J1 R; 0,8 µM do primers MECI P2, MECI P3, DCS F2, DCS R2,
MECA P4, MECA P7, ccrB2 F2, ccrB2 R2, ccrC F2 e ccrC R2 (Imprint
Genetix, Miami, FL, EUA); 1,25 U de Taq DNA polimerase (Promega,
Madison, WI, EUA) e 5 ηg do DNA template. A reação de amplificação foi
realizada em termociclador (Axygen®) com os seguintes parâmetros: 4

40
minutos a 94°C, 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 53°C, 1
minuto a 72°C e uma extensão adicional de 4 minutos a 72°C. Até o
momento da eletroforese os tubos foram mantidos a 4°C.
Como controle positivo dos diferentes tipos de SCCmec foram
utilizadas as cepas COL e PER34 (SCCmec tipo I), N315 e BK2464
(SCCmec tipo II), ANS46 e HU25 (SCCmec tipo III) e MW2 e USA300
(SCCmec tipo IV).
Os produtos da reação de amplificação foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose (Amresco, Solon, OH, EUA) a 2% em
tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X durante duas horas a 75V. Após o término
da eletroforese o DNA foi corado em solução aquosa de brometo de etídeo
(0,5 µg/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), visualizado sobre
transiluminação ultravioleta e capturados com o sistema Molecular Imager
GelDoc XR (Bio-Rad®). Como padrão de peso molecular, foi utilizado o
marcador de 50 pb (Sigma, St. Louis, MO, EUA).

4.8 PCR PARA DETECÇÃO DO GENE lukS-F CODIFICADOR DA

LEUCOCIDINA DE PANTON-VALENTINE

A PCR para detecção do gene lukS-F foi realizada para todos os S.

aureus identificados. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a
amplificação do gene lukS-F foram sintetizados a partir de sequências de
DNA genômico depositadas no banco de dados GenBank (número de
acesso GenBank AB006796) (Lina et al. 1999). As sequências dos
oligonucleotídeos iniciadores utilizadas foram:
PVL1: 5’ - ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA- γ’
PVLβ: 5’- GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC – γ’
A mistura de reação foi preparada em um volume final de 50 µL
contendo tampão de reação (20 mM Tris-HCl, pH 8,4; 50 mM KCl)
(Promega, Madison, WI, EUA), 1,5 mM de MgCl2 (Promega, Madison, WI,
EUA); 80 μM de cada dNTP(Sigma, St. Louis, MO, EUA); 0,β5 μM de cada
oligonucletídeo iniciador (Integrated DNA Technologies, Coralville, IW, EUA);
1 U de Taq DNA polimerase(Promega, Madison, WI, EUA); β0 ηg do DNA

41
template. Para a reação de amplificação utilizou-se o programa: 5 minutos a
94°C, 25 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55 °C, 1 minuto a
72°C e uma extensão adicional de 7 minutos a 72°C em termociclador
convencional (Axygen®). O marcador molecular de 50pb foi utilizado como
padrão de peso molecular, a cepa S. aureus OSPC (Oceania Southwest
Pacific Clone) como controle positivo e a mistura da reação sem o DNA
bacteriano como controle negativo. Após o término da reação, os produtos
finais da amplificação foram submetidos à eletroforese como descrito no item
4.4.

4.9 MULTIPLEX PCR PARA DETECÇÃO DE GENES CODIFICADORES

DE FATORES DE VIRULÊNCIA

Os isolados de S. aureus foram submetidos à detecção de genes

que codificam fatores de virulência pela técnica de multiplex PCR de acordo
com Jarraud et al. (2002) com modificações. Foram realizadas 2 reações
com as sequências-alvo descritas no Quadro 3.
A reação de PCR foi realizada em volume final de 25 µL contendo
5µL de tampão de reação (10 mM Tris–HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, pH 8,0)
(Promega, Madison, WI, EUA), 100 μM de cada dNTP (Sigma, St. Louis,
MO, EUA), 5,0 mM de MgCl2 (Promega, Madison, WI, EUA), 150 a 400 mM
de cada oligonucleotídeo iniciador (Eurofins Genomics, Huntsville, AL, EUA),
1 U de Taq DNA (Promega, Madison, WI, EUA), e 10 a β0 ηg de DNA
template. A reação foi realizada em termociclador convencional (Axygen®)
seguindo o programa: 15 minutos a 95 ºC, seguidos de 35 ciclos de 30
segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C (reação 1) e 56°C (reação 2), 50
segundos a 72°C e uma extensão adicional de 10 minutos a 72°C.
Como controles positivos da reação I foram utilizadas as cepas N315
(tst, sec), HW2 (sec, seh, sea) e USA400 (seh) e na reação II as cepas COL
(hlb, seb) e QF34 (hlb). A amostra 1036BV2 foi utilizada como controle
positivo do etana reação II após ter sido identificada como positiva para esse
gene. Nas duas reações, como controle negativo utilizado foi a mistura da
reação sem DNA bacteriado.

42
 Em seguida, os produtos de amplificação foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose (Amresco, Solon, OH, EUA) a 1,5% em
tampão Tris-Borato-EDTA 1X por 90 minutos a 100 V. Foi utilizado, como
padrão de peso molecular, o marcador de 50 pb. O gel foi corado com
brometo de etídeo a 0,5 μg/mL (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) (0,5μg/mL)
visualizado e fotografado sob transiluminação com luz ultravioleta e
capturados com o sistema Molecular Imager GelDoc XR (Bio-Rad®).

Quadro 3. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a detecção de genes de virulência

em Staphylococcus aureus
Tamanho
Oligonucleotídeo do
Sequência do oligonucleotídeo 5’γ’
iniciador Amplicon
(pb)
TSST-F TTCACTATTTGTAAAAGTGTCAGACCCACT
180
TSST-R TACTAATGAATTTTTTTATCGTAAGCCCTT
SEA-F GAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACA
Reação I 560
SEA-R CAAATAAATCGTAATTAACCGAAGGTTC
SEC-F GTAAAGTTACAGGTGGCAAAACTTG
297
SEC-R CATATCATACCAAAAAGTATTGCCGT
SEE-F CAAAGAAATGCTTTAAGCAATCTTAGGC
482
SEE-R CACCTTACCGCCAAAGCTG
SEH-F CAATCACATCATATGCGAAAGCAG
376
SEH-R CATCTACCCAAACATTAGCACC
SEB-F ATTCTATTAAGGACACTAAGTTAGGGA
404
SEB-R ATCCCGTTTCATAAGGCGAGT
SED-F GAATTAAGTAGTACCGCGCTAAATAATATG
492
SED-R GCTGTATTTTTCCTCCGCTAAATAATATG
ETA-F ACTGTAGGAGCTAGTGCATTTGT
Reação II 190
ETA-R TGGTACTTTTGTCTATCTTTTTCATCAAC
ETB-F CAGATAAAGAGCTTTATACACACATTAC
612
ETB-R AGTGAACTTATCTTTCTATTGAAAAACACTC
HLB-F GTGCACTTACTGACAATACTGC
309
HLB-R GTTGATGAGTAGCTACCTTCAGT

4.10 ELETROFORESE EM GEL EM CAMPO PULSADO (PULSED FIELD

GEL ELECTROPHORESIS – PFGE)

O perfil de macrorrestrição do DNA cromossômico dos S. aureus foi

determinado pela técnica de PFGE, após digestão do cromossomo
bacteriano com a enzima de restrição SmaI (Chung et al. 2000).
Os isolados de S. aureus e a cepa NCTC 8325 (utilizada como
controle interno para normalização dos géis) foram cultivados em ágar

43
nutriente a 37°C por 24 horas, em seguida as células foram suspensas em
tampão Tris-NaCl (Tris 10 mM pH 8,0, NaCl 1M) e tiveram concentração
ajustada pelo cálculo da OD 620nm (V add (µL) = OD x 40 x 210 – 210)
utilizando espectrofotômetro.
A suspensão celular ajustada foi homogeneizada com 100 µL de
agarose LMP (Low Melting Point agarose) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA)
1,5% para formação de pequenos blocos de agarose (plugs). As células
bacterianas contidas nos plugs foram lisadas por 5 horas em solução EC
(Tris 6 mM pH 8,0; NaCl 1 M; EDTA 0,1 M pH 8,0; desoxicolato de sódio
0,2% e sódio laurilsarcosina 0,5% (Sigma, St. Louis, MO, EUA) acrescida de
uma solução de lise composta por lisozima (100 µL/mL), lisostafina (50
µL/mL) e RNAse (50 µL/mL) (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Após esse
período, a desproteinização foi realizada em solução ES (EDTA 0,5 M, pH
9,0 e sódio laurilsarcosina 1%) com Proteinase K (Amresco, Solon, OH,
EUA) (1 mg/mL) por um período mínimo de 17 horas a 50ºC. Após a
incubação, os blocos de gel foram lavados (cinco lavagens com incubações
de 30 minutos cada) com a solução tampão TE (Tris 10 mM pH 7,5 e EDTA
1 mM pH 8,0) e armazenados nesta solução a 4ºC até serem submetidos à
digestão enzimática e eletroforese.
Para cada isolado, o DNA contido no bloco de gel foi digerido com
20U/µL da enzima de restrição SmaI (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e
incubado overnigtht a 25°C. A eletroforese em campo pulsado foi realizada
em gel de agarose especial para corrida (Sigma, St. Louis, MO, EUA) 1% em
solução tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X (Tris 90 mM, ácido bórico 90 mM e
EDTA 2 mM) no sistema CHEF DRII (Bio-Rad Laboratories). A eletroforese
para resolução dos fragmentos foi realizada com corrente alternando em
intervalos de pulso de 5 a 35 segundos a 6 V/cm e temperatura de 14,0ºC
por 22 horas.
Após a eletroforese, os géis foram corados com brometo de etídeo
(1 µg/mL) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por vinte minutos e visualizados
sob luz UV em transiluminador e capturados com o sistema Molecular
ImagerGelDoc XR (Bio-Rad®). A análise do perfil dos fragmentos de
macrorrestrição resultantes foi realizada por inspeção visual segundo os
critérios sistematizados por Tenover et al. (1995), as cepas foram

