Raner

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
CARACTERIZAÇÃO IN SILICO E ANÁLISE DE EXPRESSÃO

DE GENES DO TIPO PR DE CUPUAÇUZEIRO (Theobroma
grandiflorum)
RANER JOSÉ SANTANA SILVA
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Março de 2015

grandiflorum)
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em
Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e

biologia molecular.
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Março de 2015
S586 Silva, Raner José Santana.
Caracterização in silico e análise de expressão de genes do
tipo PR de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) / Raner
José Santana Silva. – Ilhéus : UESC, 2015.
78f. : il.
Orientadora : Fabienne Micheli.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa
Cruz. Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia
Molecular.
. Inclui referências.
1. Cupuaçu – Doenças e pragas. 2. Vassoura-de-bruxa. 2.

I.Michelli, Fabienne. II. Título.
CDD – 634.6

grandiflorum)
Dissertação apresentada à
Universidade Estadual de Santa Cruz,
como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em
Genética e Biologia Molecular.
APROVADA: 18 de março de 2015
Dr. Bruno Andrade Dr. Ronan Xavier Corrêa

UESB UESC
Dra Sara Pereira Menezes Dra Fabienne Micheli

UESC Cirad/UESC - Orientadora
Dedicatória
Dedico este trabalho a toda a minha família e amigos que me apoiaram.
Em especial a minha noiva Lorena, aos meus pais Albertino e Nilda e meus irmãos
Junio, Jander e Maike.
Agradecimentos
À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.

À UESC através do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular.
À EMBRAPA Recursos genéticos e biotecnologia.
À Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira- CEPLAC.
À EMBRAPA Amazônia Oriental.
À Minha orientadora, Dra. Fabienne pela oportunidade e pelos ensinamentos.
À minha co-orientadora Dra. Lucilia pelo apoio e ensinamentos.
Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular.
Aos amigos e colegas de laboratório, figuras imprescindíveis à condução
deste projeto.
ÍNDICE
EXTRATO..................................................................................................................... i
ABSTRACT ................................................................................................................. ii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... iii
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... i
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 3
2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 5
2.1. O cupuaçuzeiro ............................................................................................. 5

2.2. Importância econômica da cultura do cupuaçuzeiro...................................... 6
2.3. Pragas e patógenos da cultura do cupuaçuzeiro: enfoque na doença
vassoura-de-bruxa .................................................................................................. 6
2.4. Aspectos moleculares de M. perniciosa na interação planta patógeno ......... 9
2.5. Mecanismos de defesa em plantas ............................................................. 10
2.5.1 Mecanismos estruturais ............................................................................ 11
2.5.2 Mecanismos bioquímicos .......................................................................... 11
2.6 Imunidade em plantas ..................................................................................... 12
2.7. Proteínas relacionadas à patogênese (PR) .................................................... 13
3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 18
3.1. Análises in silico ............................................................................................. 18

3.1.2 Ontologias gênicas.................................................................................... 18
3.1.3 Predição de estrutura de proteínas e docking ........................................... 19
3.1.4 Desenho de primers para análise de expressão gênica ........................... 19
3.2. Material vegetal .............................................................................................. 22
3.3 Extração de RNA total ..................................................................................... 22
3.3.1 Tratamento com DNAse e síntese de cDNA ............................................. 23
3.3.2 Validação do cDNA ................................................................................... 23
3.4 Teste dos primers ............................................................................................ 24
3.5 Cálculo de eficiência dos primers ................................................................... 24
3.6 Reações de PCR em tempo real ..................................................................... 25
3.7 Escolha dos normalizadores .......................................................................... 25
3.8 Cálculo de expressão relativa ......................................................................... 26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 26
4.1. Análises in silico ............................................................................................. 26

4.1.2 Ontologias gênicas.................................................................................... 31
4.1.3 Predição da estrutura das proteínas ......................................................... 33
4.1.4 Teste de docking ....................................................................................... 48
4.2. ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA ................................................................ 52
4.2.1 Validação do tratamento com DNAse e síntese de cDNA ............................ 52

4.2.2 Teste dos primers dos genes de interesse ................................................... 53
4.2.3 Teste de eficiência dos primers .................................................................... 55
4.2.4 Seleção dos normalizadores ........................................................................ 56
4.2.5 Curva de dissociação ................................................................................... 57
4.2.6. Expressão relativa genótipos Resistente (174) e suscetível (1074) ............ 60
5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 69
6. BIBLIOGRAFIA..................................................................................................... 70
EXTRATO
SILVA, Raner José Santana. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, fevereiro
de 2015. Caracterização in silico e análise de expressão de genes do tipo PR
de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum). Orientadora: Fabienne Micheli
(Cirad/UESC). Co-orientadores: Lucilia Helena Marcellino (Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia) e Rafael Moyses Alves (Embrapa Amazônia Oriental).
O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) é uma frutífera de grande importância na

região norte do Brasil, em especial no estado do Pará, tendo um grande potencial
econômico devido a sua boa aceitação no mercado. A produção do cupuaçu é
ameaçada pela doença da vassoura-de-bruxa causada pelo fungo Moniliophthora
perniciosa. O estudo da relação planta-patógeno (T. grandiflorum - M. perniciosa)
pode revelar dados importantes para a melhor compreensão dos mecanismos de
resistência do cupuaçuzeiro. Dentre os mecanismos de defesa e resistência geral de
plantas, as proteínas relacionadas à patogênese (PR) são frequentemente
encontradas e relacionadas com a resistência contra patógenos em diversas
espécies. Com o objetivo de identificar proteínas do tipo PR envolvidas no
mecanismo de defesa do cupuaçuzeiro, foram selecionadas em um banco de dados
de sequências de mRNA de cupuaçu, sequências que codificam proteínas PR, que
foram caracterizadas como: TgPR1, TgPR3, TgPR5, TgPR8, TgPR10.1, TgPR10.2
e TgPTI5. As proteínas caracterizadas tiveram os seus níveis de expressão
analisados por PCR em tempo real, a partir de amostras de meristemas de
cupuaçuzeiro de dois genótipos (resistente e suscetível) inoculados com o fungo M.
perniciosa, nos períodos de 8h, 4h, 48h e 72h. As proteínas TgPR1, TgPR3, TgPR5
e TgPR8 tiveram um aumento nos seus níveis de expressão no genótipo resistente.
O genótipo suscetível teve uma queda nos níveis de expressão em várias das
proteínas estudadas. Este estudo mostra a diferença dos níveis de expressão de
proteínas PR em genótipos resistentes e suscetíveis, revelando assim uma
participação importante das proteínas PR no mecanismo de resistência de
cupuaçuzeiro contra a vassoura-de-bruxa.
Palavras-chave: Proteínas PR, cupuaçuzeiro, vassoura-de-bruxa, resistência.
i
ABSTRACT
SILVA, Raner José Santana. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, February
of 2015. In silico caracterization and expression analysis of PR genes from
cupuassu (Theobroma grandiflorum). Adviser: Fabienne Micheli (Cirad/UESC).
Co-advisers: Lucilia Helena Marcellino (Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia) and Rafael Moyses Alves (Embrapa Amazônia Oriental).
The cupuaçu (Theobroma grandiflorum) is a fruit of great importance in northern

region of Brazil, especially in the state of Pará, having a great economic potential due
good market acceptance. The production of cupuaçu is threatened by witch's broom
disease caused by p Moniliophthora perniciosa fungus. The study of plant-pathogen
relationship (T. grandiflorum-M. perniciosa) can reveal important data for
understanding of cupuassu resistance mechanisms. Among the defense
mechanisms and general resistance of plants, pathogenesis-related proteins (PR)
are often found associated with resistance against pathogens in several species. In
order to identify PR type proteins involved in cupuassu's defense mechanism were
selected from a database of cupuassu mRNA sequences, sequences encoding PR
proteins, which were characterized as: TgPR1, TgPR3, TgPR5, TgPR8, TgPR10.1,
TgPR10.2 and TgPTI5. Their expression levels was analyzed by real time PCR,
starting from tissue samples from two genotypes of cupuaçu (resistant and
susceptible) inoculated with the fungus M. perniciosa, in periods of 8 h, 4h, 48h and
72h . The TgPR1, TgPR3, TgPR5 and TgPR8 proteins had an increase in their
expression levels in resistant genotype. The susceptible genotypes had a drop in
expression levels in several of the proteins studied. This study shows the difference
in protein expression levels of PR in resistant and susceptible genotypes, thus
revealing an important participation of PR proteins in cupuassu resistance
mechanism against the witch's broom disease.
Keywords: PR proteins, cupuassu, witch’s broom disease, resistance.
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: a) Cupuaçuzeiro, b) flor e c) fruto de cupuaçuzeiro. .................................... 5

Figura 2: Sintomas da doença da vassoura-de-bruxa em cupuaçuzeiro. a) hipertrofia
e formação de brotamentos laterais, b) formação da vassoura-de-bruxa (secas), c)
frutos dismorfos gerados a partir de flores infectadas. ............................................... 8
Figura 3: Rede dos processos metabólicos e proteínas ortólogas envolvidas. ........ 33
Figura 4: Predição da estrutura da proteína TgPR1 a) modelo tridimensional
(cartoon) da proteína TgPR1. b) modelo indicando as regiões com melhor (azul) e
pior (vermelho) nível de energia na estrutura da proteína. c) Gráfico de
Ramachandran com a localização dos Residuos de aminoácidos. .......................... 35
Figura 8: Predição da estrutura da proteína TgPR10.1 a) modelo tridimensional
(cartoon) da proteína TgPR10.1. b) modelo indicando as regiões com melhor (azul) e
Figura 9: Predição da estrutura da proteína TgPR10.2 a) modelo tridimensional
(cartoon) da proteína TgPR10.2. b) modelo indicando as regiões com melhor (azul) e
Figura 10: Predição da estrutura da proteína TgPTI5 a) modelo tridimensional
(cartoon) da proteína TgPTI5. b) modelo indicando as regiões com melhor (azul) e
iii
Figura 11: Modelo cartoon da proteína TgPR5 e seu possível sítio ativo e respectivos
aminoácidos correspondentes. ................................................................................. 48
Figura 12: a) Proteína TgPR5 representada em sua conformação espacial em cinza,
sítio ativo em vermelho e molécula de quitina em amarelo no modo 1 com afinidade
de -6,3 Kcal/mol. b) representação em cartoon da proteína TgPR5 em cinza, sítio
ativo em vermelho e molécula de quitina em amarelo no modo 1 com afinidade de -
6,3 Kcal/mol. c) Proteína TgPR5 representada em sua conformação espacial em
cinza, sítio ativo em vermelho e molécula de quitina em amarelo no modo 2 com
afinidade de -6,3 Kcal/mol b) representação em cartoon da proteína TgPR5 em
afinidade de -6,3 Kcal/mol. ....................................................................................... 49
6,2 Kcal/mol. c) Proteína TgPR5 representada em sua conformação espacial em
afinidade de -6,0 Kcal/mol b) representação em cartoon da proteína TgPR5 em
afinidade de -6,0 Kcal/mol. ....................................................................................... 50
5,9 Kcal/mol. ............................................................................................................ 51
Figura 15: Eletroforese em gel de agarose a 1% para avaliação da síntese de cDNA.
M) marcador de peso molecular 1Kb Ladder, poços 1, 4, 7 e 10 amostra de RNA
total não tratada com DNAse, poços 2, 5, 8, 11 amostra de RNA tratado com DNAse,
poços 3, 6, 9, 12 amostra de cDNA. ......................................................................... 52
Figura 16: Gel de agarose a 1% para o teste de amplificação a 62 °C com os primers
desenhados para os genes em estudo. Nota-se que o primer para o gene c106 não
apresentou amplificação. .......................................................................................... 53
iv
desenhados para os genes em estudo. Nota-se que o primer para o gene c106
gerou uma fraca amplificação................................................................................... 54
desenhados para os genes em estudo. Nota-se que todos os primers apresentaram
amplificação correspondente ao tamanho esperado. ............................................... 54
Figura 19: Gráfico da curva de dissociação dos amplicons gerados com os primers
em estudo. Os formatos dos gráficos indicam que não houve formação de dímeros
ou amplificações inespecíficas. ................................................................................ 58
Figura 20: Eletroforese em gel de agarose (1,5%) dos produtos de PCR obtidos com
os primers em estudo A) genótipo 174 (resistente) B) genótipo 1074 (suscetível). M)
Marcador de peso molecular 1kb Ladder, 1) primer TUB, 2) primer MDH 3), primer
ACP, 4) OSM2 5) primer c596, 6) primer c516, 7) primer c356, 8) primer c173, 9)
primer c106, 10) primer c68, 11) primer c14............................................................. 59
Figura 21: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR1 no genótipo suscetível
(1074), nos pontos não inoculado (NI), 8h, 24h, 48h e 72h. ..................................... 60
Figura 22: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR1 no genótipo resistente
(174), nos pontos não inoculado (NI), 8h, 24h, 48h e 72h. ....................................... 61
Figura 29: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR10.1 no genótipo
suscetível (1074), nos pontos não inoculado (NI), 8h, 24h, 48h e 72h. .................... 66
resistente (174), nos pontos não inoculado (NI), 8h, 24h, 48h e 72h. ...................... 66
v
suscetível (1074), nos pontos não inoculado (NI), 8h, 24h, 48h e 72h. .................... 67
resistente (174), nos pontos não inoculado (NI), 8h, 24h, 48h e 72h. ...................... 67
Figura 33: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPTI5 no genótipo suscetível
Figura 34: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPTI5 no genótipo resistente
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação das proteínas PR da família 1 a 17, segundo Edreva (2005) ,

