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“Comissão Examinadora”
___________________________________________________________________
Prof. Rogério Tortelly (Doutor, Anatomia Patológica) - UFF
___________________________________________________________________
Prof. Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho (Doutor, Anatomia Patológica) - UENF
_________________________________________________________
Prof. Cláudio Baptista de Carvalho ( Doutor, Clínica Médica ) - UENF
Orientador
A minha mãe e as minhas irmãs que sempre me apoiaram e me deram força
para que eu alcançasse todos os meus objetivos.
ii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que sempre esteve ao meu lado, dando -me força, saúde e
sabedoria.
À filha, Ana Carolina Freitas Godinho, por ajudar -me a superar os momentos
difíceis dessa caminhada.
iii
A todos os integrantes do setor de Morfologia e Anatomia Patoló gica-
LSA/UENF, em especial aos técnicos, Rodrigo Barros Crespo e Layla Janaina H.
Borges, pelo convívio e importante participação neste trabalho.
Aos amigos, Paula Ristow, Marley Gomes e Walter Oelemann, pela parceria,
apoio e atenção durante a realização deste trabalho.
iv
BIOGRAFIA
v
CONTEÚDO
RESUMO.....................................................................................................................xi
ABSTRACT................................................................................................................xiii
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................1
1.1. Paratuberculose bovina .................................................. .........................1
2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................3
2.1. Definição da Paratuberculose bovina.......................................................3
2.2. Histórico da Paratuberculos......................................................................4
2.2.1.Paratuberculose no Brasil................................................................7
2.3. Agente etiológico ............................................................. ........................8
2.3.1. Análise taxonômica ........................................................................8
2.3.2. Características gerais do Map ...................................................... .9
2.3.3. Condições de resistência do Map ................................................10
2.4. Epidemiologia ........................................................................................11
2.4.1. Distribuição e difusão ...................................................................11
2.4.2. Hospedeiro ...................................................................................12
2.4.2.1. Susceptibilidade de idade, raça e aptidão ..........................13
2.4.3. Fatores de risco... ........................................................................ 14
2.4.4. Infecção...................................................... ..................................15
2.4.4.1. Fases da infecção...............................................................16
2.4.5. Morbidade e mortalidade .............................................................17
vi
2.4.6. Perdas econômicas......................................................................18
2.4.7. Levantamento epidemiológico .....................................................19
2.5. Patogenia ..............................................................................................21
2.5.1. Localização das lesões na fase inicial da infecção .................... ..21
2.5.2. Entrada e sobrevivência do Map na mucosa intestinal............... 21
2.5.3. Imunopatogenia........................................................................... 22
2.6. Sinais clínicos............................................................ ........................... 23
2.7. Lesões ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,24
2.7.1. Lesões macroscópicas ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,24
2.7.2. Lesões microscópicas ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,26
2.8. Diagnóstico ...........................................................................................29
2.8.1. Diagnóstico clínico ......................................... ..............................29
2.8.2. Diagnóstico diferencial .................................................................29
2.8.3. Diagnóstico laboratorial ...............................................................29
2.8.4. Testes de avaliação da resposta imune celular .......................... 31
2.8.5. Testes de avaliação da resposta humoral ...................................32
2.8.6. Necropsia .....................................................................................34
2.8.7. Bacterioscopia e hstopatologia ....................................................35
2.8.8. Imunoistoquímica .........................................................................35
2.8.9. Bacteriologia ................................................... ..............................39
2.8.10. Métodos moleculares .................................................................40
2.9.Tratamento .............................................................................................44
2.10. Controle da Paratuberculose ..............................................................45
2.11. Saúde pública .....................................................................................46
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 49
3.1. Desenho do estudo ...............................................................................49
3.2. Características zootécnicas das propriedades estudadas.....................49
3.2.1. Propriedade A......................................................................................49
3.2.2. Propriedade B......................................................................................50
3.3. Processamento das amostras.................................... ............................50
3.4. Metodologia utilizada .............................................................................51
3.4.1. Caracterização macroscópica da lesão .......................................51