44
classificadas em: 1) geneticamente indistinguíveis ou clones, quando
apresentaram perfil de restrição com o mesmo número de bandas e
correspondência de tamanho entre elas; 2) estritamente relacionadas,
quando diferiram em duas a três bandas nos perfis de restrição; 3) cepas
possivelmente relacionadas, quando diferiram em 4 a 6 bandas nos perfis de
restrição e 4) cepas não relacionadas, quando diferiram em sete ou mais
bandas nos perfis de restrição.
Adicionalmente, os géis de PFGE foram utilizados como imagens
preto e branco, invertidas de oito bits e processados pelo programa
BioNumerics (versão 5.0; AppliedMaths, Ghent, Belgium). A construção do
dendrograma para avaliar a relação genética entre as cepas foi realizada
utilizando o coeficiente de similaridade de Dice (Dice, 1945), baseado na
posição e presença das bandas e no algoritmo de análise filogenética
UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method) através de agrupamentos por
médias não ponderadas (Sneath and Sokal, 1973). Os parâmetros de
otimização e tolerância foram utilizados com os respectivos valores, 0,7 e
1,0%. Cada cluster foi definido como um grupamento de perfis (n ≥ β)
apresentando um coeficiente de similaridade acima de 80% (Carriço et al.
2005).

4.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A base de dados foi construída utilizando o software Microsoft Excel

versão 2013. O intervalo de confiança foi calculado com auxílio do software
OpenEpi versão www.OpenEpi.com.

45
5 RESULTADOS

A figura 7 mostra, em resumo, os resultados obtidos desde a coleta

das amostras até a tipagem dos isolados.

Figura 8. Fluxograma dos resultados obtidos. iMLSB e cMLSB – fenótipo de resistência aos macrolídeos,
lincosaminas e estreptograminas do tipo B induzível e constitutivo, respectimavamente; FOX – cefoxitna; FV –
fatores de virulência; PFGE – Pulsed Field Gel Electrophoresis; MRSA – Methicillin-resistant S. aureus.

46
5.1 PREVALÊNCIA DE CONTAMINAÇÃO/COLONIZAÇÃO POR S. aureus

No período destinado a coleta das amostras foram obtidos 720

swabs provenientes das barras fixas horizontais e verticais dos ônibus bi e
tri-articulados, e 132 swabs obtidos de todas as catracas das plataformas e
terminais de integração, totalizando 852 swabs coletados em toda extensão
da linha Leste-Oeste.
O número de swabs coletados pela manhã foi de 370. No período da
tarde foram coletados 318 swabs. Não há dados sobre o horário de coleta do
restante das amostras.
Após seleção sugestiva em meio seletivo/diferencial e coloração de
Gram, foram armazenados 442 cocos Gram positivos. Esses isolados foram
submetidos a PCR para detecção do gene femA (figura 8), onde foi possível
fazer a identificação de 151 S. aureus (34,2% dos cocos Gram positivos)
quando houve a amplificação de um produto de 132pb.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

132 pb

Figura 9. Eletroforese para detecção do gene femA. Colunas 1 a 21- amostras testadas; coluna
22 - controle positivo ATCC 25923, coluna 23 - controle negativo e coluna 24 - marcador de
peso molecular de 50 pb.

A prevalência da contaminação da linha Leste-Oeste por S. aureus

foi, portanto, de 17,7% (151/852, IC 95% 15,3 – 20,4). Plataformas, terminais
e ônibus apresentaram níveis de contaminação semelhantes, com
prevalência de contaminação de 18,0% (130/720, IC95% 15,4 – 21,0) para

47
os ônibus, 15,8% (16/101, IC 95% 9,9 – 24,2) para as plataformas e 16,1%
(5/31, IC 95% 7,0 – 32,6) para os terminais (figura 9).

Dos 370 swabs coletados pela manhã, foram obtidos 83 isolados

(22,4%; IC 95% 18,5 – 26,9). No período da tarde a prevalência de
contaminação foi de 13,5% (n=43) (IC 95% 10,2 – 17,7).

Figura 10. Prevalência de Staphylococcus aureus identificados estratificado por superfícies.

5.2 PERFIL DE SUSCETIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

A tabela 2 mostra os perfis de suscetibilidade encontrados para os

S. aureus identificados. Dentre os 151 isolados, 148 isolados (98,0%) foram
resistentes à pelo menos um dos antibióticos testados e 75,5% (114/151)
dos isolados foram considerados multirresistentes.
Setenta e um isolados (47,0%) foram resistentes a eritromicina,
dentre esses, sessenta e dois (41,0% dos S. aureus) apresentaram o
fenótipo iMLSB, ou seja, foram capazes de induzir resistência à clindamicina
na presença de eritromicina em baixas concentrações, sendo teste D
positivo (figura 10). Quarenta e quatro (44/151; 29,1%) isolados
apresentaram fenótipo cMLSB, foram resistentesà eritromicina, clindamicina
e quinupristina-dalfopristina sem apresentar resistência induzível.
Seis (4,4%) isolados foram resistentes à cefoxitina, antibiótico
utilizado como marcador da resistência à meticilina e demais penicilinas
semissintéticas no teste de disco-difusão. Para as amostras cefoxitina
resistentes foi determinada a concentração inibitória mínima para a oxacilina

48
e vancomicina pelo Etest®. Três isolados tiveram CIM para a oxacilina ≥ 4
µg/mL, sendo classificados como MRSA. O isolado com o nível mais
elevado de resistência à OXA foi proveniente da barra fixa de um ônibus
(1046BV2) com CIM = 96 µg/mL (figura 11). Todos os isolados testados
foram sensíveis à vancomicina, apresentando CIM ≤ β µg/mL.

Tabela 2.Perfil de suscetibilidade dos os Staphylococcus aureusaos

antimicrobianos testados
Antimicrobianos Ra Sb
n (%) n (%)
MUP 0 151 (100)
RIF 6 (4,0) 145 (96,0)
FOX 6 (4,0) 145 (96,0)
SUT 11 (7,3) 140 (92,7)
CIP 44 (29,1) 107 (70,9)
CLI 88 (58,3) 63 (41,7)
QD 94 (62,3) 57 (37,8)
ERI 111 (73,5) 40 (26,5)
PEN 137 (90,7) 14 (9,3)
a
– Resistente; b – Suscetível
MUP – Mupirocina; RIF – Rifampicina; FOX – Cefoxitina; SUT – Sulfametoxazol/trimetoprim;
CIP – Ciprofloxacina; CLI – Clindamicina; QD – Quinupristina/Dalfopristina; ERI – Eritromicina;
PEN - Penicilina

Figura 11. Teste de disco-difusão juntamente com o teste D para determinação do

perfil de suscetibilidade e do fenótipo MLSB nos S. aureus isolados. O isolado
resitente a eritromicina (seta azul) possui o fenótipo iMLS B quando esse antibiótico
induz resistência a clindamicina (seta verde). A resistência induzível é vista pela
deformação do halo de inibição da clindamicina (seta vermelha) que fica com o
formato da letra D.

49
 Figura 12. Determinação da concentração inibitória mínima para os S. aureus
resistentes à cefoxitina por meio de Etest.

5.3 DETECÇÃO DO GENE mecA

Todas as amostras cefoxitina resistentes foram submetidas à PCR

para detecção do gene mecA. Das seis amostras analisadas, quatro foram
mecA positivas, sendoconfirmados como MRSA (figura 12). Portanto, a
prevalência de MRSA no sistema de transporte de Goiânia foi de 0,5%
(4/852).
Uma amostra foi proveniente da catraca de uma plataforma que
abastece a região onde fica situado o Hospital Geral de Goiânia Alberto
Rassi, importante hospital público da cidade e as demais foram provenientes
das barras fixas de diferentes ônibus circulantes da linha.
Todos os MRSA isolados foram multirresistentes e não
apresentaram fenótipo MLSB induzível, porém uma cepa (PHGGE4)
apresentou fenótipo MLSB constitutivo.