Ebrahim e colaboradores (2010) e Sinha e colaboradores (2014). .......................... 14
Tabela 2: : Primers utilizados no PCR em tempo real, seus respectivos tamanhos
esperados. ................................................................................................................ 21
Tabela 3: Resultado do alinhamento feito pelo BLASTp no genoma do cacau.
Observa-se uma alta similaridade entre as proteínas do cupuaçuzerio em relação às
proteínas do cacaueiro. ............................................................................................ 27
Tabela 4: Resultado das análises feitas no NCBI onde a terceira coluna mostra o
tamanho da ORF e a ultima mostra a família proteína a qual a sequência pertence
com base no CDD. ................................................................................................... 28
Tabela 5: Predição do peso molecular, ponto isoelétrico e sítios, de glicosilação,
fosforialção e acetilação e presença ou ausência de peptídeo sinal e seu respectivo
tamanho.................................................................................................................... 30
Tabela 6: Classificação nas famílias PR, nomeação das proteínas de cupuaçuzeiro e
localização celular das mesmas. .............................................................................. 31
Tabela 7: Tabela com as proteínas ortólogas entre cupuaçuzeiro e A. thaliana e suas
similaridades............................................................................................................. 32
Tabela 8: Processos biológicos no qual as proteínas estão envolvidas gerados pelo
BiNGO. ..................................................................................................................... 32
Tabela 9: Proteínas depositadas no PDB com maior similaridade com as proteínas
de cupuaçuzeiro. ...................................................................................................... 34
Tabela 10: Resultado da afinidade da molécula de quitina no sítio ativo da proteína
TgPR5 em 5 posições diferentes.............................................................................. 51
Tabela 11: Média da eficiência dos primers nos genótipos resistente (174) e
suscetível (1074). ..................................................................................................... 55
Tabela 12: Teste de estabilidade dos genes de referência, calculado com a
ferramenta NormFinder. Observa um valor de estabilidade de 0,606 para a
combinação ACP e MDH. ......................................................................................... 56
i
Tabela 13: Teste de estabilidade dos genes de referência, calculados pelo
ferramenta Norm finder. Observa-se um valor de estabilidade de 0,369 para a
combinação ACP e MDH. ......................................................................................... 56
Tabela 14: Média do TM de cada primer e genótipo e seus respectivos desvios
padrão. ..................................................................................................................... 57
ii
1. INTRODUÇÃO
O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) é uma frutífera com um grande

potencial econômico tendo um grande aproveitamento do seu fruto e uma ampla
aplicação, que vão desde a confecção de doces à produção de cosméticos
(NAZARÉ et al., 1990; SALGADO et al., 2011; SILVA; SILVA, 2000). Devido às
características promissoras e a grande aceitação no mercado, o cupuaçuzeiro está
entre as primeiras frutíferas com maior importância econômica do estado do Pará
(SAGRI, 2012) e vem tendo uma grande ascensão. Com o aumento da
popularização do cupuaçu, o estado do Pará produziu em 2010 41 t, 13,5 vezes
mais do que a produção nacional de cupuaçu no ano de 2006 que foi de 3 t (IBGE
2006).
O cupuaçueiro possui pragas e patógenos que podem causar prejuízos na

produção, porém a vassoura-de-bruxa em especial causa grandes perdas na
produção e gera uma insegurança por parte dos produtores. A doença vassoura-de-
bruxa, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa, atualmente é o grande entrave
na expansão da cultura do cupuaçuzeiro. Para a melhor compreensão da interação
planta-patógeno entre M. perniciosa-T. grandiflorum, a identificação de proteínas
envolvidas no processo de resistência do cupuaçuzeiro através de ferramentas
moleculares é essencial.
De modo geral as planta, quando resistentes, são capazes de reconhecer um

patógeno e impedir a virulência do mesmo através de receptores de padrões
moleculares associados a patógenos (PAMPs) e/ou genes de resistência
denominados genes R. Uma vez detectado um patógeno a planta expressa um
conjunto de proteínas para impedir a colonização do patógenos, caso o mesmo, seja
capaz de driblar os mecanismo de defesa da planta ela desenvolverá a doença.
Dentre as proteínas presentes nos mecanismos de defesa das plantas, as

proteínas relacionadas à patogênese (PR), devem ter uma atenção especial por
serem proteínas muitas vezes relacionadas à resistência (MARKOVIĆ-HOUSLEY et
al., 2003). Inicialmente as proteínas PR foram divididas em função da sua atividade
biológica e/ou das suas propriedades físico-químicas (SELS et al., 2008).
3
Atualmente estas proteínas são divididas em 17 classes (CHISTENSEN et al., 2002;
SINHA et al., 2014). Como exemplo, membros da família PR-3, PR-4, PR-8 e PR-11
já mostraram atividade de quitinase, proteínas PR-7, PR-9, PR-10 e PR-8 possuem
atividade de proteinase, peroxidase, ribonuclease e lisozima (EDREVA, 2005),
sendo proteínas com grande potencial antifúngico.
Dada a importância das proteínas PR nos mecanismos de defesa das plantas,

o estudo de proteínas PR podem revelar informações importantes sobre a relação
planta-patógeno. Assim, para a maior compreensão dos mecanismos de resistência
a vassoura-de-bruxa em T. grandiflorum, este trabalho caracterizou e analisou a
expressão gênica de proteínas PR, que podem revelar dados importantes acerca
destes mecanismos.
Até o presente estudo não foi caracterizada nenhuma proteína do tipo PR

envolvidas no mecanismo de resistência em cupuaçuzeiro, bem como aspectos
moleculares relacionados à interação entre M. perniciosa-T. grandiflorum. Este
trabalho teve como objetivo, caracterizar proteínas do tipo PR (PR-1, PR-3, PR-5,
PR-8, PR-10 e AP2) de cupuaçuzeiro e analisar os níveis de expressão de genes
que codificam proteínas PR em genótipos resistente e suscetível a vassoura-de-
bruxa, inoculadas com o fungo M. perniciosa. Os resultados deste trabalho podem
contribuir para o conhecimento dos mecanismos de defesa do cupuaçuzeiro, bem
como genes envolvidos no processo de resistência a vassoura-de-bruxa.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. O cupuaçuzeiro
O cupuaçuzeiro [Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) Schum.]

pertence à família Malvaceae, sendo uma espécie nativa do Brasil, naturalmente
distribuída nos estados do Amazonas, Pará, Maranhão, Rondônia e Acre. Culturas
comerciais também podem ser encontradas em outros estados do Brasil (YANG et
al., 2003) e em outros países tropicais como Costa Rica, Colômbia, Equador, Guiana
Francesa, Guiana e Suriname (PUGLIESE et al., 2013).
O cupuaçuzeiro é uma frutífera perene que pode atingir 7 m de diâmetro de

copa, 4 a 10 m de altura média (Figura 1a), e até 20 m de altura nos indivíduos
silvestres. O fruto normalmente tem o formato de uma baga capsular (Figura 1c),
podendo ter formatos variados, extremidades obtusas ou arredondadas com
diâmetro de 9 cm a 15 cm, comprimento de 10 cm a 40 cm e peso variando de 300 g
a 4.000 g, sendo que 24 a 50% do peso se refere a polpa, 10 a 29% a sementes, 2 a
4% a placenta, e 39 a 52% a casca. As sementes apresentam um formato ovóide ou
ovóide-elipsóide, com um comprimento de 2 a 3 cm, tendo de 2 a 2,5 cm de largura
e de 1 a 1,8 cm de espessura. O peso das sementes varia de 4 g a 7 g. O número
de sementes por fruto varia de 15 a 50 sementes, dependendo da variedade
(ALVES, 2002).
Figura 1: a) Cupuaçuzeiro, b) flor e c) fruto de cupuaçuzeiro.
5
2.2. Importância econômica da cultura do cupuaçuzeiro
Dentre as frutas tropicais nativas da região amazônica, o cupuaçu é a que

reúne melhores condições de aproveitamento industrial devido ao amplo
aproveitamento do fruto e o alto rendimento de sua polpa (COSTA et al., 2003).
Além disso, uma das vantagens do seu cultivo é a possibilidade desse ser feito em
sistema agroflorestal, tornando-se uma forma de cultivo sustentável (BENTES-
GAMA et al., 2005). As sementes fermentadas e processadas permitem a fabricação
do cupulate (NAZARÉ et al., 1990), produto parecido com o chocolate, o qual é
obtido a partir das sementes do cacaueiro (Theobroma cacao L.) – enquanto a polpa
é utilizada na confecção de doces, sucos e geleias, sendo muito popular no norte e
nordeste do Brasil (FERREIRA et al., 2009). Os subprodutos do cupuaçu são
também fontes de compostos bioativos com propriedades funcionais e nutracêuticas,
tais como a farinha de casca de cupuaçu, que pode ser utilizada para a confecção
de pães integrais. Esta farinha é rica em fibras, que auxiliam nos processos
digestivos além de prevenir algumas doenças ou distúrbios (SALGADO et al., 2011).
O estado do Pará é o maior produtor nacional de cupuaçu e teve um aumento

de 315% em sua produção quando comparado dados de 2006 (IBGE 2006) e 2010
(SAGRI 2012). Atualmente, o cupuaçu está em primeiro lugar no ranking das
fruteiras com maior importância econômica do estado do Pará (SAGRI, 2012).
Porém, mesmo se tratando de uma frutífera em ascensão, a presença de alguns
patógenos faz com que os produtores fiquem inseguros quanto ao investimento na
sua cultura.
2.3. Pragas e patógenos da cultura do cupuaçuzeiro: enfoque na doença

vassoura-de-bruxa
A cultura do cupuaçuzeiro é acometida por pragas e patógenos que podem

causar danos, perdas de produção e até a morte da planta. Dentre as pragas que
6
afetam a cultura do cupuaçuzeiro estão a broca-do-fruto do cupuaçuzeiro
(Conotrachelus sp), lagarta rendilhadeira de folhas (Macrosoma tipulata) e a broca-
do-broto (Coleoptera: Curculionidae). Dentre as doenças causadas por patógenos
estão a morte progressiva (Lasiodiplodia theobromae), podridão vermelha
(Ganoderma philippii), mancha de Phomopsis (Phomopsis sp), e a vassoura-de-
bruxa (Moniliophthora perniciosa).
A vassoura-de-bruxa é uma das principais doenças do cupuaçuzeiro, e se

destaca das demais por gerar grandes perdas nesta cultura, chegando a gerar 70%
de perda na produção (EMBRAPA, 2012), sendo também responsável por grandes
perdas econômicas na cultura do cacaueiro (EVANS, 1981). O agente causador da
vassoura-de-bruxa é o fungo M. perniciosa, que pertence à divisão Eumycota,
subdivisão Basidimycota, ordem agaricales e família Marasmiaceae (AIME;
PHILLIPS-MORA, 2005). Este fungo pode atacar plantas da família Malvaceae,
Solanaceae, Bignoniaceae, Bixaceae e Malpighiaceae (RINCONES et al., 2006). O
patógeno possui uma fase biotrófica, monocariótica, e uma fase saprofítica,
dicariótica (EVANS, 1980). Na fase biotrófica, o patógeno necessita do tecido
infectado vivo para garantir sua nutrição e crescimento, já na saprofítica o tecido
infectado é induzido à necrose pelo fungo, onde ele inicia o seu processo de
dispersão e reprodução através do basidiósporo (TEIXEIRA et al., 2014).
As vassouras vegetativas no cupuaçuzeiro ocorrem durante todo o ano, com

picos nos meses de julho e agosto (BENCHIMOL et al., 2001). A infecção ocorre
normalmente em tecidos meristemáticos, gerando a perda da dominância apical,
hipertrofia e hiperplasia do tecido e um grande aumento de brotamentos laterais
(Figura 2a). Quando a infecção ocorre nos primeiros estágios de formação do broto
floral, há formação de ramalhete de flores anormais e hipertrofiadas. As flores
hipertrofiadas dão origem a frutos deformados que morrem prematuramente (Figura
2c). Nos frutos, os sintomas variam dependendo do modo de infecção e da idade do
mesmo (ALVES et al., 2009). Segundo Benchimol et al. (2001), o período mínimo e
máximo que as vassouras-de-bruxa permanecem verdes é de 34,9 a 65,2 dias,
respectivamente, e que sua secagem ocorre dentro de 5,8 a 10 dias da base para o
ápice.
7
Figura 2: Sintomas da doença da vassoura-de-bruxa em cupuaçuzeiro. a) hipertrofia e formação de
brotamentos laterais, b) formação da vassoura-de-bruxa (secas), c) frutos dismorfos gerados a partir
de flores infectadas.
O cupuaçu era normalmente obtido por extrativismo e devido a sua grande

aceitação no mercado, a cultura sofreu uma expansão, passando a ser cultivado de
forma racional (BENCHIMOL et al., 2001). Por se tratar de uma cultura em
expansão, há uma carência quanto a cultivares resistentes à vassoura-de-bruxa com
boa produtividade. Para auxiliar o programa de melhoramento genético de
cupuaçuzeiro Davi e colaboradores (2000) clonaram e avaliaram 36 genótipos
diferentes em um período de 4 anos quanto a incidência de Vassoura-de-bruxa,
onde foram identificados 5 genótipos resistentes e 7 genótipos tolerantes a doença.
O melhoramento genético do cupuaçuzeiro é feito através do cruzamento destes
clones buscando cultivares resistente e com boas características agronômicas.
Recentemente foi lançada a cultivar BRS Carimbó que apresenta uma tolerância à
doença associada uma boa produtividade (ALVES; FERNANDES, 2013). Porém
bases moleculares e identificação de genes de resistência ainda não foram descritos
até o presente momento para o cupuaçuzeiro, sendo a obtenção de uma ampla base
genética fundamental para a expansão da cultura, além de acelerar o processo de
desenvolvimento de cultivares resistente.
O cacaueiro, um parente próximo do cupuaçuzeiro, é uma espécie de grande