3.4.2. Histopatologia .......... ....................................................................51
vii
3.4.3. Imunoistoquímica..........................................................................52
3.4.4. Cultura......................................................................................... 52
3.4.5. Reação em cadeia de polimerase - Polymerase Chain Reation
(PCR)....................................................................................................................53
3.4.5.1.Extração dos ácidos desoxiribonucléicos (DNA) de tecido
parafinado ............................................................................................................53
3.4.5.2. Amplificação pela PCR....................................................... 54
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................... 55
4.1. Medidas de manejo adotadas nas propriedades A e B .......................56
4.2. Histórico e avaliação clínica dos animais...............................................57
4.3. Achados macroscópicos ........................................................................60
4.4. Achados microscópicos.................................................. ....................... 64
4.4.1. Marcação imunoistoquímica .....................................................70
4.5. Bacteriologia......................................................................................... .72
4.6. Detecção do Map nas amostras, via PCR, para o gene F5...................73
5. CONCLUSÃO ................................................................................................. 76
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................77
viii
LISTA DE FIGURAS
ix
Figura 11. Íleo de bovino com Paratuberculose. Lesões multifocais com BAAR no
ápice das vilosidades, na região médio -glandular e região basal da mucosa. ZN,
100X. .........................................................................................................................65
Figura 12. Mucosa intestinal (íleo) de bovino com Paratuberculose. Vilosidades
fundidas devido ao infiltrado de células epitelióides e BAAR. ZN, 100X………….... 65
Figura 13. Vaso linfático dilatado na submucosa (ileal) de bovino com
Paratuberculose, contendo lesão granulomatosa, célula gigante de Langhans e
BAAR no seu interior . ZN, 400X................................................................. .............. 66
Figura 14. Corte da porção ileal do intestino de bovino com Paratuberculose,
demonstrando lesão difusa na base da mucosa e em toda submucosa. ZN, 100X. 67
Figura 15. Lesões multifocais com BAAR na região cortical de linfonodo mesentérico
de bovino com Paratuberculose.. ZN,400..................................................................68
Figura 16. Lesões multifocais com BAAR no espaço porta hepático de bovino com
Paratuberculose. ZN, 400X ............................................. ..........................................69
Figura 17. Globias de bacilos imunoexpressados em marrom acastanhado na
mucosa intestinal de bovino com Paratuberculose. IHQ, 400X…..............................70
Figura 18. Grumos de bacilos imunoexpressados no espaço porta-hepático de
bovino com Paratuberculose. IHQ, 400X. .................................................................70
Figura 19. Resultado do nested PCR das amostras intestinais dos animais
estudados: Nas linhas 2 e 3, vaca Humorista; 4 e 5, vaca Jacuba; 6 e 7, bovino
Garote; 8 e 9, vaca Janice; 10 e 11, animal 981; e na linha 12, o DNA bacteriano de
cultura de amostra intestinal da vaca Humorista. Linha 1, ladder, marcador de peso
molecular....................................................................................................................74
x
RESUMO
xii
ABSTRACT
xiv
1
1. INTRODUÇÃO
2. REVISÃO DE LITERATURA
etiológico da doença de Crohn, após este ter sido isolado de amostras de intestino e
nódulos linfáticos de paciente com esta enfermidade (CHIODINI, 1993).
anos de idade e o outro em uma fêmea Holandesa, importada da Holanda, com seis
anos de idade.
RAMOS et al. (1986) observaram a forma clínica da doença em um touro da
raça Holandesa, doador de sêmen em uma central de inseminação artificial no Rio
Grande do Sul.
NAKAJIMA et al (1991), em Minas Gerais, registraram a enfermidade em
uma vaca com cinco anos de idade da raça Holandesa que fora importada dos
Estados Unidos da América.
DRIEMEIER et al. (1999), no Rio Grande do Sul, descreveram as lesões
clínico-patológicas observadas em oito vacas com doença de Johne, provenientes
de um rebanho de 345 animais, sendo que a maioria desses animais eram vacas
importadas da Argentina.
Em relação às estimativas nacionais da epidemiologia da doença, pode -se
basear em apenas algumas estimativas mais recentes: RIVIERA (1996), no Mato
Grosso do Sul; LARANJA DA FONSECA et al. (2000), em São Paulo; FERREIRA et
al. (2001), no Rio de Janeiro; e GOMES et al. (2002), no Rio Grande do Sul. Tais
estudos estimaram uma soroprevalência de 45,5%, 37,9%, 18% e 39,8% de an imais
infectados, respectivamente.
Algumas pesquisas vêm demonstrando que essa relação bem fechada entre Map e
algumas espécies de micobactérias do complexo M. avium (MAC), em particular o
M. avium subspécie avium (Maa), que vivem no ambiente, deve -se ao fato de existir
uma homologia de 97% entre o DNA da maioria de cepas de Map e Maa isoladas
até o momento (BARKER et al., 1993; BANNANTINE et al., 2002).
glicolipídeo que está ancorado à membrana e inserido na par ede celular. Ele é
considerado um dos vários imunomoduladores componentes da parede celular do
Map (BERNNAN e NIKAIDO, 1995)
LOVEL et al (1944), citados por CLARKE (1997), demonstraram, mediante
experimento, que Map presente em amostras de fezes no pasto resiste às condições
ambientais naturais por pelo menos um ano, tornando-se, desta forma, uma
importante fonte de contaminação para outros animais
2.4. Epidemiologia
2.4.1. Distribuição e difusão
2.4.2. Hospedeiro
2.4.4. Infecção
Estudos têm demonstrado que Map é viável por mais de 250 dias em água,
solo, fezes e secreções de animais. Conseqüentemente, a contaminação de um
15
animal no ambiente por meio das fezes de animais infectados é a maneira mais
comum de transmissão (LARSEN et al; 1856 e LOVEL et al., 1944 citados por
CLARKE, 1997).