50
 12 3 4 5 6 7 8 9

533 pb

Figura 13. Eletroforese em gel de agarose dos produtos da PCR para

detecção do gene mecA. Colunas 1 a 6 – S. aureus; coluna 7 – cepa
USA300 (controle positivo); coluna 8 – controle negativo; coluna 9 –
marcador de peso molecular 50 pb. Produto da PCR possui 533pb.

5.4 TIPAGEM DO SCCmec

A tipagem do SCCmec foi realizada em apenas uma reação de

multiplex PCR. Todos os 4 MRSA tiveram o tipo de SCCmec definidos
(figura 13).Concluiu-se que duas amostras foram tipadas como SCCmec tipo
IV e duas como SCCmec tipoI.

1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

495pb
342pb

162 pb

Figura 14.Multiplex PCR para tipagem do SCCmec. Colunas 1 a 4 – S. aureus. Coluna 1 e 2 SCCmec
tipo IV, coluna 3 e 4 SCCmec tipo I. Coluna 5 e 6 - controles SCCmec tipo I (cepas COL e PER34),
coluna 7 e 8 – controles SCCmec tipo II (cepas N315 e BK2464), colunas 9 e 10 – controles SCCmec
tipo III (cepas ANS46 e HU25), colunas 11 e 12 – controles SCCmec tipo IV (cepas MW2 e USA300),
coluna 13 – controle negativo e coluna 14 – marcador de peso molecular 50pb.

51
5.5 DETECÇÃO DOS GENES RESPONSÁVEIS POR CODIFICAR FATORES DE
VIRULÊNCIA

5.5.1 Detecção do gene lukS-F(Leucocidina de Panton-Valentine)

Detectou-se a presença do gene lukS-F (figura 14) em 6,0% do

isolados (9/151). A prevalência de cepas produtoras de PVL no ambiente do
sistema de transporte público de Goiânia foi de 1,1%. Todos os isolados
foram provenientes das barras fixas dos ônibus, sendo dois de um mesmo
ônibus, porém de barras fixas de diferentes portas, o restante dos isolados
foram recuperados de diferentes ônibus. Um dos isolados positivos para o
gene da PVL também era MRSA.
Todos os nove isolados PVL+ foram multirresistentes e quatro
apresentaram o fenótipo iMLSB.

12 3 4 5 6 7 8 910 11 12

433 pb

Figura 15. Eletroforese para detecção do gene lukS-F responsável pela

codificação da Leucocidina de Panton-Valentine. Colunas 2, 5 e 8 isolados
positivos para o gene lukS-F, coluna 10 - controle positivo (cepa OSPC),
coluna 11 - controle negativo e coluna 12 - marcador de peso molecular de
50 pb. Amplicon possui 433 pb.

5.5.2 Detecção dos genes que codificam enterotoxinas, toxinas

esfoliativas, hemolisinas e toxina da Síndrome do Choque Tóxico por
multiplex PCR

52
 Através da reação de multiplex para os fatores de virulência, detectou-
se 37 amostras (24,5%) com pelo menos um dos genes codificadores dos
fatores de virulência analisados.

Tabela 3. Perfis de fatores de virulência encontrados nos Staphylococcus aureus isolados

do sistema de transporte público
Isolados Fatores de virulência
1059BV4, 1064BH1, PVME1 Sea
1058BV2 sea, seb, seh
1040BH2 sea, lukS-F
1003BH2 sea, tst
1061BH3 seb
1030BV4 Seb, seh
1063BH3, 1003BH1, 1016BH1, 1056BV2 seb, seh, hlb
1016BV4, 1049BH4 seb, hlb
1079BH4 seb, eta, etb
1078BH4 seb, etb
1047BV4, 1036BV4, 1005BH2, PJE4 sec
1030BH2 sec, hlb
1078BH1 sec, tst
1024BV1, PVME3 seh
1036BV2, 1012BV2, PHGGS1, PAE1-1 eta
1049BV4 hlb
1034BH1 hlab, tst
1001BH1, 1001BH2 hlb, lukS-F
1038BH1, 1042BH3, 1050BH2, 1070BH3, tst
PUE4am
1046BV2, 1017BV2, 1067BH3, 1078BV1, lukS-F
1004BH3, 1048BH4

Vinte e quatro amostras (15,9%) foram consideradas

enterotoxigênicas. Dezessete isolados (10,6%) apresentaram genes para
mais de um fator de virulência. Considerando os resultados da multiplex
PCR para a detecção dos fatores de virulência e da PCR para a detecção do
gene lukS-F, foram detectados 20 perfis de virulência (tabela 3) em 43
amostras (28,5%). Dessa maneira, a prevalência de cepas produtoras de
fatores de virulência no ambiente do sistema de transporte público de
Goiânia foi de 5,0% (43/852).

53
 Os genes mais prevalentes foram o seb e hlb, ambos presentes em
11 amostras (7,3%). Entre as enterotoxinas, seh foi o segundo gene mais
prevalente, sendo detectado em 8 amostras (5,3%), sec foi o terceiro gene
de SE mais encontrado, estando presente em 6 isolados (4%),seae sec
foram detectados em 6 isolados cada (4%). O gene eta foi encontrado em 5
isolados (3,3%) e o etb em apenas 2 (1,3%). O gene tst foi detectado em 8
amostras (5,3%). Os genes das SED e SEE não foram observados nos
isolados analisados. Genes para enterotoxinas, toxinas esfoliativas e TST
não foram encontradas nos isolados MRSA.
As figuras 15 e 16 representam a eletroforese dos produtos das
reações de PCR multiplexI e II, respectivamente.

1 2 34 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

560 pb

376 pb
297 pb

180 pb

Figura 16. Eletroforese dos produtos da PCR multiplex I. Nesta reação houve amplificação
dos genes tst, sec, seh e sea. Colunas 1 a 12 – S. aureus isolados; coluna 13 – cepa
USA400 (controle positivo – seh); coluna 14 – cepa HW2 (controle positivo – sea, seh e
sec); coluna 15 – cepa N315 (controle positivo – tst); coluna 16 – controle negativo; coluna
17 – marcador de peso molecular. O amplicon do tst possui 180 pb, do sec 297 pb, seh
possui 376 pb e sea possui 560 pb.

54
 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516 17 18 19 20 21 22 23 24

612 pb
404 pb
309 pb

190 pb

Figura 17. Eletroforese dos produtos da PCR multiplex II. Nessa reação houve amplificação dos genes
eta, hlb (apenas nos controles), seb e etb. Colunas 1 a 19 – S. aureus isolados; coluna 20 – 1036BV2
(controle positivo – eta); coluna 21 – cepa QF34 (controle postivo – hlb); coluna 22 (controle positivo –
hlb e seb); coluna 23 – controle negativo; coluna 24 – marcador de peso molecular 50 pb. O amplicon
do eta possui 190 pb, do hlb possui 309 pb, do seb possui 404 pb, e do etb possui 612 pb.

5.6 PFGE

Os 151 S. aureus identificados foram submetidos ao PFGE.

Entretanto, apenas 104 (104/151; 68,9%) puderam ser tipados, o restante
(47; 31,1%) foram classificados como não-tipáveis (NT) pelo PFGE usando a
enzima SmaI. A figura 17 mostra o dendrograma construído com base no
nível de similaridade genética entre os isolados.

A análise dos 104 isolados revelou 36 diferentes grupos (ou clusters).

Para melhor descrição, os clusters foram designados com letras em caixa
alta. Os clusters mais prevalentes foram o H, V e AE, sendo que o cluster H
agrupou 10 cepas e os clusters V e AE agruparam 9 cepas cada. Não
houve predominância de nenhum clone específico no sistema de transporte
público coletivo de Goiânia.

55
Figura 18. Comparação dos perfis de restrição dos S. aureus. CL - Cluster; FV - fatores de virulência.

56
 Dentro dos clusters observamos isolados com o mesmo perfil
genético recuperados de diferentes ônibus; isolados recuperados de
plataformas e ônibus e mesmo perfil isolados do mesmo ônibus, porém, em
sítios de coletas diferentes. Assim como isolados provenientes do mesmo
ônibus e mesma plataforma em grupos diferentes.

O cluster AE foi o único que possuía isolados provenientes de todas

as superfícies analisadas (barras e catracas de terminal e plataforma). Esse
cluster agrupou dois clones diferentes: um clone com uma amostra isolada
de uma plataforma e outra de um ônibus (PR7S1 e 1078BH1) e outro clone
com duas amostras isoladas de dois ônibus diferentes (1034BV2 e
1019BH3). O cluster P também foi policlonal, com um clone encontrado no
mesmo ônibus (1084BV3 e 1084BV4) e outro com isolados de dois ônibus
diferentes (1054BV3 e 1087BH1). Os clusters D, AB e AC também
possuíam um clone cada, com isolados recuperados de barras diferentes de
um mesmo ônibus. O cluster S possuía um clone com amostras
provenientes de superfícies diferentes, um de catraca de plataforma e outro
de ônibus.

Os clusters L, Q, V e AA também apresentaram presença de um clone

cada, sendo que foram amostras provenientes de diferentes ônibus.