importância econômica e recentemente teve o seu genoma sequenciado (ARGOUT
et al., 2011; MOTAMAYOR et al., 2013), estando disponível através do banco de
dados CocoaGen DB (http://cocoagendb.cirad.fr/) e ―cacao genome database‖
(http://www.cacaogenomedb.org/). Além disto, foram feitos vários estudos
transcriptômicos nesta espécie, tendo sido descritas sequências de diversos tecidos
e genótipos em diferentes condições ambientais, que apoiam a busca de genes de
8
interesse tanto no aspecto de resistência como de qualidade (ARGOUT et al., 2008;
GESTEIRA et al., 2007; LEAL et al., 2007, DA HORA JUNIOR et al., 2012). Em
particular, Gesteira e colaboradores (2007) descreveram genes expressos em
tecidos meristemáticos de cacaueiro infectados com o fungo M. perniciosa. Neste
trabalho os autores identificaram genes relacionados à resistência, tais como:
proteínas relacionadas à patogênese (PR), inibidores de tripsina e oxoalato oxidase.
Diversos trabalhos têm sido realizados com proteínas do tipo PR em cacaueiro,
como exemplo tem-se: PR-1 (TEIXEIRA et al., 2013), PR-4 (MENEZES et al., 2014),
PR-5 (BAE et al., 2009) e PR-10 (MENEZES et al., 2012; PUNGARTNIK et al., 2009;
SILVA et al., 2013).
Em seu conjunto, os estudos citados tem um importante papel no avanço e

expansão de estudos genéticos em cacaueiro e pode apoiar a obtenção de
conhecimentos em cupuaçuzeiro. A utilização de dados do cacaueiro para o auxilio
de estudos em cupuaçuzeiro vem sendo feita, tais como, transferência de
marcadores moleculares de T. cacao para T. grandiflorum (ALVES et al., 2006) e
estudos de genômica comparativa (KUHN et al., 2010). Entretanto, até o presente
momento estudos sobre genes de resistência em cupuaçuzeiro ainda não foram
desenvolvidos. O estudo de genes e de resistência pode auxiliar no desenvolvimento
de cultivares resistentes a vassoura-de-bruxa e permitir a expansão da cultura do
cupauaçuzeiro.
2.4. Aspectos moleculares de M. perniciosa na interação planta patógeno
Assim como a maioria dos patógenos, o fungo M. perniciosa possui vários

mecanismos para causar a virulência em seu hospedeiro. Estudos da interação
entre M. perniciosa e T. cacao mostram que o fungo possui tolerância a altos níveis
de ROS (espécies reativas de oxigênio), permitindo que o fungo sobreviva durante a
explosão oxidativa no hospedeiro, através de enzimas como a superóxido
dismutase, catalases e peroxidades (MONDEGO et al., 2008; THOMAZELLA et al.,
2012).
9
No genoma do fungo M. perniciosa foram encontrados genes envolvidos na
biossíntese de fitohormônios, como a giberelina e o ácido indolilacético (AIA). A
produção de giberelina induzida por M. perniciosa pode ser responsável por gerar o
fenótipo de hiperplasia das vassouras verdes. O ácido indolilacético (AIA) em
elevadas concentrações leva a hipertrofia e hiperplasia do tecido infectado
(DABYDEEN; SREENIVASAN, 1989; KILARU; HASENSTEIN, 2005). Esta produção
de fitohormônios indica que o fungo atua alterando o metabolismo e a defesa da
planta por alteração no balanço hormonal (MONDEGO et al., 2008; ROBERT-
SEILANIANTZ et al., 2007).
O patógeno M. perniciosa também possui genes que codificam proteínas

indutoras de etileno (NEPs), capazes de induzir a produção de etileno e gerar
necrose em tecidos de cacau, sendo estas proteínas, importantes no processo de
infecção e desenvolvimento da doença (GARCIA et al., 2007). O patógeno ainda
possui um grande número de enzimas entre elas carboxilesterases e lipases,
poligalactorunases que estão relacionadas com o estilo de vida hemibiotrófico,
atuando na degradação da parede celular (CARVALHO et al., 2013a, 2013b;
MONDEGO et al., 2008).
O fungo M. perniciosa possui uma alta tolerância ao ácido salicílico (AS),

devido à presença de enzimas salicilato hidroxidase, que permite o fungo resistir aos
altos níveis de AS, presente em plantas com vassoura-de-bruxa (CHAVES;
GIANFAGNA, 2006; MONDEGO et al., 2008). O AS pode induzir proteínas com PR-
1 e PR-5, que por sua vez pode limitar a competição com outros fungos durante o
progresso da doença, sendo um aparato importante na estratégia de patogenicidade
de M. perniciosa (MONDEGO et al., 2008). Outros genes encontrados em M.
perniciosa foram genes de proteínas classificadas na superfamília SCP-like – que
inclui as proteínas relacionadas à patogênese PR-1 (MONDEGO et al., 2008;
TEIXEIRA et al., 2013), e um gene similar a PR-5, que corresponde a superfamília
das taumatinas (MONDEGO et al., 2008).
2.5. Mecanismos de defesa em plantas
10
Durante a evolução as plantas desenvolveram diversas estratégias para se
proteger e/ou resistir a organismos patogênicos. Esses mecanismos de defesa
contra patógenos atuam das mais variadas formas, podendo ser mecanismos
estruturais e bioquímicos. Para uma melhor distinção destes mecanismos, eles são
divididos em mecanismos pré e/ou pós-formados sejam eles estruturais ou
bioquímicos. Os mecanismos estruturais atuam como barreiras físicas que impedem
a colonização e/ou a penetração do patógeno, enquanto os mecanismos
bioquímicos atuam inibindo o desenvolvimento do patógeno (ITAKO et al., 2008).
2.5.1 Mecanismos estruturais
Os mecanismos de defesa estruturais podem ser constitutivos (pré-formados).

Neste grupo se encontram as estruturas produzidas pela planta independente da
ação de patógenos, como exemplo, cutícula, pilosidade, vasos condutores, número
e forma de estômatos e camada de sílica. Além da resistência este grupo apresenta
diversas funções na planta como: transporte de nutrientes, fotossíntese, etc
(STANGARLIN et al., 2011).
Os mecanismos pós-formados são aqueles induzidos na presença do

patógeno na superfície da planta. A formação de papilas, lignificação da parede
celular, formação de cortiça, halos, tilose, camadas de abscisão, deposição de gel e
hesperidinas são mecanismos comumente utilizados em resposta ao ataque de um
patógeno (STANGARLIN et al., 2011).
2.5.2 Mecanismos bioquímicos
Nos mecanismos bioquímicos pré-formados estão às substâncias que se

encontram no tecido em altas concentrações antes do contato com o patógeno, ou
podem ser convertidas em substancias altamente tóxicas, quando se dá inicio ao
processo de infecção, sem necessitar de um percussor remoto (GARCION et al.,
2007). Neste grupo podemos encontrar: fenóis, alcaloides, lactonas, terpenoides e
algumas proteínas.
11
Nos mecanismos pós-formados várias moléculas elicitoras associadas ao
patógeno são reconhecidas, resultando na ativação do mecanismo de defesa
(GARCION et al., 2007). Envolvidas neste processo encontram-se as espécies
reativas de oxigênio, óxido nítrico e fitoalexinas. Além destes, temos também
mecanismos pré e pós-formados como é o caso das proteínas PR (STANGARLIN et
al., 2011). Os mecanismos pós-formados são induzidos através do reconhecimento
do patógeno, por meio do sistema imune da planta.
2.6 Imunidade em plantas
A imunidade em plantas é um mecanismo bastante complexo, no decorrer da

evolução as plantas se aperfeiçoaram nos mecanismos de reconhecimento de
patógenos.
Por serem atacadas por uma grande diversidade de patógenos as plantas

desenvolveram receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), estes receptores
são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos ou
microrganismos (PAMPs, MAMPs) e também padrões moleculares associados a
danos (DAMPs) (BOLLER; FELIX, 2009; JONES; DANGL, 2006). O reconhecimento
de PAMPs, MAMPs e DAMPs ocorre por meio de receptores PRRs, que resulta em
uma imunidade desencadeada por PAMP (PTI), também chamada de resistência
horizontal basal, que pode evitar futuras colonizações. Caso o patógeno possua
efetores capazes de evitar a reação PTI, ocorre uma susceptibilidade desencadeada
por efetores (ETS) (JONES; DANGL, 2006). Uma vez estabelecida uma ETS,
efetores do patógeno podem ser reconhecidos por proteínas NB-LRR polimórficos
(sítios de ligação a nucleotídeos, repetições ricas em leucina), que são codificadas
por genes de resistência (R), e assim, desencadeando uma ETI (imunidade
desencadeada por efetores), também chamada de resistência vertical. Esta, por sua
vez, pode acelerar o processo de PTI, conferindo resistência à planta e
desencadeando uma resposta de HR no sítio de infecção. (BOLLER; FELIX, 2009;
JONES; DANGL, 2006; ZIPFEL, 2014).
Proteínas NB-LRR são capazes de reconhecer efetores de diversos

patógenos e ativar uma resposta de defesa. As NB-LRR são efetivas contra
12
patógenos biotróficos e/ou hemibiotróficos, porém, não possuem efetividade contra
fungos necrotróficos (JONES; DANGL, 2006).
A relação planta-patógeno é uma batalha evolutiva constante, onde os

patógenos buscam mecanismos para burlar os mecanismos de defesa do
hospedeiro por meio da diversificação dos efetores, meios de suprimir ETI e assim
causar virulência. Em contra partida as plantas desenvolvem mecanismos para
evitar a colonização do patógeno por meio de proteínas R, mantendo a ETI (JONES;
DANGL, 2006). Os mecanismos de reconhecimento aqui apresentados
desencadeiam uma série de respostas fisiológicas ativando variados mecanismos de
defesa das plantas como proteínas relacionadas à patogênese (PR).
2.7. Proteínas relacionadas à patogênese (PR)
Dentre os produtos resultantes de uma interação planta-patógeno, se

destacam as proteínas relacionadas à patogênese, que são geralmente proteínas
solúveis (STINTZI et al., 1993). As proteínas PR são induzidas em resposta a
estresse biótico ou abióticos e são muitas vezes correlacionadas com a resistência
em plantas (STANGARLIN et al., 2011). As proteínas PR foram primeiramente
identificadas em tabaco identificadas em dois trabalhos distintos (GIANINAZZI et al.,
1970; VAN LOON; VAN KAMMEN, 1970), e subsequentemente identificadas em
várias monocotiledôneas e dicotiledôneas, podendo ser consideradas presentes em
todo o reino vegetal (AGLIKA, 2005).
Estas proteínas são caracterizadas por propriedades bioquímicas específicas;

possuem baixo peso molecular (6-43 kDa), são estáveis a um pH baixo (< 3),
termostáveis e altamente resistente a proteases (VAN LOON; VAN STRIEN, 1999).
Elas podem ser expressas em folhas, caules, raízes e flores (VAN LOON; VAN
STRIEN, 1999) e podem ser encontradas no vacúolo e no apoplasto, sendo o
apoplasto o principal local de acúmulo. As proteínas PR de plantas já foram
detectadas nas paredes celulares de fungos patogênicos e no espaço formado entre
a parede e a membrana plasmática invaginada de fungos, assim como na parede
celular vegetal (JEUN; BUCHENAUER, 2001; JEUN, 2000). Inicialmente as
13
proteínas PR eram classificadas em cinco famílias, com base em critérios como
massa molecular, ponto isoelétrico, localização e atividade biológica (VAN LOON,
1985). A classificação atual divide as proteínas PR em 17 classes (PR1-PR17) em
função da sua atividade biológica e/ou das suas propriedades físico-químicas
(CHISTENSEN et al., 2002; EBRAHIM et al., 2011; EDREVA, 2005; SINHA et al.,
2014) ou por homologia de suas sequências (Tabela 1).
As proteínas PR são amplamente estudadas embora sua classificação seja

um tanto quanto confusa e/ou redundante, como é o caso das famílias PR-3, PR-4 e
PR-11. O seu tipo de organização torna a classificação de proteínas nos diversos
grupos de PR um tanto quanto difícil e trabalhoso. No entanto, alguns grupos que já
possuem um estudo mais aprofundado, esta nomenclatura tenda a se preservar
devido à utilização de ferramentas de bioinformática para a caracterização e
proteínas.
Tabela 1: Classificação das proteínas PR da família 1 a 17, segundo Edreva (2005) , Ebrahim e
colaboradores (2010) e Sinha e colaboradores (2014).
Família Propriedades
PR-1 Antifúngica
PR-2 β-1,3-glucanase
PR-3 Quitinase tipo I,II, IV,V,VI,VII C
PR-4 Quitinase tipo I,II
PR-5 Taumatina
PR-6 Inibidor de proteinase
PR-7 Endoproteinase
PR-8 Quitinase tipo III
PR-9 Peroxidase
PR-10 Ribonuclease
PR-11 Quitinase, tipo I
PR-12 Defensina
PR-13 Tionina
PR-14 Lipídeo-transferases
PR-15 Oxalato oxidase
PR-16 Oxalato oxidase-like
PR-17 Desconhecida
14
A proteína PR-1 foi primeiramente encontrada em tabaco e posteriormente
ortólogos em diversas outras plantas também foram relatados, formando a família
PR-1. Estas proteínas possuem atividade antifúngica embora o seu mecanismo de
ação ainda não seja completamente compreendido (AGLYKA 2005; SINHA et al.,
2014). Um receptor de membrana caracterizado como PR-1 foi encontrado em T.
cacao (TEIXEIRA et al., 2013), o que sugere que a família das proteínas PR-1
incluem proteínas com funções distintas.
A família PR-2 corresponde a β-1,3-glucanases que possuem um peso