Com finalidade de avaliar a similaridade genética das cepas MRSA

com clones disseminados mundialmente foi feita uma nova análise com
cepas de clones MRSA conhecidas. Interessantemente, duas cepas MRSA
apresentaram semelhança genética com dois importantes clones, o USA300
(CC5-ST8-SCCmecIV) e o clone pediátrico (CC5-ST5-SCCmecIV). As
demais cepas não apresentaram semelhança com nenhum dos clones
analisados (figura 18).

57
 Fatores de virulência

100
60

80
80
Clone pediátrico (HDEβ88)

67.2

83.9
63.7

69
41.9

64

Figura 19. Comparação entre isolados MRSA obtidos no presente estudo e clones MRSA disseminados
mundialmente. HDE288 – clone pediátrico; HU25 – clone endêmico brasileiro. ID – identificação; SCCmec – tipo do
SCCmec; FV – fatores de virulência; MDR (multidrug resistance) – multirresistência aos antimicrobianos.

Relação PFGE x Fatores de virulência

Quatro isolados possuindo genes para fatores de virulência foram

classificados como NT pelo PFGE.

Os nove isolados PVL+ estavam bem distribuídos em sete diferentes

clusters, entretanto o cluster AC, com 4 isolados, apresentou três amostras
PVL+. O gene tst predominou no cluster H, os oito isolados positivos para
esse gene, seis deles estavam nesse cluster, o que nos leva a crer que os
genes tst e lukS-F podem estar filogeneticamente relacionados ao cluster H.

Em relação às toxinas esfoliativas, dois isolados eta positivos não

foram tipadas pelo PFGE, os outros três isolados estavam em três diferentes
clusters. Já os únicos dois isoladosetb positivos foram agrupadas no cluster
E.

Os genes sea, seb e seh parecem estar relacionados ao cluster Q;

aproximadamente 60,0% dos isolados desse grupo apresentaram esses
genes. Isolados portando o gene para HLB também foram predominantes
nesse cluster. O gene seb também parece estar relacionado ao cluster C. Os
genes para SEB e SEH parecem estar relacionados ao cluster O, os dois
isolados desse cluster foram positivos para esses genes.

58
6 DISCUSSÃO

Os achados da nossa investigação sugerem que a prevalência

(17,8%) de contaminação por S. aureus na linha Leste-Oeste no município
de Goiânia-GO é elevada. A observação de contaminação em todas as
superfícies de contato com as mãos analisadas atesta o potencial dos
veículos e demais superfícies da via, como fontes de disseminação de
importantes patógenos como o S. aureus (Rodrigues et al. 2006; Simões et
al. 2011; Conceição et al. 2013; Lutz et al. 2014).
A diferença da contaminação entre as barras fixas dos ônibus e
catracas das plataformas e terminais não foi significante, prevalência de
contaminação de 18,0% (130/720, IC95% 15,4 – 21,0) para os ônibus,
15,8% (16/101, IC 95% 9,9 – 24,2) para as plataformas e 16,1% (5/31, IC
95% 7,0 – 32,6) para os terminais, entendendo-se que esses micro-
organismos estão disseminados em toda extensão da linha.
No Brasil, alguns estudos têm revelado que os ônibus de transporte
público coletivo podem estar contaminados por diferentes tipos de micro-
organismos, como bactérias, fungos e até parasitos intestinais (Rodrigues et
al. 2006; Borges et al. 2009; Murta & Massara 2009; Fernandes et al. 2012).
Rodrigues et al. (2006) realizaram um levantamento da
contaminação de superfícies nos ônibus em Curitiba (PR) encontrando
grande diversidade de bactérias, S. aureus foi encontrado com uma
ocorrência de 10,0%. Fernandes et al. (2012) em uma investigação realizada
em Vitória (ES) encontraram 85,0% das amostras coletadas de ônibus
contaminadas com ECNs;bactérias da família Enterobacteriaceaetambém
foram detectadas, porém nenhum S. aureus foi encontrado. Existem poucas
referências que abordam a contaminação de superfícies por S. aureus em
ambientes comunitários, essa escassez de trabalhos e dados no país limita
a confrontação e comparabilidade dos resultados.
Em relação ao horário de coleta, no período da manhã os ônibus
parecem estar mais contaminados do que os veículos que trafegam pelo
período da tarde, IC 95% 18,5 – 26,9 e IC 95% 10,2 – 17,7 para manhã e
tarde respectivamente. Visto que a limpeza dos veículos é realizada durante

59
a madrugada (às 5 horas da manhã), horário em que os veículos iniciam a
rota, acreditamos que esse resultado seja consequência das variações da
intensidade do fluxo de pessoas durante o dia, apesar de não possuir os
dados sobre a quantidade de passageiros que circulam nos veículos durante
cada período.
As coletas pela manhã foram realizadas das 9 às 11 horas, logo após
um período de excessivo movimento no transporte coletivo. As coletas no
período da tarde foram realizadas das 14 às 17 horas após o período de
almoço e antes do horário de maior fluxo, que é das 17 às 19 horas.
Acreditamos que quanto maior o número de pessoas que utilizam os
veículos, maior é a troca microbiana entre as mãos e os fômites. Isso
potencializa a disseminação de micro-organismos e aumenta o nível de
contaminação das superfícies.
O patógeno em estudo tem grande reconhecimento atribuído pela
sua capacidade de rápida adaptação à pressão seletiva pelo uso dos
antimicrobianos. Pelos nossos resultados, podemos notar que os S. aureus
isolados possuem elevado nível de resistência antimicrobiana, uma vez que,
98,0% dos isolados (148/151) foram resistentes à pelo menos um dos
antibióticos testados. O antibiótico mais eficiente contra as cepas testadas
foi a mupirocina, já que nenhum isolado apresentou resistência, seguido pela
cefoxitina, rifampicina e sulfametoxazol-trimetoprim.
A mupirocina é um antibiótico de uso tópico utilizado em casos de
infecções superficiais de pele e na erradicação e tratamento de MRSA.Alto
nível de resistência à mupirocina tem sido encontrado em cepas
provenientes de instituições de saúde que frequentemente fazem uso desse
antibiótico e em cepas MRSA (Coates et al. 2009). Esse fato pode explicar
porque não foi possível detectar a presença de cepas resistentes nesta
investigação, pois os isolados são provenientes do ambiente comunitário e é
provável que esse antibiótico não seja frequentemente utilizado pela
população geral na cidade de Goiânia.
Os antibióticos menos efetivos contra os S. aureus isolados foram a
eritromicina e a penicilina. Resistência à penicilina é desenvolvida pela
produção de enzimas inativadoras do anel -lactâmico, as -lactamases,
codificadas geneticamente em plasmídeos transmissíveis por conjugação. A

60
taxa de resistência é alta em isolados de origem comunitária e hospitalar. No
Brasil, acima de 80,0% dos S. aureus apresentam resistência a este
antimicrobiano (Tavares 2000; Santos et al. 2007), como confirmado neste
estudo.
Resistência à eritromicina foi detectada na grande maioria das
cepas. Aproximadamente 87,0% dos isolados resistentes à eritromicina
apresentaram o fenótipo iMLSB. Resistência à eritromicina muitas vezes é
utilizada como marcador de resistência à clindamicina, uma vez que a
prevalência da resistência induzível entre cepas eritromicina-resistentes é
bastante elevada, chegando a 80,0% (Hatkar et al. 2014).
A resistência à clindamicina é variável de acordo com a área
geográfica. Essa variabilidade é usualmente associada com a inconsistência
no uso da eritromicina em diferentes instituições e a origem do isolado
(nosocomial, de infecções relacionadas à assistência à saúde ou
comunitárias) (Coutinho et al. 2010).
No Brasil é possível observar a variabilidade da prevalência dos
fenótipos constitutivo e induzível. Fernandes et al. (2012) em uma
investigação da contaminação em superfícies de ônibus do transporte
público não encontraram o fenótipo iMLSB ou cMLSB entre os isolados de
ECNs. Um estudo realizado por Amorim et al. (2009) na cidade de Marília
(SP), encontrou prevalência de iMLSBem 6,7% dos isolados clínicos de S.
aureus e de 4,6% entre os isolados clínicos identificados como MRSA. Em
concordância ao nosso estudo, Amorim e colaboradores encontraram
prevalência do fenótipo cMLSB em 25,0% dos isolados, a prevalência desse
fenótipo entre MRSA também foi elevada, de 79,0%, enquanto que no
presente estudo foi menor, 25,0% (1/4).
Bottega et al. (2014) em um levantamento realizado em Santa Maria
(RS), encontraram prevalência dos fenótipos iMLSB e cMLSB entre S. aureus
isolados de pacientes de um hospital terciário de 7,9% e 17,9%
respectivamente. A prevalência do fenótipo induzível entre isolados MRSA
foi semelhante à prevalência entre S. aureus em geral, de 10,0% (n=3),
enquanto que o fenótipo cMLSB entre MRSA foi de aproximadamente 70,0%,
diferente da prevalência do presente estudo.