molecular de 20 a 30 kDa. Estas enzimas estão presentes no processo de defesa
contra patógenos e também são encontradas em diversos processos fisiológicos e
de desenvolvimento da planta, como por exemplo, divisão celular, germinação de
pólen, germinação de sementes entre outros (PAYNE et al., 1990). Além disto, estas
proteínas podem ser induzidas por luz ultravioleta, estresse mecânico e baixas
temperaturas (SINHA et al., 2014).
As famílias PR-3 PR-4 e PR-11 são compostas por vários tipos de quitinases,
onde além de sua classe como quitinase também é considerado o peso molecular
para classifica-las na família PR adequada. A família das PR-3 inclui quitinases do
tipo I, II, IV, V, VI e VII, com um peso molecular de 23 a 25 KDa (EBRAHIM et al.,
2011). Estas enzimas têm propriedades antifúngicas, atuam na degradação de
quitina presente na parede celular de fungos e exoesqueleto de alguns animais.
Algumas quitinases do tipo I são encontradas no processo de formação de sementes
(EDREVA 2005; EBRAHIM et al., 2011; SINHA et al., 2014). Proteínas do tipo PR-4
possuem um peso molecular em torno de 13 a 14,5 kDa e incluem quitinase do tipo I
e II, apresentando potencial antifúngico. Recentemente proteínas PR-4 mostraram
atividade de ribonuclease (LU et al., 2012; MENEZES et al., 2014). As proteínas da
família PR-4 foram classificadas como endoquitinases (NEUHAUS et al., 1996).
Além de serem induzidas por ataque de patógenos, proteínas PR-4 podem ser
induzidas por etileno e na presença de ozônio, O3 (GU et al., 2002; RAO et al.,
2002). Proteínas do tipo PR-11 também incluem qutinase do tipo I (EBRAHIM et al.,
2010; SINHA et al., 2014).
A familia PR-5 é composta por taumatinas e osmotinas, possuem peso

molecular de 22 a 26 kDa, podendo em alguns casos apresentar 16 kDa (SINHA et
15
al., 2014). Estas proteínas podem ser ácidas, básicas ou neutras e são identificadas
em condições de estresses bióticos e abióticos, e a maioria apresenta potencial
atividade antifúngica, atuando diretamente na degradação da parede celular do
fungo (SALZMAN et al.,2004). As osmotinas são proteínas homólogas a taumatinas,
e comumente encontradas em grandes quantidades quando a planta é submetida a
um estresse osmótico (DUFFORT et al., 2002; VRTALA et al., 1999).
Proteínas do tipo PR-6 e 7 são inibidores de protease, sendo que a PR-6 foi
descrita primeiramente em tomate (JOHNSON; LEE; RYAN, 1990) e posteriormente
vários homólogos foram encontrados em diversas espécies de plantas. Estes
inibidores podem estar relacionados com o mecanismo de defesa na planta
(NEWHAUS 1999). Já a PR-7 corresponde a uma endoproteinase, também
inicialmente isolada de tomate (TORNERO et al., 1996).
A família PR-8 envolve quitinases do tipo III com atividade de lisozima. Uma
das principais representantes deste grupo é a hevamina (Hev 14) que exibe tanto
atividade de lisozima quanto de quitinase, que desempenha um papel importante na
atividade contra fungos (SINHA et al., 2014).
Já a família PR-9 envolve peroxidases, que são enzimas relacionadas ao

processo de crescimento, diferenciação celular e mudanças morfogenéticas em
respostas a estresse físico, químico e biológico (OSWALDO, 2003).
As proteínas do tipo PR-10 podem ser expressas constitutivamente ou em

resposta ao ataque de patógenos, estando envolvidas em diferentes rotas
metabólicas. As PR-10 compõem uma família multigênica, o que provavelmente por
mutações pode ter desenvolvido aspectos multifuncionais por um processo chamado
de protein promiscuity (FERNANDES et al., 2013). Mais de 100 membros da família
das PR-10 foram encontrados em mais de 70 espécies de monocotiledôneas e
dicotiledôneas. São proteínas pequenas tendo de 154 a 163 aminoácidos,
resistentes a proteases, geralmente possuem localização intracelular (CHADHA;
DAS, 2006; FERNANDES et al., 2013). Estas proteínas desempenham um
importante papel no desenvolvimento e crescimento da planta, sendo encontradas
em grandes concentrações em folhas senescentes (SIKORSKI et al., 1999). As
proteínas PR-10 podem estar envolvidas em processos enzimáticos, incluindo
16
atividade de ribonuclease (PUNGARTNIK et al., 2009) e biossíntese de metabólitos
secundários (FERNANDES et al., 2013).
PR-12 são defensinas, que são peptídeos de 45 a 54 resíduos de

aminoácidos e apresentam um peso molecular de 5 a 8 kDa, ricos em cisteínas com
possuem atividade antifúngica (CARVALHO; GOMES, 2009; THEVISSEN et al.,
2003). As defensinas além de um papel constitutivo podem ser induzidas no
processo de infecção por fungos ou ferimentos (THEVISSEN et al., 2003).
A família das proteínas PR-13 é composta por thioninas (RAYAPURAM et al.,

2008) com atividade antifúngica por meio da permeabilização de membrana
(AGLYKA 2005; RAYAPURAM et al., 2008).
Proteínas pertencentes à família das PR-14 são compostas por lipídeo

transferases (LTPs) e estão relacionadas com a transferência de fosfolipídeos,
dentre outros grupos de ácidos graxos através da membrana celular. A família das
proteínas PR-14 é composto por pequenas proteínas conservadas com peso
molecular entre 9 a 10 kDa. Estas proteínas estão envolvidas na defesa da planta
contra patógenos, bem como diferentes tipos de estresse como seca, calor, frio, ou
salinidade (KADER, 1996; SINHA et al., 2014b). Podendo atuar como
transportadores, na formação de cutina no processo de extensão da parede celular
(NIEUWLAND et al., 2005).
PR-15 e PR-16 são proteínas do tipo oxalato oxidase e foram identificadas

primeiramente em cevada, em resposta ao fungo oídio (DUMAS et al., 1995; ZHANG
et al., 1995). Segundo Zhou e colaboradores (1998), estas proteínas podem
desempenhar um papel na via de transdução de sinal para a regulação da resposta
de hipersensibilidade.
A família das PR-17 ainda é pouco estudada e segundo alguns autores ela
não possui funções definidas (EBRAHIM et al., 2010; SINHA et al.,2014). Segundo
Christensen e colaboradores (2002) em seu trabalho com hordeum vulgare, foram
identificados dois genes que codificam proteínas do tipo PR-17, e através da análise
de domínios conservados foi possível identificar possível sitio ativo para
endopeptidase.
17
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Análises in silico
As sequências similares a proteínas do tipo PR utilizadas foram selecionadas

de um banco de dados de RNAseq de cupuaçuzeiro, obtido por sequenciamento via
454 (SANTANA et al. 2012).
As sequências das possíveis PR foram submetidas ao programa ORF finder,

para predizer as ORF (Open Reading Frame) e estas foram submetidas ao BLASTp
associado a ferramenta Conserved Domains Database (CDD). Todas as ferramentas
estão disponíveis no NCBI (National Center for Biotechnology Information
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]).
A predição do peptídeo sinal, sítio de gilcosilação, sítio de fosforilação, sítio

de acetilação, peso molecular e ponto isoelétrico, foram feitas através dos softwares
SignalP 4.1 (PETERSEN et al., 2011), NetNGlyc (GUPTA; JUNG; BRUNAK, 2004),
NetPhos 2.0 (BLOM; GAMMELTOFT; BRUNAK, 1999), NetAcet1.0 (KIEMER;
BENDTSEN; BLOM, 2005), Compute pI/Mw (GASTEIGER et al., 2005)
respectivamente. A localização celular foi feita através da ferramenta MultiLoc2-
HighRes (BLUM; BRIESEMEISTER; KOHLBACHER, 2009).
As proteínas foram classificadas nas respectivas famílias de PR com base em

suas características preditas e através de alinhamento em banco de dados, e tendo
como referência a Tabela de classificação de proteínas PRs (EBRAHIM et al., 2011;
EDREVA, 2005) (Tabela 1).
3.1.2 Ontologias gênicas
Inicialmente, proteínas de Arabidopsis thaliana similares às proteínas de

cupuaçuzeiro foram buscadas por comparação no banco de dados STRING
(JENSEN et al., 2009), utilizando os parâmetros padrões do STRING (http://string-
db.org). Em seguida, as proteínas com maior pontuação (bitscore) foram
18
selecionadas, gerando assim uma rede de interação. Os dados desta rede foram
analisados quanto aos processos biológicos nos quais as proteínas estão
envolvidas, através da ferramenta Cytoscape, plugin BiNGO, utilizando a
configuração padrão.
3.1.3 Predição de estrutura de proteínas e docking
A predição da estrutura das proteínas foi feita através do SWSS-MODEL

(ARNOLD; BORDOLI; SCHWEDE, 2006). A proteína em estudo foi comparada as
proteínas disponíveis no PDB (Protein Data Bank), aquela com maior identidade,
considerando como critério uma identidade mínima de 25% (OSWALDO, 2003), foi
selecionada como molde a proteína já descrita no PDB com maior similaridade e
cobertura. Baseado neste molde foi gerado uma estrutura para a proteína em
estudo. A estrutura predita foi analisada pela ferramenta PROCHECK (LASKOWSKI
et al., 2005) para a análise de parâmetros estereoquímicos e pelo Pro-SA
(WIEDERSTEIN; SIPPL, 2007) para análise dos níveis de energia na estrutura (Z-
Score).
A análise de docking da proteína TgPR5 foi feito com o software autodock

vina e autodock tools v1.5.6 (TROTT; OLSON, 2010) utilizando 9 posições do ligante
(num_modes=9) na região do sítio ativo. Por se tratar de uma quitinase, o docking foi
realizado com a molécula de quitina (CID 46173706), importada do banco de dados
PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ). A visualização do resultado do
docking foi feita com a ferramenta Phymol v1.7.4 (DELANO, 2002).
3.1.4 Desenho de primers para análise de expressão gênica
Os primers foram desenhados com a ferramenta Primer 3 plus

(UNTERGASSER et al., 2007) (Tabela 2), utilizando como referência os parâmetros
descritos por Thornton e Basu (2011). Os primers desenhados foram analisados
pela ferramenta Oligoanalyzer (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), quanto à
formação de grampos e dímeros.
19
20
Tabela 2: Primers utilizados no PCR em tempo real, seus respectivos tamanhos esperados.
Nome do gene Nome Sequência Tamanho Tm %GC Tamanho Tm predito % GC do

do primer do primer (°C) do para o amplicon
(Pb) amplicon amplicon
(Pb) (°C)
TgPR1 c14Fa CGATGAAAGTTCCACCATTGC 21 54,6 47,6
c14Rs CCGACTATGATTACGCCTCTAAC 23 54,7 47,8 132 72,5 52,27
TgPR5 c68Fa GTGAGATGTGCTCAAATAACCTTC 24 54,0 41,6

c68Rs CCACCGGGACTAACTACAAAG 21 55,0 52,3 144 70,4 38,19
TgPR3 c106F GTTGCCTACAAAGATGTC 18 54,9 47,6

c106R TGAGTACATAGAGCAGAATG 20 54,4 43,4 109 72,4 48,62
TgPR10.1 c173Fs GGAAATCAAGGCTGGCAAAG 20 54,7 50,0

c173Ra AAAGCCACTCGATCTTGTTTAATG 24 53,8 37,5 138 72,1 45,65
TgPR8 c356Fs TCCTCCATGCCAATACAGTAAC 22 54,5 45,4

c356Ra CCGGAATATACCCTCCAGAATAAG 24 54,4 45,8 143 71,6 47,55
TgPR10.2 c516Fa GAGGATGAGCCATAAGGTAAGC 22 55,1 50,0 40,91

c516Rs GTACAAGGCGAAGGAAGGTATC 22 55,1 50,0 110 69,9
TgPTI5 c596Fa ATACTCAAGCCTCTTGCCTTAC 22 54,5 45,4 43,56

c596Rs AATGCACATCGCAACAACTG 20 54,5 45,0 101 71,6
*ACP *ACP_F AGGATGCAGCTGACCTGATT 20 - - - -

*ACP_R AACTTGGGGTGGATTCATCA 20 - - 177
*MDH *MDH_F ATTCAGAAGGGCGTTTCCTT 20 - - - -
*MDH_R CCATAGCACAGGGTTTTGGT 20 - - 164
* Primers previamente desenhados (trabalho não publicado). Tm fornecido pelo fabricante.
21
3.2. Material vegetal
Para o estudo de expressão gênica foram utilizados os genótipos de