61
 Opondo-se a todos esses resultados, nossos achados revelam que a
prevalência do fenótipo iMLSB entre isolados ambientais de S. aureus na
cidade de Goiânia é elevada (41,0%). Entretanto, a resistência constitutiva
foi encontrada em frequência similar a alguns estudos citados. Esses
resultados são mais uma vezindicativos de que cepas altamente resistentes
estão inseridas no ambiente comunitário.
As diferenças das taxas de prevalência, em comparação aos demais
estudos, comprovam a variabilidade do fenótipo entre regiões geográficas.
A origem dos isolados também contribui para a irregularidade das taxas
encontradas, uma vez que, os isolados doambiente comunitário
apresentaram maior taxa do fenótipo iMLSB em comparação aos isolados
clínicos dos estudos citados.
A clindamicina é uma frequente escolha para algumas infecções
estafilocócicas devido às suas excelentes propriedades farmacocinéticas. É
utilizadaespecialmente em infecções de pele e tecidos moles, além de ser
uma alternativa para pacientes alérgicos à penicilina (Fiebelkorn et al. 2003).
Têm-se relatado falência clínica da clindamicina durante antibioticoterapia
em infecções estafilocócicas com resistência MLS induzível, indicando que o
fato não é incomum e que este fenótipo pode limitar a efetividade da droga
(Siberry et al. 2003). Portanto, o teste para detecção da resistência induzível
(teste D) deve ser rotineiramente realizado, ainda mais por se tratar de um
teste simples e barato, e que pode guiar a escolha da melhor
antibioticoterapia contra cepas multirresistentes (Fiebelkorn et al 2003;
Prabhu et al. 2011).
Entre os isolados resistentes à penicilina, seis também foram
resistentes à cefoxitina. Quando submetidos à PCR para detecção do gene
mecA, confirmou-se que 4 isolados (0,5%; 4/852) eram MRSA.
Adicionalmente, todos os MRSA foram multirresistentes.
Apesar de a cefoxitina ser o antibiótico utilizado para triagem de
MRSA pode ocorrer casos em que cepas se mostram resistentes a esse
antimicrobiano no antibiograma, porém são negativas para o gene mecA.
Esse fato pode ocorrer devido à modificação de genes que codificam as
PBPs normais ou da superprodução de beta-lactamases pelos S. aureus
(Chambers 1997).

62
 Existe também um homólogo do gene mecA que fornece o fenótipo
de resistência aos -lactâmicos. Esse homólogo, inicialmente denominado
como mecALGA251, foi primeiramente identificado por sequenciamento
completo do genoma de uma cepa de S. aureus isolada na Inglaterra
(García-Álvarez et al. 2011). O novo gene mostrou possuir 70,0% de
homologia de DNA com o mecA convencional e codificou uma PBP2a com
63,0% de identidade, em nível de aminoácidos, com a PBP codificada pelo
mecA (García-Álvarez et al. 2011; Petersen et al. 2012). O mecALGA251 foi
mais tarde denominado como mecC e é responsável pela resistência aos -
lactâmicos em muitas cepas mecA negativas (Paterson et al. 2014).
Estudos que relatam a prevalência de cepas MRSA em ambientes
não hospitalares são escassos, os poucos conhecidos mostram que a
grande heterogeneidade de prevalência pode ser explicada pela
variabilidade entre regiões geográficas, mas também pode ser atribuída ao
método de amostragem. Não há um método padronizado para coleta de
amostras nesses tipos de superfícies, o que pode subestimar a prevalência
de S. aureus e limitar a comparabilidade dos dados (Stepanović et al. β008,
Otter & French 2009).
Stepanović et al. (β008) exploraram a ocorrência de estafilococos
resistentes à meticilina no sistema de transporte público urbano de Belgrado
na Sérvia, área urbana mais densamente povoada do país. As amostras
foram coletadas dos corrimãos dos veículos de transporte (ônibus elétricos,
bondes e ônibus) seguindo uma metodologia semelhante à que conduzimos
no nosso estudo, porém com mais amostras coletadas por veículos.A
prevalência de estafilococos resistentes à meticilina foi de 30,0% e foram
isolados de todos os veículos estudados. Entretanto, todos os isolados
resistentes eram de estafilocococos coagulase negativa (ECN), nenhum
MRSA foi encontrado. Em concordância, Otter e French (2009) investigaram
a contaminação bacteriana do sistema de transporte público e de áreas
públicas de um hospital de Londres no Reino Unido. Apesar de encontrarem
contaminação em 95,0% das superfícies analisadas, MRSA não foi
recuperado de nenhuma das amostras coletadas.
Os resultados encontrados por Stepanović e colaboradores são de
importância, pois reforçam a ideia de que ECN resistentes à meticilina

63
inseridos no ambiente podem ser reservatórios significantes de genes de
resistência para outras bactérias, como o S. aureus. O gene mecA,
responsável pela resistência à metilicina, é virtualmente idêntico em S.
aureus e ECNs, existindo fortes evidências de que o gene mecA pode ser
transferido horizontalmente de ECNs para S. aureus (Archer & Niemeyer
1994, Wielders et al. 2001).
Simões et al. (2011) realizando um levantamento da contaminação
por MRSA em superfícies de ônibus públicos da Cidade do Porto, em
Portugal, encontraram prevalência de contaminação muito maior que a do
presente estudo, aproximadamente 26,0% dos ônibus analisados estavam
contaminados. Em um estudo posterior realizado na cidade de Lisboa,
observou-se prevalência de contaminação em 36,0% dos ônibus (Conceição
et al. 2013). No mais recente estudo realizado em Portugal foi encontrado
uma prevalência de MRSA de 16,1% em ônibus e 8,9% em trens, não
havendo diferença estatística entre os tipos de veículos de transporte
estudados (Mendes et al. 2015).
Em contraste, nossa investigação constatou prevalência de 0,5% de
MRSA isolados das barras fixas dos ônibus e das catracas das plataformas
e terminais da Linha Leste-Oeste. A grande diferença de prevalência
encontrada entre os estudos pode ser reflexo de diversos fatores, como a
metodologia de amostragem, o tamanho da amostra, frequência com que os
ônibus são higienizados e da própria população.
A literatura existente é inconsistente e incompleta a respeito de um
método ótimo para detectar S. aureus de superfícies ambientais. Não existe
uma metodologia padronizada para realização de coleta em superfícies
inanimadas (Hogan et al. 2015). Os trabalhos citados usaram técnicas
diferentes para coleta de amostras, o que pode refletir no resultado obtido.
Quanto ao fator da população, Portugal, por exemplo, apresenta uma das
maiores taxas de colonização por MRSA da Europa e a grande prevalência
encontrada nos ônibus pode ser explicada como reflexo da colonização
populacional (Simões et al. 2011; Conceição et al. 2013).
Em mais um estudo sobre contaminação em veículos de transporte
público, Lutz et al. (2014) avaliaram 237 superfícies de contato em 40 ônibus
do transporte público coletivo dos Estado Unidos, observando contaminação

64
por MRSA em 15,0% das superfícies analisadas, que correspondia a 63,0%
dos ônibus. Nesse estudo, variáveis como a rota dos ônibus (quando servem
a uma ou múltiplas rotas), abastecendo hospitais ou não e com maior ou
menor número de passageiros, não tiveram interferência significante no
número de MRSA isolados.
A prevalência de MRSA encontrada no presente estudopode ter sido
reflexo da própria prevalência de colonização da população usuária do
transporte coletivo. Pouco é conhecido sobre a taxa de colonização por
MRSA no Brasil. Os dados registrados mostram que há variabilidade entre
as taxas de colonização, que em geral, não são elevadas.
Ribeiro et al. (2005b) analisando a colonização de 600 pacientes
atendidos na sala de emergência de um hospital em Brasília, encontraram
uma taxa de prevalência de MRSA de apenas 0,7%. Lamaro-Cardoso et al.
(2009) conduzindo uma investigação na cidade de Goiânia relataram
prevalência de colonização por MRSA de 1,2% entre crianças de 2 a 5 anos
atendidas em creches da cidade. Em concordância, Santos et al. (2010) em
um estudo sobre a prevalência da colonização por MRSA em pacientes
admitidos no Hospital das Clínicas de Porto Alegre, encontraram uma taxa
de colonização entre pacientes pediátricos de 1,7% e de 5,4% entre
adultos.Essa alta taxa de prevalência pode ser consequência de viés, alguns
pacientes tinham fatores de risco para colonização por MRSA, como
hospitalização no ano prévio. Em vista disso, o conhecimento da colonização
da população em geral é um dado importante, havendo necessidade de
investigações adicionais nessa área.
Além da resistência antimicrobiana, outros fatores importantes são
associados à virulência e patogenicidade dos S. aureus. Apesarde que essa
bactéria seja considerada um patógeno oportunista, é possível que certos
isolados sejam mais propensos a causar doença invasiva que outros. Isso
ocorre devido à presença de fatores que aumentam a chance de ganhar
acesso a sítios corporais que normalmente são estéreis (Feil et al. 2003).
Um importante fator de virulência comumente pesquisado em S.
aureus é a PVL, muito estudada pela sua toxicidade, pois a patogenicidade
de certas cepas está associada à produção dessa toxina. Acredita-se que
genes codificadores da PVL estejam presentes em menos de 5,0% dos S.

65
aureus, sendo conservados em diversas linhagens de MSSA e MRSA.
Contudo, tem-se relatado que CA-MRSA carreiam o gene para codificação
da PVL com maior frequência (Lina et al. 1999; David & Daum 2010).
Nenhum outro fator de virulência tem sido tão fortemente associado
às cepas CA-MRSA quanto o PVL, raramente encontrado em MRSA com
SCCmec dos tipos I, II e III (David & Daum 2010). Em nosso estudo, a
prevalência do gene lukS-F em isolados de S. aureus foi de 6,0% e entre os
isolados de MRSA foi de 25,0% (1/4). Todos os isolados PVL+ estavam
presentes em superfícies avaliadas nos ônibus, nenhum foi recuperado de
terminal ou plataforma. Dois isolados PVL+ eram provenientes do mesmo
ônibus, porém foram recuperados de diferentes pontos de coleta.
Nos Estados Unidos, desde 1990,isolados carreando gene para PVL
têm sido associados a infecções provocadas por cepas CA-MRSA em
numerosos estudos epidemiológicos. Aproximadamente 60,0 a 100,0%
dessas cepas apresentam este gene (David & Daum 2010). Por exemplo, no
ano de 2000 um estudo em Minnesota encontrou que 77,0% das infecções
causadas por CA-MRSA foram associadas com cepas PVL+, mas somente
4,0% dos HA-MRSA foram PVL+ (Naimi et al. 2003). A presença de PVL
entre cepas MRSA pode facilitar a sua disseminação pela sua habilidade de
provocar infecções primárias de pele (Berglund et al 2008).
Lamaro-Cardoso et al. (2009) em um estudo sobre colonização em
crianças na cidade de Goiânia não encontraram a presença de PVL em
nenhuma cepa MRSA. Como indicado por diversos estudos, o gene PVL
parece ser mais comum entre isolados que causam infecção clínica aparente
do que entre isolados causando colonização assintomática (David & Daum
2010; de Souza et al. 2016).
Em uma investigação realizada em um país da América do Sul,
Pardo et al. (2013) encontraram uma taxa de isolados PVL+ muito acima da
revelada por nosso estudo e também encontrou relação significativa entre
PVL eMSSA e MRSA. A prevalência de PVL+ entre MSSA foi de
aproximadamente 28,0%, enquanto que entre cepas CA-MRSA foi de
86,0%, PVL não foi encontrado entre cepas HA-MRSA. Bettin et al (2012)
em um levantamento sobre a prevalência S. aureus em estudantes de
medicina confirmaram a presença dos genes PVL entre os isolados de

66
MSSA, em 4,2% dos isolados, enquanto 83,3% das amostras de MRSA
encontradas carreavam esse gene. Após a tipagem desses MRSA observou-
se que todas as cepas PVL+ carreavam o SCCmecIV, confirmando mais
uma vez que as cepas CA-MRSA carreiam esses genes com mais
regularidade que as cepas MSSA.
Além da PVL o S. aureus também produz as chamadas
enterotoxinas estafilocócicas (SEs), o que torna esse patógeno uma das
principais causas de doenças transmitidas por alimentos (DTA). No Brasil,
de 2000 a 2014 foram detectados 9719 surtos de DTA, cerca de 193 mil
pessoas ficaram doentes, o S. aureus foi o segundo principal agente
etiológico envolvido, sendo causa de 9,2% (cerca de 897) dos episódios de
intoxicação alimentar estafilocócica (SFP Staphylococcal Food Poisoning),
sendo que 51,3% das doenças tiveram agente etiológico desconhecido
(Brasil 2014). Nos EUA, de acordo com dados estimados pelo CDC (Centers
for Disease Control and Prevention), o S. aureus é responsável por mais de
240 mil casos de intoxicação alimentar anualmente (Scallan et al. 2011).
A fonte mais importante de S. aureus para os alimentos é
considerada o próprio manipulador. A transmissão de bactérias do
manipulador para o alimento ocorre quando há poucos critérios de higiene
em prática no momento da manipulação, além disso, a ocorrência de surtos
está relacionada ao armazenamento dos alimentos em temperaturas
inadequadas, o que propicia a multiplicação do S. aureus e a produção de
SEs (Argudín et al. 2010a, Ho et al. 2015, da Silva et al. 2015). O presente
estudo detectou 24 cepas enterotoxigênicas no sistema de transporte
público. Tais cepas quando em contato com a pele de qualquer manipulador
de alimentos podem ser transmitidas aos alimentos que ao serem ingeridos
podem provocar episódios de SFP.
O S. aureus também pode estar presente no ambiente, sendo que
as superfícies ambientais e o manipulador podem ser reservatórios dessa
bactéria. Pesquisadores sugerem que a antissepsia regular das mãos deve
ser inserida na rotina para complementar a desinfecção ambiental efetiva
(Ho et al. 2015).
Sobre contaminação de superfícies De Mello et al. (2014) realizaram
um estudo avaliando a qualidade sanitária em serviços de alimentos na

67
cidade de Porto Alegre-RS fazendo levantamento da contaminação por
bactérias em superfícies, equipamentos, alimentos, além das mãos e
cavidade nasal de manipuladores de alimentos. O estudo demonstrou que
superfícies e equipamentos podem estar contaminados com cepas de
estafilococos coagulase positivos e ECNs possuindo genes para
enterotoxinas, e que portadores podem ser fonte de disseminação dessas
bactérias nesses ambientes.
Hait et al. (2014b) investigando episódios de surtos de intoxicação
alimentar encontraram S. aureus enterotoxigênicos em ambientes
relacionados a alimentos. Os investigadores presumiram que os episódios
de SFP estavam relacionados à persistência de cepas potencialmente
patogênicas no ambiente em associação as falhas na manutenção de boas
práticas de fabricação, como o armazenamento e higiene adequada dos
alimentos, equipamentos e superfícies. Nesse relato, a prevalência de cepas
enterotoxigênicas entre os S. aureus foi bem maior à descrita neste estudo,
chegando próximo de 50,0%, sendo que a enterotoxina mais prevalente foi a
SEA. Em nosso estudo a SEB apresentou-se mais prevalente. A SEE não foi
detectada pelo estudo de Hait, assim como no presente estudo.
A maioria dos estudos a respeito do perfil enterotoxigênico de S.
aureus é realizada em amostras de origem alimentar. No Brasil, no estado
do Rio Grande do Sul, nos anos de 2000 a 2002, S. aureus foi importante
agente de intoxicação alimentar de acordo com dados fornecidos pelos
serviços de vigilância sanitária (Lima et al. 2013).
Pesquisadores têm detectado cepas enterotoxigênicas de
Staphylococcus sp. principalmente em leite e derivados, produtos populares
e considerados importantes causas de SFP no país (André et al. 2008).
Nunes et al. (2016), encontraram elevada prevalência de cepas de ECN
enterotoxigênicas em queijo minas frescal comercializado no sudeste do
país. As SEs mais prevalentes foram SEA e SEB, com incidência de 90 e
70,0% respectivamente. Arcuri e colaboradores pesquisaram o perfil
toxigênico de S. aureus isolados de leite bovino cru e queijo minas frescal e
encontraram contaminação por cepas enterotoxigênicas em 37,0% dos
isolados (Arcuri et al. 2010). Outros pesquisadores também descrevem a

68
presença de cepas com potencial enterotoxigênico em leite de cabra (Lyra et
al. 2013; Salaberry et al. 2015).
As toxinas exfoliativas foram encontradas em menor prevalência que
as SEs, cerca de 3,3% das amostras foram eta positivas e 1,3% foram etb
positiva. Muitos estudos mostram a detecção dessas toxinas em cepas
MRSA. Em geral elas são menos disseminadas entre os S. aureus do que as
SEs (Rodrigues et al. 2012; de Souza et al. 2016), como confirmado pelo
presente estudo. A prevalência dessas toxinas entre estudos também é
variável, a origem dos isolados na maioria das vezes é de pacientes com
colonização assintomática ou infecção.
De Souza et al. (2016) analisando o perfil toxigênico de S. aureus
isolados de grupos especiais do estado de São Paulo detectaram a
presença do gene eta em frequência semelhante ao presente estudo (3,0%),
não encontrando o gene etb. Rodrigues et al (2012) analisando isolados
clínicos (isolados de infecções) e isolados de vigilância (culturas de rotina
no momento da admissão) de um hospital universitário de Botucatu-SP
encontrarametb em uma frequência de 9,5% em isolados clínicos e 1,8% em
culturas de vigilância. Essa diferença foi estatisticamente significante
levando a inferir que isolados etb+ são mais invasivos que isolados etb_.
Nesse estudo, o gene eta foi encontrado em menor frequência que o gene
etb (1,0%), diferente do presente estudo, onde o gene eta foi mais
prevalente.
O gene tst também foi detectado nos estudos de Rodrigues et al.
(2012) e de Souza et al. (2016). De Souza e colaboradores detectaram esse
gene apenas em isolados de detentos com colonização assintomática e em
uma frequência superior ao presente estudo (10,4%). Já Rodrigues e
colaboradores encontraram o gene tst em frequência superior ao presente
estudo e ao estudo de de Souza et al. (ambos realizados com amostras da
mesma cidade), 22,6% em isolados clínicos e 12,4% em isolados de
vigilância, números estatisticamente diferentes, mostrando novamente
associação de tst a isolados invasivos. A diferença de prevalência do gene
tst encontrada nos dois estudos se deve à diferença dos grupos estudados,
mostrando que pode haver dominância de certas cepas em diferentes
grupos.