cupuaçuzeiro denominados de C174 (resistente à vassoura-de-bruxa) e C1074
(suscetível à vassoura-de-bruxa) (CRUZ et al., 2000). O desafio com o patógeno foi
feito com plantas adultas derivadas de estacas clonais da variedade 1074 e 174 na
estação experimental CEPLAC Belém-PA. Os meristemas apicais de cupuaçuzeiro
foram inoculados com uma gota (30 µl) contendo 1x105 basidiósporos mL-1, de
acordo com Surujdeo-Maharaj e colaboradores (2003). Após a inoculação, a região
do ápice caulinar foi envolvida por sacos plásticos em ambiente saturado de água,
permitindo a germinação dos basidiósporos e consequentemente a infecção do
fungo nas plantas (Frias et al., 1995). O mesmo procedimento foi realizado com as
plantas controle, porém a inoculação foi feita apenas com água. Os meristemas
apicais dos genótipos 1074 e 174 foram coletados nos períodos de 8h, 24h, 48h e
72h após a inoculação (HAI), com três repetições biológicas realizadas com
diferentes indivíduos, denominados planta 1, 2 e 3 para cada tempo. Os meristemas
foram imediatamente armazenados em nitrogênio líquido. Em seguida o material foi
estocado em um freezer a -80 °C.
3.3 Extração de RNA total
Cada meristema apical coletado foi macerado em nitrogênio líquido. 3 mg de

macerado foi utilizado para a extração do RNA total usando o kit RNAqueous®
(Ambion) segundo as recomendações do fabricante. Os RNAs extraídos foram
ressuspendidos em 40 µl de água.
22
3.3.1 Tratamento com DNAse e síntese de cDNA
O tratamento com DNAse foi feito utilizando o kit DNAse I (Invitrogen). Foram
tratados 15 µl de RNA total, em uma reação de 20 µl (volume final), contendo: 2 µl
de tampão (10X), 1,5 µl de DNAse [1 u/µl], 1 µl de RiboLock [20 u/µl] e 0,5 µl de
água. O material foi incubado a 37 °C durante 30 minutos. Em seguida foram
adicionados 4 µl de EDTA [25 mM] e a reação incubada a 65 °C por 10 minutos.
A síntese do cDNA foi feita utilizando o kit de síntese de cDNA RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific), em uma reação com volume final de
60 µl. Inicialmente, 15 µl de RNA tratado com DNAse foi incubado com 3 µl de
Oligo(dT)18 [100 µM] e 12 µl de água em volume final de 30 µl. Esta mistura foi
incubada a 65°C por 5 minutos e em seguida a 4°C. Após a incubação, foram
adicionados à reação 12 µl de tampão 5X, 6,5 µl de Inibidor de RNase RiboLock [20
U/μL], 6 µl de dNTP [10 mM], 6,5 µl da enzima RevertAid RT [200 U/µl] e água qsp
60 µl. A reação foi incubada a 42°C por 60 minutos, e em seguida a 70°C por 10
minutos. O cDNA foi estocado em freezer -80 °C.
3.3.2 Validação do cDNA
Foram separadas alíquotas durante o processo de tratamento do RNA e

síntese do cDNA para a verificação da eficiência dos tratamentos. Amostras de RNA
total, RNA tratado com DNAse, e cDNA foram submetidas a uma reação de PCR
utilizando primers endógeno de cupuaçuzeiro (fator de elongação, actina, tubulina e
GAPDH; Tabela 2). A reação de PCR foi realizada com 5 µl de amostra (cDNA, RNA
e RNA tratado com DNAse), 2 µl de dNTP [2,5 mM], 4 µl [10µM] de primers (foward
e reverse), 0,5 µl de Taq DNA polimerase [5 U/µl], 2 µl de tampão 10X, 1,6 µl de
MgCl2 [25 mM] e 4,9 µl de água. A reação foi incubada nas seguintes condições: I) 5
minutos a 94°C; II) 30 segundos a 94°C; III) 30 segundo a 58°C; IV) 45 segundos a
23
72°C e V) 5 minutos a 72°C. Os passos de II a IV foram repetidos 34 vezes. Os
produtos da reação foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%.
3.4 Teste dos primers
Os primers desenhados foram avaliados quanto a melhor temperatura de

anelamento nas PCR (55°C, 58°C e 62°C). O teste foi realizado utilizando amostras
de DNA genômico de cupuaçuzeiro, variedade 1074 (suscetível), em três reações
(uma para cada temperatura de anelamento indicada) compostas de: 0,13 µl de
dNTP [100 µM]; 0,2 µl de MgCl2 [25 mM], 1,3 µl de tampão 10X; 9,65 µl de água; 0,2
µl de Taq DNA polimerase [5 U/µl] (Fermentas); 1 µl de DNA genômico [10 ng] e 0,6
µl de cada primer [10 µM] (foward e reverse). As reações foram realizadas em
termociclador Bio-Rad T100™ Thermal Cycler, utilizando-se o programa de
amplificação: I) 5 minutos a 94°C; II) 30 segundos a 94°C; III) 45 segundos a 55°C
ou 58°C ou 62°C; IV) 30 segundos a 72°C; e V) 5 minutos a 72°C com 30 repetições
do ciclo II ao IV. Os produtos da reação foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 1,5%.
3.5 Cálculo de eficiência dos primers
A eficiência dos primers foi calculada utilizando o software MINER 4.0 (ZHAO;
FERNALD, 2005) de acordo com a cinética da reação, por meio de um algoritmo de
regressão não linear iterativa, na porção exponencial da curva de amplificação. Este
método permite a determinação da eficiência e Ct de cada reação (poço),
individualmente, descartando a interferência de ruídos e a necessidade de uma
curva padrão. A eficiência considerada foi resultante da média das eficiências de
cada par de primer em todas as reações (todos os cDNAs utilizados no
experimento).
24
3.6 Reações de PCR em tempo real
A PCR em tempo real foi feita no termociclador Eppendorf Realplex4

(Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), utilizando o respectivo software. Na reação
utilizou-se o reagente SYBR Green Taq ReadyMix (D5191, Sigma-Aldrich) e um
normalizador de sinal de fluorescência, ROX (R4526, Sigma-Aldrich). A reação foi
feita em uma placa de 96 poços, utilizando 5 µl de SYBR green Taq ReadyMix, 0,1
µl de ROX, 0,5 µl de Primer (foward e reverse, na concentração de 10 µM) e 4,4 µl
de cDNA na diluição de 20X [230ng], em um volume final de 10 µl. O programa
utilizado foi de 95°C por 2 minutos, seguido de 45 ciclos de 95°C por 15 segundos,
55°C por 15 segundos e 60°C por 45 segundos. Ao final foi adicionada uma etapa de
curva de dissociação com os parâmetros estabelecida pelo software.
Os ensaios foram feitos em triplicata técnica e biológica (planta 1, 2 e 3). Um

controle negativo, sem cDNA, foi utilizado para cada um dos genes em estudo,
incluindo os genes de referência.
3.7 Escolha dos normalizadores
O trabalho foi feito utilizando 3 genes de referência: ACP (proteína carreadora

de acil), MDH (malato desidrogenase) e TUB (tubulina) (comunicação pessoal,
Marcellino, LH, 2013). Para aferir a estabilidade de expressão dos referidos genes
nas amostras em estudo, um primeiro ensaio com 3 pools de amostras para cada
genótipo foi feito: pool I) Não inoculado; pool II) 8 h e 24 h (planta 1, 2 e 3); e pool III)
48 h e 72 h (planta 1, 2 e 3). Ao final os dados de fluorescência foram analisados no
MINER 4.0 para a obtenção dos Cts. Para o cálculo de estabilidade de expressão
dos genes, os valores dos Cts foram convertidos através da equação 2 Ct, e a
estabilidade definida utilizando a ferramenta NormFinder (ANDERSEN; JENSEN;
ØRNTOFT, 2004). Adicionalmente, a estabilidade de expressão dos genes de
referência no material em estudo foi também definida utilizando o valor de 2Ct de
todas as amostras, individualmente, no NormFinder. A melhor combinação (ACP e
MDH) foi utilizada para o cálculo de expressão relativa.
25
3.8 Cálculo de expressão relativa
Os dados brutos de fluorescência foram analisados no software MINER 4.0,

obtendo-se o Ct e a eficiência. A média do Ct da triplicata técnica de cada gene foi
utilizada para o cálculo de expressão relativa utilizando o software REST-2009, onde
a expressão é calculada com base no método de Pfaffl (2001) e analisadas
estatisticamente (teste de P), para validar se houve ou não diferença significativa
dos niveles de expressão em relação à amostra controle. O cálculo foi feito com os
genes de referência ACP e MDH, e as respectivas eficiências, e os genes em estudo
com as respectivas eficiências.
Modelo da equação do calculo da expressão relativa segundo Pfaffl. A expressão relativa é dada pela
eficiência do gene de interesse elevado a diferença entre o ct do gene de interesse da amostra
controle e tratada dividido pela eficiência do gene de referência elevado a diferença do seu ct nas
amostras controle e tratadas.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Análises in silico
Com intuito de caracterizar e identificar proteínas de cupuaçuzeiro envolvidas

na interação planta-patógeno, foram selecionadas 12 sequências similares a
proteínas do tipo PR a partir de um banco de dados contendo sequências de mRNA
de cupuaçuzeiro. Dentre as 12 sequências analisadas, apenas sete (C_14, C_68,
C_173, C_356, C_516 e C_596) apresentaram ORF’s que geraram proteínas
completas (Tabela 3). Estas sequências foram comparadas ao banco de dados do
genoma do cacau e os resultados do BLAST mostraram uma alta identidade, acima
de 87%, com proteínas descritas nesse banco (Tabela 3). Em particular, as
sequências das ORF’s de cupuaçuzeiro denominadas C_14, C_68, C_173, e C_516
26
apresentaram uma identidade acima de 90%, indicando que são altamente
conservadas entre os dois organismos, o que está de acordo com o esperado por se
tratar de organismos pertencentes ao gênero Theobroma.
Tabela 3: Resultado do alinhamento feito pelo BLASTp no genoma do cacau. Observa-se uma alta
similaridade entre as proteínas do cupuaçuzerio em relação às proteínas do cacaueiro.
Sequência de Locus Função putativa Identidade

cupuaçu %
C_14 (TgPR1) Tc02_g002390 Pathogenesis-related protein 1 93,79
C_68 (TgPR5) Tc03_g027010 Thaumatin-like protein 92,41
C_106 (TgPR3) Tc06_g000490 Putative Endochitinase 87,89
C_173 (TgPR10.1) Tc01_g031100 Pathogenesis-related protein STH-2 100
C_356 (TgPR8) Tc01_g032120 Acidic endochitinase 84,26
C_516 (TgPR10.2) Tc04_g028750 Putative Major allergen Pru av 1 97,89
C_596 (TgPTI5) Tc06_g015010 Pathogenesis-related genes 89,47
transcriptional activator PTI5
Para melhor compreensão das características das proteínas em estudo, foi

realizada uma avaliação das famílias proteicas por análise dos domínios
conservados. O resultado do BLASTp, associado ao CDD no NCBI, mostrou que as
sequências pertencem a diferentes famílias de proteínas (Tabela 4). A sequência
C_14 pertence à família chamada SCP (sperm ciating protein). Esta família abrange
as proteínas PR1, que embora não tenha o seu mecanismo de ação definido, possui
um domínio característico chamado domínio CRISP (Cysteine-rich Secretory
Protein), normalmente presentes em proteínas secretadas em mamíferos e no
alergeno 5 de vespídeos (GIBBS; O’BRYAN, 2007; GIBBS et al., 2008). A proteína
C_68 pertence à família das taumatinas. Esta família é bastante estudada e inclui
proteínas PR5 e osmotinas, ambas com potencial antifúngico. A proteína oriunda da
sequencia C_106 trata-se de uma quitinase, proteínas normalmente envolvidas na
degradação de polímeros de quitina (ROBERTUS; MONZINGO, 1999). As
sequências C_173 e C_516 pertencem à família (Bet_v1) que inclui proteínas PR-
10, podendo estar associada a atividade ribonucleásica (CHADHA; DAS, 2006). A
sequência c356 pertence ao grupo das quitinases classe III e lisozimas, proteínas
que podem estar envolvidas na degradação da parede celular de fungos
(FUKAMIZO, 2000). A sequência C_596 pertence à família AP2, que incluem fatores
27
de transcrição envolvidos na via metabólica de resposta ao etileno,
consequentemente pode estar envolvidas nos mecanismos de defesa da planta
induzindo proteínas PR (OHME-TAKAGI et al., 2000).
Tabela 4: Resultado das análises feitas no NCBI onde a terceira coluna mostra o tamanho da ORF e
a ultima mostra a família proteína a qual a sequência pertence com base no CDD.
Sequência Sequência do mRNA (nt) ORF (aa) Família da proteína

C_14 (TgPR1) 664 161 SCP-PR1_like
C_68 (TgPR5) 950 224 Thaumatin
C_106 (TgPR3) 1239 322 Chitinase_glyco_hydro_19
C_173 (TgPR10.1) 825 158 Bet_v1-Like
C_356 (TgPR8) 1111 309 GH18_hevamine_XipI_class_III
C_516 (TgPR10.2) 659 142 Bet_v1_like
C_596 (TgPTI5) 935 171 AP2
nt: nucleotídeos, aa: aminoácidos.
Utilizando como referência a classificação descrita por Edreva (2005),