69
 O gene hlb foi detectado em nosso estudo em uma frequência de
7,3% sendo uma das toxinas mais prevalentes juntamente com o seb.
Alguns pesquisadores sugerem que essa toxina tem importante papel na
colonização da pele devido sua ação sob os queratinócitos (Katayama et al.
2013). Praticamente todas as cepas de S. aureus possuem o gene para HLB
e são citotóxicas para células humanas, entretanto existe um bacteriófago
chamado φSaγ que inativa o hlb na maioria dos grupos clonais ao se inserir
no gene. Por esse motivo, a maioria das cepas é reportada como hlb
negativa, por possui o gene inativado pelo bacteriófago (Katayma et al.
2013; Salgado-Pabón et al. 2014).
Os 151 isolados aos serem submetidos aos PFGE foram distribuídos
em diversos clusters, entretanto, quarenta e sete amostras não puderam ser
tipadas pela técnica utilizando a enzima de restrição SmaI.
Diversos pesquisadores têm descrito cepas de S. aureus não
tipáveis pela metodologia padrão usando SmaI. A grande maioria desses S.
aureus tem origem em suínos, bovinos e pessoas em contato constante com
esses animais normalmente dispostos em fazendas ou granjas (Agnoletti et
al. 2014; Li et al. 2015). Essas cepas são classificadas pelo MLST como
ST398 e possuem uma região de metilação no DNA no sítio de ação da
enzima, impedindo que ela clive normalmente a molécula. MSSA e MRSA
ST398 são tipadas por outras enzimas de restrição, como a ApaI, ou com
neoesquisômeros da SmaI como a XmaI e Crf9I (Argudín et al. 2010b;
Bosch et al. 2010).
No presente estudo a caracterização dessas amostras com
neoquisômeros da SmaI é tratada como perspectiva futura, além da
realização da tipagem por spa typing e MLST.
Os isolados caracterizados pelo PFGE foram classificados em
diversos clusters, não havendo predominância de clones específicos. Esse
resultado era previsto, uma vez que vários padrões de restrição demonstram
diferentes origens genéticas. Em um ambiente comunitário onde existe
intensa circulação de pessoas há também acentuada troca microbiana entre
as superfícies componentes do sistema de transporte público e a peledos
passageiros, especialmente a das mãos. Como a heterogeneidade de

70
passageiros é vasta espera-se que a pluralidade das cepas encontradas
também a seja.
Entretanto, houve a presença de isolados geneticamente iguais ou
estritamente relacionados em diversas superfícies e variados ônibus, o que
mostra que há disseminação dessas cepas ao longo da linha. A partir
desses resultados é possível relacionar uma cadeia de transmissão que
envolve não somente as superfícies do transporte coletivo e os passageiros,
mas também outros inúmeros lugares por onde o novo portador da bactéria
trafegar (David & Daum 2010; Iwao et al. 2012; Mendes et al. 2015). A
cadeia de transmissão pode incluir a própria residência, o trabalho, escolas,
creches, hospitais, além de crianças, idosos, pessoas com saúde debilitada,
animais de estimação e alimentos. Destacando a importância dos ônibus
como fômites.
Apesar de não ter havido predominância de clones, alguns clusters
se destacaram pelo tamanho e pelo perfil de virulência. Os clusters H, V e
AE, com 10, 9 e 9 isolados respectivamente, se destacaram por serem os
maiores da análise. Os que receberam destaque pelo perfil de virulência
foram os clusters E, onde 100% dos isolados carrearam o gene seb, além de
ter sido o único cluster com isolados etb+; o cluster H, com 60,0% dos
isolados apresentando o gene tst; o cluster Q, com três isolados com perfil
de virulência idêntico e apresentando os genes seb, seh e hlb bem
distribuídos dentro do cluster e o cluster AC com 3 isolados (o cluster possui
apenas 4) carreando o gene para PVL. O demais cluster parecem não ter
associação com os fatores de virulência pesquisados.
A PVL e as ETs são codificadas em fagos (malachowa & DeLeo
2010), isso pode explicar porque os genes lukS-F e eta estão melhor
distribuídos entre os clusters do que algumas enterotoxinas ou o gene tst. O
tst e o hlb são genes cromossomais, portanto transferidos de forma vertical,
em vista disso, podem estar mais associados à algumas linhagens do que a
outras, isso pode explicar porque são mais prevalente nos clusters H e Q,
respectivamente, do que nos demais. Alguns MGEs são claramente
ausentes em algumas linhagens provavelmente devido algum mecanismo
que restringe a transferência horizontal (Kuroda et al. 2001). No presente

71
estudo 71,5% das amostras não apresentaram nenhum fator de virulência
pesquisado.
As SEs possuem fontes genéticas variadas (Alibayov et al. 2014b).
O gene sea pode ser transferido por meio de fagos podendo ser mais
distribuído entre as linhagens. O gene seb está presente em ilhas de
patogenicidade e plasmídeos, sendo transferido de forma horizontal e
vertical. O gene sec não foi associado a nenhum cluster no presente estudo,
entretanto encontra-se em ilhas de patogenicidade podendo ser transferido
de forma vertical e horizontal, com a ajuda de fagos. O gene seh é
encontrado em transposons podendo ser transferido de forma vertical ou
horizontal e estar associado a linhagens genéticas.
A transferência de genes que codificam toxinas contidos em MGEs
entre cepas de S. aureus ocorre, resultando em diferentes combinações de
toxinas (Xie et al. 2011). Esse fenômeno de transferência cria a possibilidade
de gerar cepas cada vez mais patogênicas inseridas no ambiente, que pode
resultar em problemas de saúde pública além de diminuir a segurança
alimentar devido à disseminação e inserção de cepas em ambientes de
manipulação de alimentos (Hait et al. 2014b).
Uma descoberta surpreendente deste estudo foi a presença de
cepas MRSA geneticamente relacionadas às cepas USA300 e clone
pediátrico (USA800), que são clones mundialmente disseminados e
conhecidas causas de infecções
O USA300 é uma importante cepa reconhecida primeiramente nos
EUA, onde se tornou a principal causa de infecções por CA-MRSA nos anos
2000 e com altas taxas de morbidade e mortalidade. Porém com o passar do
tempo, começou a ser detectada em ambientes nosocomiais não sendo
mais restrita ao ambiente comunitário, se tornando causa comum de
infecções por HA-MRSA nos Estados Unidos (David & Daum; Carrel et al.
2015).
O USA300 se disseminou por diversas localidades e tem sido
descrito em países de todos os continentes (Glaser et al. 2016). Porém, no
Brasil, Austrália e Ásia Oriental, ao contrário do que ocorre nos EUA, ele é
raramente encontrado. Acredita-se que nesses locais, possam existir outros
clones predominantemente disseminados, como no Brasil onde o BEC,

72
citado anteriormente, é comumente isolado em hospitais de diversas regiões
(Rossi 2011; Ferreira et al. 2014).
A cepa USA300 tem sido extensivamente estudada em relação à
resistência e virulência. Entre as características relevantes associadas a
essa cepa estão a suscetibilidade diminuída a diversos antimicrobianos,
possuir SCCmec tipo IV, apresentar gene para PVL e, na maioria das vezes,
o ACME (Arginine Catabolic Element), elemento associado à patogênese,
pois confere às cepas CA-MRSA melhor habilidade de colonizar a pele de
pessoas saudáveis, sendo por isso mais facilmente disseminada (Thurlow et
al. 2012). Com exceção do ACME, pois aqui não foi objetivo do estudo, os
outros elementos característicos do USA300 foram encontrados da cepa
1046BV2, fortalecendo o resultado da associação encontrada no
dendrograma.
Entre os raros relatos de USA300 no Brasil está o estudo de Ribeiro
et al. (2007), que descreve a presença de uma cepa associada ao USA300
em um hospital de Porto Alegre. Schuenck et al. (2009) relataram o primeiro
caso de infecção por uma cepa relacionada ao USA300 na cidade de Rio de
Janeiro, a cepa foi isolada de um turista americano com infecção cutânea, o
que mostra uma possível rota da inserção dessas cepas no país. Gelatti et
al. (2013) também relataram casos de infecções de pele adquiridas na
comunidade causadas por cepas relacionadas ao USA300 e OSPC
(SCCmecIV-ST30), mais uma vez em Porto Alegre.
Na cidade de Goiânia, em 2014, Vieira e colaboradores publicaram
um levantamento da colonização nasal da população pediátrica de neonatos
e crianças atendidas em um importante hospital. A maioria dos isolados
foram relacionados a dois clones pandêmicos de MRSA, o Clone Pediátrico
(USA800) (SCCmecIV-ST5) e Clone endêmico brasileiro (SCCmecIII-
ST239). CA-MRSA foram isolados de pacientes ambulatoriais e foram
relacionados ao Clone Australiano Ocidental (SCCmecIV-ST128). Nenhuma
-
cepa estava relacionada ao USA300 e todos os MRSA foram PVL (Vieira et

al. 2014).
No presente estudo houve a detecção de uma cepa relacionada ao
USA800. Essa cepa tem provável origem nos hospitais pediátricos