Ebrahim e colaboradores (2010) e SINHA e colaboradores (2014) para proteínas do
tipo PR (Tabela 1, Revisão), e associado aos dados obtidos anteriormente por
comparação ao banco de dados NCBI e CocoaGenDB, as proteínas de
cupuaçuzeiro foram classificadas (Tabela 6).
A proteína encontrada na sequência C_14 foi denominada como TgPR1, com

base nos dados obtidos pelo CDD(Conserved Domain Database) e sua alta
similaridade com uma PR1 de cacaueiro. Para a proteína originária da sequência
C_68 foi dado o nome de TgPR5 por possuir características condizentes as
proteínas do tipo PR5 descritas na literatura. A família PR3, PR4 e PR11 incluem
quitinases do tipo I e segundo a revisão de SINHA e colaboradores (2014), as
proteínas da família PR3 são endoquitinases e possuem um peso molecular de 25-
35 kDa. O resultado do alinhamento com o banco de dados do cacau mostra que a
proteína predita através da sequência C_106 tem um alta similaridade com uma
endoquitinase e peso molecular predito de 35,5 kDa. Assim a proteína presente na
sequencia C_106 foi denominada TgPR3.
28
As proteínas oriundas das sequências C_173 e C_516 foram denominadas
TgPR10.1 e TgPR10.2 respectivamente. Ambas foram associadas à mesma família,
por possuírem um domínio BETv1, característico das proteínas PR10. O resultado
do alinhamento no banco de dados do cacau mostra que as proteínas compõem
uma família multigênica presente em cromossomos diferentes. A proteína da
sequência C_356 foi denominada TgPR8 por terem sido identificados domínios
conservados (CDD) de quitinases do tipo III. Segundo SINHA e colaboradores
(2014), as proteínas da família PR8 incluem quitinases do tipo III.
A proteína da sequência C_596 pertence à família AP2, um fator de

transcrição comumente envolvido na via metabólica de resposta ao etileno. Os
resultados do alinhamento com o banco de dados do cacau mostram que a
sequencia C_596 teve uma alta similaridade com a proteína TcPTI5, um fator de
transcrição ativador de proteínas relacionadas a patogênese. Assim, a proteína
deduzida a partir da sequência C_596 foi denominada TgPTI5.
Para uma melhor caracterização foi realizada a predição de ponto isoelétrico,

peso molecular (Compute pI/Mw), presença de peptídeo sinal (SignalP) e
modificações pós-traducionais para cada proteína (NetNGlyc, NetPhos e NetAcet)
(Tabela 5). Onde se observa uma característica em comum entre as proteínas PR
que é o seu baixo peso molecular, o que em alguns casos implica diretamente em
sua classificação, além disto, o peptídeo sinal pode revelar dados importantes como
o endereçamento da proteína. Os sítios de fosforilação, acetilação e glicosilação dão
pistas sobre as modificações pós traducionais, conformação, estabilidade e até
possíveis sítios de interação com outras moléculas.
29
Tabela 5: Predição do peso molecular, ponto isoelétrico e sítios, de glicosilação, fosforialção e acetilação e presença ou ausência de peptídeo sinal e seu
respectivo tamanho.
Sequência Ponto isoelétrico Peso molecular Sitio de glicosilação Sitio de acetilação Sitio de fosforilação Peptídeo sinal
C_14 5.87 17,3 kDa - - S6, S63, S68, S87, S107, T16, 24aa
(TgPR1) Y10, Y56, Y83, Y85
C_68 6.68 24,2 kDa N163 S3 S118, S139, S161, S176, T143, 23aa
(TgPR5) T256, Y137, Y239
C_106 6.64 35,5 kDa N20, N171, N207 - S37, S41, S114, S123, S193 26aa
(TgPR3) T91, T99, T185, T205, T219,
T240
Y62, Y119, Y124, Y126, Y145,
Y167
C_173 5.57 17,5 kDa - - S37, S99, S117, T4, Y66 -
(TgPR10.1)
C_356 4.27 33,3 kDa N145 - S77, S95, S147, S266 29aa
(TgPR8) T15, T41, T88
Y66, Y99, Y134, Y149, Y162,
Y227
C_516 5.13 16,1 kDa N40 - S20, S23, S80, S82, S101 -
(TgPR10.2) Y49, Y90
C_596 8.85 18,8 kDa N16, N49, N140 S5 S32, S45, S113, S160, S169, -
(TgPTI5) S170, S172, S173, S180, S183,
S188, S190, S192, S194, S195,
T14, T27, Y51
kDa: kilo Dalton, aa: aminoácidos, - não possui.
30
A predição da localização celular foi realizada, utilizando o software Multiloc2-
HigRes, os resultados são apresentados na Tabela 6. As proteínas TgPR1, TgPR3 e
TgPR5 apresentaram localização extra celular. Estando de acordo com o ponto
isoelétrico ácido comum em proteínas com este tipo de localização (DORE et al.,
1991), além da existência de um peptídeo sinal.
As proteínas TgPR10.1 e TgPR10.2 apresentaram localização citoplasmática,

reforçada pela ausência do peptídeo sinal, característica de algumas proteínas do
tipo PR10 (AGARWAL; AGARWAL, 2014). A proteína TgPR8 possui uma
localização vacuolar, e a TgPTI5 apresenta uma localização nuclear, o que está de
acordo com a possível função como um fator de transcrição.
Tabela 6: Classificação nas famílias PR, nomeação das proteínas de cupuaçuzeiro e localização
celular das mesmas.
Sequência Classificação Nome Localização da proteína Probabilidade

C_14 PR-1 TgPR1 Extracelular 96%
C_173 PR-10 TgPR10.1 Citoplasmática 94%
C_356 PR-8 TgPR8 Vacuolar 95%
C_516 PR-10 TgPR10.2 Citoplasmática 80%
C_596 AP2 (fator de TgPTI5 Nuclear 58%
transcrição)
4.1.2 Ontologias gênicas
Para identificar os possíveis processos biológicos nos quais as proteínas em

estudo estão envolvidas, foi realizada a análise de ontologias gênicas. Para tal, uma
busca por genes ortólogos no banco de dados STRING foi realizada. Identificou-se
proteínas ortólogas em Arabidopsis thaliana para as proteínas TgPR1, TgPR3,
TgPR5, TgPR8 e TgPTI5 (Tabela 7). Para as proteínas TgPR10.1 e TgPR10.2 não
foram encontrados ortólogos correspondentes em A. thaliana. Em seguida os
ortólogos foram importados para o software Cytoscape v3.0.2 e analisados quanto
31
aos processos biológicos no plugin BiNGO. Os resultados gerados estão
apresentados na Tabela 8. A proteína CHIB1, ortóloga de TgPR8, não apresentou
ontologias quanto ao processo biológico.
Tabela 7: Tabela com as proteínas ortólogas entre cupuaçuzeiro e A. thaliana e suas similaridades.
Proteína Ortólogo Referencia Similaridade

TgPR1 ATPRB1 (SANTAMARIA et al., 75%
2001)
TgPR3 POM1 (SANCHEZ- 82%
RODRIGUEZ et al.,
2012)
TgPR5 ATOSM34 (CAPELLI et al., 1997) 66%
TgPR8 CHIB1 - 57%
TgPR10.1 - - -
TgPR10.2 - - -
TgPTI5 ATERF-1 (RIOJA et al., 2013) 52%
Tabela 8: Processos biológicos no qual as proteínas estão envolvidas gerados pelo BiNGO.
Ortólogo entre A. thaliana e T. Processo biológico

grandiflorum
POM1 (TgPR3) Processo de regulação do sistema imune
OSM32 (TgPR5)
ATPRB1 (TgPR1)
ATPRB1 (TgPR1) Resposta a estimulo de temperatura
ATREF1 (TgPTI5) Resistência sistêmica adquirida
OSM34 (TgPR5) Resposta a estresse: osmótico, oxidativo, calor.
Resposta imunológica
POM1 (TgPR3) Processo metabólico de glucanos celulares, compostos de
nitrogênio, de enxofre, de polissacarídeos.
Regulação do processo de resposta a estímulos bióticos
Resposta a estímulos de ácido jasmônico
Resposta à intensidade de luz
POM1 (TgPR3) Resposta a ferimento
ATPRB1(TgPR1)
ATREF1 (TgPTI5)
POM1 (TgPR3) Resistência sistêmica induzida, mediada à via de sinalização
ATREF1 (TgPTI5) de ácido jasmônico
Os resultados obtidos através da análise dos genes ortólogos, mostram que

as proteínas em estudo podem desempenhar papeis importantes no metabolismo da
planta, atuando em resposta a estresses e estímulos bióticos e abióticos. Em
particular podemos observar que os ortólogos de TgPtI5 e TgPR3 atuam na
32
resistência sistêmica induzida (RSI) mediada a via de sinalização do ácido
jasmônico e que possivelmente estes genes podem atuar em conjunto na resposta
ao ataque de patógenos e/ou no mesmo processo metabólico (Figura 3).
Figura 3: Rede dos processos metabólicos e proteínas ortólogas envolvidas.
4.1.3 Predição da estrutura das proteínas
A modelagem foi realizada com a ferramenta SWISS-MODEL (ARNOLD;

BORDOLI; SCHWEDE, 2006). Através de uma busca por proteínas já descritas em
banco de dados disponíveis no PDB (Protein Data Bank), as proteínas que
apresentaram maior cobertura e identidade em relação a sequencia de cupuaçu,
foram selecionadas como molde (Tabela 9). Observa-se que todas as proteínas
apresentaram uma identidade acima de 25% o que aumenta a probabilidade destas
proteínas terem uma estrutura semelhante com a estrutura molde correspondente,
segundo OSWALDO (2003). Para a validação do modelo predito com os softwares
33
Pocheck é esperado que 90% dos aminoácidos estejam localizados nas regiões
muito favoráveis e favoráveis (LASKOWSKI et al., 1993). O ProSA (WIEDERSTEIN;
SIPPL, 2007) exibem uma estrutura onde as regiões de maior e menor energia são
destacadas em uma escala de azul (menor energia) e vermelho (maior energia),
indicando as regiões com possíveis erros (choque de aminoácidos) no modelo
predito. Além de analisar a integridade do modelo predito, o ProSA compara a
energia modelo predito com outros modelos do mesmo tamanho em banco de dados
(pontos azuis claro e escuro), sendo que o valor de Z-score tende a ser negativo
para um bom modelo.
Tabela 9: Proteínas depositadas no PDB com maior similaridade com as proteínas de cupuaçuzeiro.
Proteína Molde PDB Organismo Identidade

TgPR1 1CFE Solanum lycopersicum 64,23%
TgPR5 4L2J Calotropis procera 76,12%
TgPR3 2DKV Oryza sativa Japonica 38,35%
TgPR10.1 4C94 Fragaria x ananassa 54,78%
TgPR8 1LLO Hevea brasiliensis 63,70%
TgPR10.2 4C94 Fragaria x ananassa 52,14%
TgPTI5 3GCC Arabidopsis thaliana 84,13%
O modelo da proteína TgPR1 é composto por 4 hélices-α e duas folhas-β e 8

alças (Figura 4a). No gráfico de Ramachandran gerado pelo Procheck para TgPR1
(Figura 4c) mostra que 84,4% dos aminoácidos foram alinhados na regiões mais
favoráveis, 17% na região favorável, 0,9% na região pouco favorável e 1,8% na
região desfavorável, uma evidência que o modelo predito possui alguns erros quanto
ao ângulo de torção de alguns aminoácidos, porém pode ser considerado como um
bom modelo. Com base na análise do ProSA, observa-se na representação
estrutural (Figura 4b) as regiões com melhor alinhamento com base no níveis de
energia, em uma escala de azul até vermelho, onde as regiões em azul são as mais
bem alinhadas e as regiões em vermelho com possíveis erros. Foi possível
identificar três regiões marcadas em vermelho na estrutura (Figura 4b) o que é
complementada pelos três aminoácidos localizados na região desfavorável
mostradas no gráfico de Ramachandran (Figura 4c). Estes resultados indicam que
34
estes três aminoácidos podem estar posicionados de forma errada ocorrendo
choque de aminoácidos. A pontuação do Z-score (Figura 4d) mostra que a proteína
TgPR1 está em conformidade com proteínas semelhantes descritas em banco de
dados.
Figura 4: Predição da estrutura da proteína TgPR1 a) modelo tridimensional (cartoon) da proteína

TgPR1. b) modelo indicando as regiões com melhor (azul) e pior (vermelho) nível de energia na
estrutura da proteína. c) Gráfico de Ramachandran com a localização dos Residuos de aminoácidos.
35
A proteína TgPR3 (Figura 5a), teve 82,7% do aminoácidos dispostos nas
regiões muito favoráveis, 14,7% nas regiões favoráveis, 0,4% nas regiões pouco
favoráveis e 2,2% nas regiões desfavoráveis o que corresponde a 5 aminoácidos
(Figura 5c). O ProSA mostrou que algumas regiões não tiveram bons níveis de e
energia, como é o caso de uma alça em formato de z (Figura 5b). O Z-score (Figura
5d) mostra que a proteína TgPR3 tem uma semelhança com outras proteínas com o
mesmo tamanho já descritas. Os resultados mostram que apesar de ser um modelo
válido, pois possui mais de 90% dos aminoácidos nas regiões favoráveis, porém há
regiões com choque de aminoácidos, o que se faz necessário uma minimização de
energia para corrigir os erros do modelo. O modelo da proteína TgPR3 é composta
por 11 hélices-α e 12 alça (Figura 5a), podendo ser caracterizada como uma
proteína de classe α, uma peculiaridade deste modelo é a ausência de folhas-β, o
que caracteriza uma proteína com regiões estáveis.
36
O modelo TgPR5 teve 87% de aminoácidos na região muito favorável, 11,8%

na região favorável, 0,6% na região pouco favorável e 0,6%, na região desfavorável
(Figura 6c). O resultado mostra que a proteína TgPR5 é um modelo de boa
qualidade. A análise do ProSA mostra que a proteína TgPR5 possui regiões de alta
37
energia, o que caracteriza possíveis erros na estrutura (Figura 6b). O Z-score gerado
pelo ProSA (Figura 6d) mostra que o modelo predito está em conformidade com
modelos semelhantes já descritos em banco de dados. O modelo da proteína TgPR5
por mostrar uma boa qualidade foi utilizado para ensaios in silico (docking), embora
para uma melhor validação e correção do modelo, seja necessário realizar uma
minimização de energia. Este modelo possui 13 folhas-β, 6 pequenas hélices-α e 19
alças (Figura 6a). O modelo tem como peculiaridade uma região rica em folhas-β
formando grampos-β e outra região com hélices-α visivelmente separadas em
regiões na proteína (Figura 6a).
38
A proteína TgPR8 teve 88,5% dos seus aminoácidos na região altamente

favorável, 11,1% na região favorável e 0,4% na região pouco favorável e nenhum
aminoácido na região desfavorável (Figura 7c), sendo este o modelo com a melhor
39
pontuação. O ProSA mostrou que o modelo predito possui poucas regiões de alta
energia, isto é coradas em vermelho (Figura 7b), já o seu Z-score (Figura 7d)
apresenta conformidade com as demais proteínas já descritas. A proteína TgPR8 é
composta por 9 folhas-β, 10 helices-α e 18 alças com uma conformação do tipo
barril, onde há um orifício composto de folhas-β circulado por hélices-α (Figura 7a).
O modelo da proteína TgPR8 é considerado um bom modelo pois possui mais de
90% dos aminoácidos nas regiões favoráveis. Estruturalmente a TgPR8 apresenta
uma conformação onde as suas extremidades são compostas por estruturas com
ligações mais rígidas (hélices-α), em quanto o seu centro é composto por estruturas
com ligações mais flexíveis (folhas-β).
40
O gráfico de Ramachandran (Figura 8c) mostra que para o modelo estrutural

predito para a proteína TgPR10.1, 82,1% dos aminoácidos estão localizados na
região altamente favorável, 13,8% na região favorável, 1,4% na região pouco
favorável e 0,7% na região desfavorável, sendo assim uma bom modelo pois mais
de 90% dos seus aminoácidos estão em regiões favoráveis. Algumas regiões de alta
41
energia foram encontrados no modelo predito por meio do ProSA (Figura 8b) o que
indica que algumas regiões do modelo podem conter erros, o z-score indica que o
modelo da proteína TgPR10.1 está de acordo com os modelos do mesmo tamanho
já descritos em banco de dados (Figura 8d). A proteína TgPR10.1 é composta por 3
hélices-α, 7 folhas-β e 10 alças (Figura 8a). A proteína TgPR10.1 possui uma região
com 6 folhas-β interligadas na forma de grampos-β que circundam uma grande
folha-β (Figura 8a).
42
Figura 8: Predição da estrutura da proteína TgPR10.1 a) modelo tridimensional (cartoon) da proteína
TgPR10.1. b) modelo indicando as regiões com melhor (azul) e pior (vermelho) nível de energia na
43
A proteína TgPR10.2 teve 82,4% dos aminoácidos na região altamente
favorável, 16% na região favorável, 0,8% na região pouco favorável e 0,8% na
região desfavorável (Figura 9c) o que condiz com um bom modelo predito. O ProSA
mostrou 3 regiões de alta energia (Figura 9b), que condiz com os 3 aminoácidos
mostrados em vermelho no gráfico de Ramachandran ( Figura 9c) e apresentou um
Z-score dentro do esperado para as proteínas já descritas (Figura 9d). A proteína
TgPR10.2 é composta por 2 hélices-α, 6 folhas-β e 8 alças(Figura 9a). A proteínas
TgPR10.2 tem uma hélice-α e uma folha-β a menos que a TgPR10.1 porém ambas
possuem estruturas muito similares.
44
Figura 9: Predição da estrutura da proteína TgPR10.2 a) modelo tridimensional (cartoon) da proteína
TgPR10.2. b) modelo indicando as regiões com melhor (azul) e pior (vermelho) nível de energia na
45
A proteína TgPTI5 apresentou 75,9% os aminoácidos na região altamente favorável,
22,2% na região favorável, 1,9% na região pouco favorável e nenhum aminoácido na
região desfavorável (Figura 10c). A TgPTI5 apresentou 3 regiões com alta energia
(Figura 10b), que também foram destacados no gráfico de Ramachandran (Figura
10c), o que significa que os ângulos de torção podem estar incorretos. A proteína
TgPTI5 possui uma hélice-α, 3 folhas-β e 5 alças (Figura 10a) e apresentou um bom
Z-score (Figura 10d).
46
Figura 10: Predição da estrutura da proteína TgPTI5 a) modelo tridimensional (cartoon) da proteína
TgPTI5. b) modelo indicando as regiões com melhor (azul) e pior (vermelho) nível de energia na
47
4.1.4 Teste de docking
Um teste de docking através da ferramenta AutoDock tools foi feito para a

proteína TgPR5. Por ser uma possível quitinase a proteína TgPR5 foi testada com
uma molécula de quitina (CID 46173706), para verificar a interação entre estas duas
moléculas. O resultado do docking ocorreu na cavidade descrita em outros trabalhos
para osmotinas e PR-5 (ANŽLOVAR; DERMASTIA, 2003) (resíduos de aminoácidos
E85, D98, D103, D186 da proteína de tabaco 1AUN), correspondentes aos resíduos
E106, D116, D124, D205 (Figura 11) da proteína TgPR5. A molécula de quitina teve um
encaixe nos resíduos E106 e D205. O nível de afinidade da proteína TgPR5 e a
molécula de quitina foi de -6,3 kcal/mol (Tabela 10). É possível observar que o
aminoácido E106 se destaca por interagir com a molécula de quitina em todos os 5
modos (Figuras12, 13 e 14). Os resultados mostram que a proteína TgPR5 tem um
potencial de interação com a quitina e possivelmente pode apresentar atividade de
quitinase in vitro.
Figura 11: Modelo cartoon da proteína TgPR5 e seu possível sítio ativo e respectivos aminoácidos
correspondentes.
48
Figura 12: a) Proteína TgPR5 representada em sua conformação espacial em cinza, sítio ativo em
vermelho e molécula de quitina em amarelo no modo 1 com afinidade de -6,3 Kcal/mol. b)
representação em cartoon da proteína TgPR5 em cinza, sítio ativo em vermelho e molécula de quitina
em amarelo no modo 1 com afinidade de -6,3 Kcal/mol. c) Proteína TgPR5 representada em sua
conformação espacial em cinza, sítio ativo em vermelho e molécula de quitina em amarelo no modo 2
com afinidade de -6,3 Kcal/mol b) representação em cartoon da proteína TgPR5 em cinza, sítio ativo
em vermelho e molécula de quitina em amarelo no modo 2 com afinidade de -6,3 Kcal/mol.
49
em amarelo no modo 3 com afinidade de -6,2 Kcal/mol. c) Proteína TgPR5 representada em sua
conformação espacial em cinza, sítio ativo em vermelho e molécula de quitina em amarelo no modo 4
com afinidade de -6,0 Kcal/mol b) representação em cartoon da proteína TgPR5 em cinza, sítio ativo
em vermelho e molécula de quitina em amarelo no modo 4 com afinidade de -6,0 Kcal/mol.
50
em amarelo no modo 5 com afinidade de -5,9 Kcal/mol.
Tabela 10: Resultado da afinidade da molécula de quitina no sítio ativo da proteína TgPR5 em 5
posições diferentes.
Modo afinidade (Kcal/mol)

Modo 1 -6,3
Modo 2 -6,3
Modo 3 -6,2
Modo 4 -6,0
Modo 5 -5,9
51
4.2. ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA
4.2.1 Validação do tratamento com DNAse e síntese de cDNA
Os testes de validação do tratamento com DNAse e síntese de cDNA foi feito

através de PCR utilizando primers para os seguintes genes de cupuaçuzeiro: Fator
de elongação (EFA), Actina (ACT), tubulina (TUB), gliceraldeido-3-fosfato
desidrogenase (GAPDH). Utilizou-se como template nas reações: a) RNA total (não
tratado com DNAse), b) RNA tratado com DNAse e c) cDNA, escolhidos
aleatoriamente entre as amostras. Foi observado que a reação contendo RNA não
tratado gera amplicons, indicando a presença de DNA genômico (Figura 15 poço 1,
12 poço 4, 12 poço 7, 12 poço 10) a reação com RNA tratado com DNAse não
apresentou nenhum fragmento, indicando que o tratamento com DNAse foi efetivo
(Figura 15 poço 2, 12 poço 5, 12 poço 8, 12 poço 11). O resultado da PCR com o
cDNA mostrou a amplificação de fragmentos com o tamanho esperado,
confirmando, assim, a síntese do cDNA (Figura 15 poço 3, 12 poço 6, 12 poço 9, 12
poço 12 ). Este teste mostrou que todos os passos para a síntese do cDNA tiveram
êxito.
Figura 15: Eletroforese em gel de agarose a 1% para avaliação da síntese de cDNA. M) marcador de
peso molecular 1Kb Ladder, poços 1, 4, 7 e 10 amostra de RNA total não tratada com DNAse, poços
2, 5, 8, 11 amostra de RNA tratado com DNAse, poços 3, 6, 9, 12 amostra de cDNA.
52
4.2.2 Teste dos primers dos genes de interesse
O teste de temperatura de anelamento dos primers desenhados mostrou que

os primers amplificam na temperatura de 62 °C, exceto o primer c106 (Figura 16); na
temperatura de 58 °C (Figura 17) e 55 °C (Figura 18). Nota-se que, em todas as
temperaturas de anelamento testadas, não houve amplificação inespecífica e os
tamanhos dos fragmentos correspondem ao esperado. A temperatura de
anelamento escolhida para o PCR em tempo real foi a de 55 °C, por não apresentar
amplificações inespecíficas e uma amplificação mais uniforme para todos os genes
em estudo.
62°C
Figura 16: Gel de agarose a 1% para o teste de amplificação a 62 °C com os primers desenhados
para os genes em estudo. Nota-se que o primer para o gene c106 não apresentou amplificação.
53
58°C
para os genes em estudo. Nota-se que o primer para o gene c106 gerou uma fraca amplificação.
55°C
para os genes em estudo. Nota-se que todos os primers apresentaram amplificação correspondente
ao tamanho esperado.
54
4.2.3 Teste de eficiência dos primers
O cálculo da eficiência dos primers é essencial para a análise de expressão

relativa. Neste trabalhou utilizou-se o método de ZHAO; FERNALD (2005) (MINER
4.0) que calcula a eficiência dos primer na reação, dispensando uma curva de
eficiência. Os dados de fluorescência da placa contendo todos os primers, referentes
a todos os genes em estudo incluindo os de referência (1074 e 174 Não inoculado),
foram analisados através do MINER4.0, onde se observa uma eficiência entre 90 e
100% (Tabela 11).
Todos os tempos de coleta e cDNAs analisado por PCR em tempo real

tiveram sua eficiência calculada. A média da eficiência de todas as placas foi
calculada para cada primer e genótipo, esta média foi utilizada para o cálculo de
expressão relativa através da ferramenta REST 2009. O método de análise de
expressão relativa do REST 2009 segue o modelo proposto por Pfaffl (2001), onde
se considera a eficiência dos primers no cálculo. Este método foi escolhido por levar
em consideração a eficiência dos primers, e assim aumentar a reprodutibilidade do
experimento, uma vez que há uma variação maior que 5% na eficiência dos primers
em relação aos normalizadores. O método do 2 DDct proposto por Livack e Schmittgen
(2001) considera uma eficiência de 100% para todos os primers, sendo que o
recomendado para a utilização deste método é que a variação da eficiência dos
primers seja menor ou igual a 5% (Bio-Rad 2006).
Tabela 11: Média da eficiência dos primers nos genótipos resistente (174) e suscetível (1074).
primer c14 c68 c106 c173 c356 c516 c596 ACP* MDH*
genótipo 174 100% 99% 102% 94% 95% 95% 96% 92% 95%
genótipo 1074 95% 98% 102% 94% 95% 93% 93% 93% 91%
*genes de referência: Proteína carreadora de acil (ACP) e malato desidrogenase (MDH)
55
4.2.4 Seleção dos normalizadores
Os genes ACP, MDH e TUB foram analisados quanto a sua estabilidade em

uma placa com 3 mixes de amostras para cada genótipo, I) Não inoculado, II) 8 h e
24 h planta 1, 2 e 3, III) 48 h e 72 h Planta 1, 2 e 3. O resultado foi analisado pelo
NormFinder. A melhor combinação obtida foi com o uso dos genes ACP e MDH
(Tabela 12), com um valor de estabilidade de 0,606. Após a obtenção dos dados de
todos os ensaios, um novo teste de estabilidade foi feito utilizando o mesmo
software, onde o resultado foi um valor de estabilidade melhor, e a mesma
combinação dos genes mais estáveis foi encontrada como mostra a Tabela 13.
Tabela 12: Teste de estabilidade dos genes de referência, calculado com a ferramenta NormFinder.
Observa um valor de estabilidade de 0,606 para a combinação ACP e MDH.
Gene Valor de estabilidade

ACP 1,442
MDH 0,877
TUB 0,653
Melhor combinação 0,606
ACP e MDH
Tabela 13: Teste de estabilidade dos genes de referência, calculados pelo ferramenta Norm finder.
Observa-se um valor de estabilidade de 0,369 para a combinação ACP e MDH.
Gene Valor de estabilidade