73
portugueses. Acredita-se que um MSSA tenha adquirido o SCCmec tipo IV
de um HA-MRSA, dando origem ao Clone Pediátrico em hospitais de
Portugal (Aires-de-Sousa et al. 2005). No entanto, o USA800 tem se
disseminado, sendo relatado em diversos países (Boyle-Vavra et al. 2011;
Faccone et al. 2014; Pereira et al. 2014).
O estudo de Vieira et al. (2014) foi o primeiro a relatar o USA800 no
Brasil central, essa cepa habibualmente associada a infecções hospitalares
é mais noticiada no sudeste do país. A origem do isolado foi de uma criança
oriunda da comunidade, atendida no ambulatório sem antes ter sido exposta
aos fatores de risco para infecções nosocomiais, que é evidência da
disseminação desse clone dentro da comunidade, mais uma vez
comprovada pelo corrente estudo.
Cepas relacionadas ao clone pediátrico são muito heterogêneas
quanto ao perfil de suscetibilidade e virulência. Têm-se relatado cepas
USA800 com fenótipo iMLSB e cepas sem esse fenótipo; cepas PVL+ e PVL-
e apresentando demais determinantes de virulência de forma variada (Lin et
al. 2011; Boyle-Vavra et al. 2011; Faccone et al. 2014; Curry et al. 2016). No
presente estudo a cepa 1083BH1, relacionada ao USA800, não apresentou
nenhum gene de virulência pesquisado, porém apresentou resistência à
clindamicina e eritromicina, além dos -lactâmicos.
No Brasil, cepas de USA800 têm sido detectadas em alguns
hospitais. Existem mais relatos de infecções associadas ao clone pediátrico
do que associadas ao USA300 no país. De Miranda et al. (2007) detectaram
cepas relacionadas ao USA800 em isolados de pacientes de um hospital
geral de Recife-PE e de um hospital pediátrico do Rio de Janeiro-RJ. Sousa-
Júnior et al. (2009) observaram a presença dessas cepas na cidade de
Natal-RN, nordeste brasileiro. Também no Rio de Janeiro pesquisadores
detectaram a emergência de cepas com o mesmo background genético do
USA800 em hospitais da cidade (Caboclo et al. 2013, Cavalcante et al.
2014).
Sobre avaliação da contaminação das superfícies de veículos de
transporte, os estudos realizados em Portugal mostraram a predominância
do clone EMRSA-15 (SCCmecIVh-ST22) (Simões et al. 2011; Conceição et
al. 2013; Mendes et al. 2015). Clone amplamente disseminado nos hospitais

74
portugueses, relatado em pessoas saudáveis e como importante causa de
infecções de pele e tecidos moles na comunidade (Tavares et al. 2013).
Em semelhança ao presente estudo, Simões et al. (2011) também
encontraram a presença de cepas relacionadas ao clone pediátrico, porém
em uma prevalência maior (6,0%; n=3), e dois isolados (4,0%) com
SCCmecIV-ST8 que apresenta o mesmo backgroung genético do USA300,
-
porém PVL . Conceição et al. (2013) observaram a presença de cepas

relacionadas ao USA300 em uma frequência maior do que a descrita no

presente estudo (26,0%; n=19) e foi o segundo clone mais isolado durante o
levantamento. Em 2015, Mendes e colaboradores também detectaram cepas
relacionadas ao clone pediátrico em 13,8% dos MRSA (n=4) como segunda
principal causa de contaminação por S. aureus em ônibus públicos e trens
de Portugal (Mendes et al. 2015).
Iwao e colaboradores avaliando a contaminação dos trens de metrô
nas cidades de Tokyo e Niigata no Japão encontraram contaminação por
MRSA em 2,3% dos trens analisados (8 isolados). Dois isolados foram
relacionados ao clone mais prevalente no Japão (clone NY/J – New
York/Japan clone) (SCCmecII-ST5), porém, os isolados mais prevalentes
foram SCCmecIV-ST8 (relacionados ao USA300) (Iwao et al. 2012). Lutz et
al. (2014) encontraram grande número de cepas (n=19) relacionadas ao
USA300 em ônibus dos Estados Unidos, resultado esperado, uma vez que é
a cepa mais disseminada no país, com elevada prevalência.
Este é o primeiro estudo que relata o isolamento de cepa MRSA com
SCCmectipo I na região. Os estudos anteriores de Lamaro-Cardoso et al. e
Vieira et al. juntamente com o presente estudo demonstram que a população
de cepas MRSA inseridas na comunidade e hospitais de Goiânia está se
diversificando. É possível que novas cepas estejam sendo inseridas na
interface entre hospitais e comunidade.
O que podemosdizer a respeito, é que essas são cepas
multirresistentes com SCCmec característico de cepas hospitalares
(SCCmecI). O isolado PGHHE4 foi recuperado de uma plataforma
estabelecida em uma região onde existem pelo menos quatro hospitais
localizados nas proximidades da linha Leste-Oeste, portanto a

75
movimentação de funcionários, pacientes, visitantes desses hospitais nessa
plataforma em especial, é grande. Esse fator pode ser correlacionado com a
disseminação de cepas HA-MRSA na comunidade.
A caracterização genotípica por spa typing e MLST são
perspectivas futuras do nosso estudo, pois a partir desses métodos
poderemos associar essas cepas com clones circulantes no país e no
mundo ou identificá-las como novas cepas ou linhagens emergentes na
cidade.
Por fim, no presente estudo foi encontrada uma heterogeneidade de
cepas em um ambiente comunitário de grande circulação de pessoas. A
heterogeneidade é referente ao arsenal de fatores de virulência, assim como
a variedade de perfis de resistência apresentados pelos isolados. No campo
de pesquisa sobre S. aureus existe, na atualidade, grande atenção voltada
para cepas MRSA, havendo grande volume de estudos destacando tais
isolados. Entretanto, existem cepas MSSA que são multirresistentes e com
potencial altamente patogênico circulando em diversos ambientes. Esses
isolados muitas vezes são negligenciados pela comunidade científica, que
por vez deixa de reportar e publicar dados sobre essas cepas.
Em nosso estudo apenas um isolado MRSA apresentou algum de tipo
de fator de virulência, enquanto diversos outros fatores estavam distribuídos
entre cepas MSSA. Isso demonstra como cepas MSSA com potencial
patogênico estão inseridas em um ambiente de alta circulação de pessoas, o
que pode facilitar a disseminação e contaminação/colonização.
A população de bactérias inserida na comunidade é muito
heterogênea e vive em constante mudança. Por esse motivo há necessidade
de trabalhos atualizados sobre cepas circulantes em portadores
assintomáticos, sintomáticos, no ambiente da comunidade e em ambientes
hospitalares, para dessa forma estabelecer peculiaridades regionais da
relação entre contaminação ambiental, colonização e infecção, como
também elucidar o nível de disseminação dessas cepas entre esses
ambientes. E enfim, estabelecer o grau de importância das cepas MRSA e
MSSA na colonização e, consequentemente, na infecção em geral.

76
7 CONCLUSÕES

As superfícies de contato com as mãos do sistema de transporte

público coletivo (ônibus, terminais de integração, plataformas e etc) são
potenciais fômites de disseminação de micro-organismos de importância
médica e comunitária.
Os micro-organismos alvos do estudo, Staphylococcus aureus e
Staphylococcus aureus resistentes à meticilina, foram encontrados em alta
prevalência (17,7% e 0,5%, respectivamente).
Alto nível de multirresistência aos antimicrobianos (75,5%) foi
detectado. Essa característica associada ao perfil de virulência, uma vez que
28,5% dos isolados foram toxigênicos, atesta que as superfícies presentes
no sistema de transporte público coletivo do município de Goiânia podem
funcionar como fômites de micro-organismos potencialmente patogênicos.
Os micro-organismos podem estar sendo disseminados pelo ambiente
através do contato dos passageiros com fômites. Na análise de PFGE não
houve predominância de nenhum clone específico, entretanto, detectou-se a
presença de cepas geneticamente iguais ou semelhantes em diversas
superfícies do sistema.
Cepas MRSA estão inseridas no ambiente comunitário. Importantes
clones MRSA foram encontrados. O primeiro relato de USA300 e de cepas
com SCCmec tipo I na região demonstra que novas cepas podem estar
sendo inseridas na cidade.

77
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