ACP 0,468
MDH 0,571
TUB 0,413
Melhor combinação 0,369
ACP e MDH
56
4.2.5 Curva de dissociação
A curva de dissociação foi feita ao final de reação de PCR em tempo real,

para todas as placas. Os valores de TM dos primers em todas as placas foram
selecionados e calculados a média do TM dos primers em todas as placas, para
cada genótipo, junto com o desvio padrão do TM de cada primer como mostra a
Tabela 14. As curvas de dissociação não apresentam ombros ou outras anomalias,
indicando que não houve formação de dímeros ou amplificações inespecíficas
(Figura 19).
A análise de eletroforese em gel de agarose a 1,5% (Figura 20) mostra que

não houve diferença entre os fragmentos amplificados quanto ao tamanho e número
de bandas esperadas em relação aos dois genótipos em estudo.
Tabela 14: Média do TM de cada primer e genótipo e seus respectivos desvios padrão.
Primer Genótipo Media TM °C Desvio padrão

c14 (TgPR1) 1074 85,21 ±0,30
c14 (TgPR1) 174 84,88 ±0,32
c68 (TgPR5) 1074 79,09 ±0,49
c68 (TgPR5) 174 78,68 ±0,52
c106 (TgPR3) 1074 82,78 ±0,33
c106 (TgPR3) 174 82,39 ±0,29
c173 (TgPR10.1) 1074 83,22 ±0,38
c173 (TgPR10.1) 174 82,73 ±0,33
c356 (TgPR8) 1074 82,67 ±0,52
c356 (TgPR8) 174 82,74 ±0,24
c516 (TgPR10.2) 1074 79,69 ±0,46
c516 (TgPR10.2) 174 79,34 ±0,37
c596 (TgPTI5) 1074 81,12 ±0,34
c596 (TgPTI5) 174 80,65 ±0,39
ACP 1074 83,56 ±0,35
ACP 174 83,09 ±0,23
MDH 1074 80,18 ±0,54
MDH 174 79,81 ±0,41
TUB 1074 84,08 ±0,39
TUB 174 84,06 ±0,24
57
Figura 19: Gráfico da curva de dissociação dos amplicons gerados com os primers em estudo. Os
formatos dos gráficos indicam que não houve formação de dímeros ou amplificações inespecíficas.
58
Figura 20: Eletroforese em gel de agarose (1,5%) dos produtos de PCR obtidos com os primers em
estudo A) genótipo 174 (resistente) B) genótipo 1074 (suscetível). M) Marcador de peso molecular
1kb Ladder, 1) primer TUB, 2) primer MDH 3), primer ACP, 4) OSM2 5) primer c596, 6) primer c516,
7) primer c356, 8) primer c173, 9) primer c106, 10) primer c68, 11) primer c14.
59
4.2.6. Expressão relativa genótipos Resistente (174) e suscetível (1074)
A proteína TgPR1 teve uma redução nos níveis de expressão em 24h após a
inoculação no genótipo suscetível (1074) (Figura 21), já no genótipo resistente (174)
a proteína TgPR1 teve um aumento de 4,63 vezes em 48h (Figura 22). As ontologias
gênicas mostram que a TgPR1 está envolvida nos mecanismo de defesa da planta
(Tabela 8), associado ao resultado observado no presente estudo, isto é indução em
resposta a presença do patógeno, a proteína TgPR1 pode estar envolvida em um
processo de defesa contra o fungo M. perniciosa no genótipo resistente. Embora as
proteínas PR1 não tenha seu mecanismo de ação definido (SINHA et al., 2014), esta
proteína pode atuar em conjunto auxiliando ou modulando um mecanismo de ação
capaz de combater o patógeno.
Figura 21: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR1 no genótipo suscetível (1074), nos
pontos não inoculado (NI), 8h, 24h, 48h e 72h.
60
Figura 22: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR1 no genótipo resistente (174), nos pontos
não inoculado (NI), 8h, 24h, 48h e 72h.
A proteína TgPR3 teve uma queda nos seus níveis de expressão de 8h até
72h no genótipo suscetível (Figura 23). No genótipo resistente a proteína TgPR3
teve um aumento de expressão que se manteve do período de 8h até 72h (Figura
24). Segundo as ontologias gênicas anotadas para a proteína ortóloga da TgPR3,
por estar envolvida em diversos processos metabólicos e mecanismos de defesa
(Tabela 8), esse aumento de expressão pode estar relacionado com os mecanismos
de resistência do cupuaçuzeiro contra o patógeno M. perniciosa.
61
A TgPR5 teve uma redução em seus níveis de expressão após a inoculação

do fungo em todos os períodos analisados no genótipo suscetível (Figura 25). No
genótipo resistente a TgPR5 teve um aumento de 24 vezes no ponto de 8h seguido
por um aumento de 79,3 vezes 24h após a inoculação (Figura 26). As proteínas PR5
já tiveram o aumento de sua expressão, quando desafiados com patógenos, tanto
em tabaco transgênico quanto em genótipos resistentes de outras plantas, como
62
gengibre e arroz (Hou et al., 2012; Munis et al., 2010; Prasath et al., 2011). Por
possuir uma provável ação direta por meio da degradação da parede celular de
fungos (SALZMAN et al., 2004), esta proteína pode ter um grande potencial e
exercer um papel fundamental no processo de resistência do cupuaçuzeiro contra o
fungo M. perniciosa.
63
A proteína TgPR8 teve um comportamento semelhante a TgPR3, com um
aumento no nível de expressão no período de 8 h até 72 h (Figura 27) no genótipo
resistente e uma redução no genótipo suscetível (Figura 28). Nota-se que as duas
proteínas podem estar envolvidas diretamente no mecanismo de resistência ao
fungo M. perniciosa. O aumento dos níveis de expressão dessas proteínas mostra
que ambas podem estar envolvidas no mecanismo de PTI, impedindo a colonização
do patógeno na planta. Segundo a predição de localização celular a proteína TgPR3
teoricamente é extra celular em quanto que a proteína TgPR8 é vacuolar. O
Acumulo de quitinases dentro e fora da celular pode ser uma estratégia para
combater e evitar a colonização do patógeno.
64
A proteína TgPR10.1 teve uma redução nos seus níveis de expressão no

período de 8 h e 72 h tanto no genótipo resistente quanto no suscetível (Figura 29 e
30). A proteína TgPR10.2 teve um leve aumento de expressão no período de 8 h
que foi reduzindo até 72 h no genótipo resistente (Figura 32). No genótipo suscetível
a proteína TgPR10.2 teve uma redução dos seus níveis de expressão em todos os
períodos analisados (Figura 31). Embora proteínas da família PR10 tenham sido
encontradas superexpressas na interação entre M. perniciosa x T. cacao (SILVA et
al., 2013), este comportamento não foi observado em cupuaçuzeiro nos períodos
estudados.
65
Figura 29: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR10.1 no genótipo suscetível (1074), nos
Figura 30: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR10.1 no genótipo resistente (174), nos
66
Figura 31: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR10.2 no genótipo suscetível (1074), nos
Figura 32: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPR10.2 no genótipo resistente (174), nos
A proteína TgPTI5 não sofreu alteração nos seus níveis de expressão em

relação ao controle não inoculado no genótipo suscetível (Figura 33). No genótipo
resistente a proteína TgPTI5 teve uma redução dos seu nível de expressão no
período de 72h após a inoculação (Figura 43). Embora a TgPTI5 esteja anotada no
genoma do cacau com uma indutora de proteínas PR e esta incluída na família AP2,
que são de fatores de transcrição, que estão envolvidas na resposta a etileno e no
67
mecanismo de defesa das plantas, neste estudo não foi possível relacionar os níveis
de expressão da TgPTI5 com as outras proteínas PR estudadas.
Figura 33: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPTI5 no genótipo suscetível (1074), nos
Figura 34: Gráfico de expressão relativa da proteína TgPTI5 no genótipo resistente (174), nos pontos
68
5. CONCLUSÃO
Neste trabalho 6 proteínas PR (TgPR1, TgPR3, TgPR5, TgPR8. TgPR10.1,

TgPR10.2) e 1 fator de transcrição (TgPTI5) foram identificadas e caracterizadas por
meio de ferramentas de análise in silico. A modelagem por homologia gerou
modelos satisfatórios para as proteínas TgPR1, TgPR5, TgPR8,
TgPR10.1,TgPR10.2 e TgPTI5, enquanto que para o modelo da proteína TgPR3
será necessário a realização de uma dinâmica molecular.
Com o modelo da proteína TgPR5 foi realizado um ensaio de acoplamento

molecular com uma molécula de quitina. O Docking entre estas moléculas reforça o
seu potencial de quitinase e viabiliza a utilização desta proteína para ensaios in vitro.
A análise de expressão relativa mostrou que no genótipo resistente as

proteínas TgPR1, TgPR3, TgPR5 e TgPR8 tiveram um aumento de expressão nos
períodos estudados. O genótipo suscetível teve uma redução nos níveis de
expressão de TgPR3, TgPR5 e TgPR8.
De modo geral as proteínas TgPR1, TgPR3, TgPR5 e TgPR8 mostraram um

aumento de expressão, podendo estar envolvidas diretamente nos mecanismos e
defesa do cupuaçuzeiro contra o fungo M. perniciosa no genótipo resistente. Estes
dados corroboram que o genótipo resistente consegue reconhecer o ataque do
patógeno e expressar proteínas para combater a infecção, evitando assim a
colonização do fungo na planta. As proteínas TgPR3, TgPR5 e TgPR8, possuem a
característica de quitinase, o que nos permite inferir que estas proteínas podem
atuar diretamente na degradação da parede celular do patógeno, evitando a
colonização do mesmo.
69
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

CARACTERIZAÇÃO IN SILICO E ANÁLISE DE EXPRESSÃO

RANER JOSÉ SANTANA SILVA

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

CARACTERIZAÇÃO IN SILICO E ANÁLISE DE EXPRESSÃO

Área de concentração: Genética e

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Caracterização in silico e análise de expressão de genes do

tipo PR de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) / Raner

José Santana Silva. – Ilhéus : UESC, 2015.

Orientadora : Fabienne Micheli.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Santa

Cruz. Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia

1. Cupuaçu – Doenças e pragas. 2. Vassoura-de-bruxa. 2.

CARACTERIZAÇÃO IN SILICO E ANÁLISE DE EXPRESSÃO

APROVADA: 18 de março de 2015

Dr. Bruno Andrade Dr. Ronan Xavier Corrêa

Dra Sara Pereira Menezes Dra Fabienne Micheli

Dedico este trabalho a toda a minha família e amigos que me apoiaram.

À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... iii

LISTA DE TABELAS .................................................................................................... i

2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 5

2.1. O cupuaçuzeiro ............................................................................................. 5

3.1. Análises in silico ............................................................................................. 18

4.1. Análises in silico ............................................................................................. 26

4.2.1 Validação do tratamento com DNAse e síntese de cDNA ............................ 52

O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) é uma frutífera de grande importância na

Palavras-chave: Proteínas PR, cupuaçuzeiro, vassoura-de-bruxa, resistência.

The cupuaçu (Theobroma grandiflorum) is a fruit of great importance in northern

Keywords: PR proteins, cupuassu, witch’s broom disease, resistance.

Figura 1: a) Cupuaçuzeiro, b) flor e c) fruto de cupuaçuzeiro. .................................... 5

Tabela 1: Classificação das proteínas PR da família 1 a 17, segundo Edreva (2005) ,

O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) é uma frutífera com um grande

O cupuaçueiro possui pragas e patógenos que podem causar prejuízos na

De modo geral as planta, quando resistentes, são capazes de reconhecer um

Dentre as proteínas presentes nos mecanismos de defesa das plantas, as

Dada a importância das proteínas PR nos mecanismos de defesa das plantas,

Até o presente estudo não foi caracterizada nenhuma proteína do tipo PR

O cupuaçuzeiro [Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) Schum.]

O cupuaçuzeiro é uma frutífera perene que pode atingir 7 m de diâmetro de

Figura 1: a) Cupuaçuzeiro, b) flor e c) fruto de cupuaçuzeiro.

Dentre as frutas tropicais nativas da região amazônica, o cupuaçu é a que

O estado do Pará é o maior produtor nacional de cupuaçu e teve um aumento

2.3. Pragas e patógenos da cultura do cupuaçuzeiro: enfoque na doença

A cultura do cupuaçuzeiro é acometida por pragas e patógenos que podem

A vassoura-de-bruxa é uma das principais doenças do cupuaçuzeiro, e se

As vassouras vegetativas no cupuaçuzeiro ocorrem durante todo o ano, com

O cupuaçu era normalmente obtido por extrativismo e devido a sua grande

O cacaueiro, um parente próximo do cupuaçuzeiro, é uma espécie de grande

Em seu conjunto, os estudos citados tem um importante papel no avanço e

2.4. Aspectos moleculares de M. perniciosa na interação planta patógeno

Assim como a maioria dos patógenos, o fungo M. perniciosa possui vários

O patógeno M. perniciosa também possui genes que codificam proteínas

O fungo M. perniciosa possui uma alta tolerância ao ácido salicílico (AS),

2.5. Mecanismos de defesa em plantas

2.5.1 Mecanismos estruturais

Os mecanismos de defesa estruturais podem ser constitutivos (pré-formados).

Os mecanismos pós-formados são aqueles induzidos na presença do

2.5.2 Mecanismos bioquímicos

Nos mecanismos bioquímicos pré-formados estão às substâncias que se

2.6 Imunidade em plantas

A imunidade em plantas é um mecanismo bastante complexo, no decorrer da

ACP ACP_F AGGATGCAGCTGACCTGATT 20 - - - -