O longo período de incubação da doença proporciona a disseminação do
agente pelas fezes dos animais infectados por mais de 18 meses, sem que os sinais
clínicos da doença apareçam. São eliminadas em média 5x10 5 microrganismo/dia
por animal com a forma clínica da doença (CHIODINI et al., 1984). A contaminação
fecal dos tetos, assim como do colostro e do leite, pode levar o recém-nascido a
ingerir grande quantidade do microrganismo. Além desses, pastos, água e outros
alimentos contaminados também podem ser considerados potentes fontes de
contaminação (TAYLOR et al., 1981; CHIODINI et al., 1984).
Apesar de a doença estar mais intensamente confinada ao trato
gastrintestinal e linfonodos mesentéricos, a infecção pode ser disseminada para
outros locais extra-intestinais. Map também tem sido isolado do leite, de feto, de
pulmão e do sêmen (SWEENEY,1996).
Embora as lesões habitualmente fiquem confinadas aos intestinos e
linfonodos mesentérico, a infecção generalizada foi descrita em bovinos, ovinos e
caprinos natural e experimentalmente infectados, podendo -se observar as lesões no
fígado, baço, pulmões, rins, últero, placenta e linfonoodos não-mesentéricos (JONES
et al., 1996). Existem relatos de hepatite granulomatosa causada por Map em
amostras de fígado de bovinos e ovinos (DRIEMEIER et al., 1999; MAHMOUD et al.,
2002)
Pesquisas confirmam a presença de Map em amostras de leite cru (GIESE
e AHRENA, 2000) e em leite comercializado, demonstrando, desta maneira,
que a pasteurização HTST não é totalmente eficaz na eliminação deste agente, logo
o leite representa um veículo de transmissão do Map de bovinos para humanos
(GRANT et al., 2002a)
O trato reprodutor masculino pode ser contaminado, mas a transmissão
sexual não tem sido comprovada (LARSEN e KOPECKY, 1970, citado por CLARKE,
1997). BUERGELT et al.(2004) detectaram, por meio da reação em cadeia de
polimerase (PCR), Map no sêmen e no sangue de touros com sinais clínicos de
Paratuberculose. RAMOS et al. (1986) relatam um caso de Paratuberculose bovina
em uma central de inseminação artificial, no Rio Grande do Sul, em que Map foi
16
2.5. Patogenia
2.5.1. Localização das lesões na fase inicial da infecção
2.5.3. Imunopatogenia
2.7. Lesões
2.7.1. Lesões macroscópicas
2.8. Diagnóstico
2.8.1. Diagnóstico clínico
em achados clínicos, pode ser confirmado pela demonstração do Map nas fezes, por
microscopia, cultura ou por uso de sondas de DNA e reação de polimerase em
cadeia (PCR). Mediante a necropsia, o diagnóstico é feito a partir de achados de
lesões patognomônicas da doença, macroscópicas e microscópicas no intestino, ou
por meio do isolamento do Map de outros tecidos, utilizando meios de cultura
específicos. A detecção de infecções subclínicas depende da demonstração de uma
reação de hipersensibilidade tardia pela Jonina ou pela tuberculina aviária, da
detecção de anticorpos específicos mediante sorologia ou da cultura de Map a partir
das fezes. A cultura do Map pode ser obtida de fezes ou tecidos, após as amostras
receberem tratamentos para a eliminação de contaminantes, são seguida mente
inoculadas em meio artificial, com ou sem o fator de crescimento (micobactina), que
é essencial para o crescimento do microrganismo (OIE, 2000)
A escolha de um teste diagnóstico depende das circunstâncias e do grau de
sensibilidade requerida para uma avaliação individual do animal ou do nível do
rebanho (COLLINS, 1996).
Os testes diagnósticos preferencialmente os utilizados para diagnosticar a
Paratuberculose, podem ser divididos em duas principais categorias: métodos para a
detecção do agente e métodos de detecção de anticorpos específicos presentes no
soro. Os testes para detecção do agente incluem cultura bacteriana, sondas
genéticas e exame histológico de tecidos-alvo para detecção do bacilo álcool-ácido-
resistente. Entre os testes para detecção de anticorpos específicos, o teste de ELISA
é o mais amplamente utilizado (BUERGELT e GINN, 2000).
2.8.6. Necropsia
correlação entre a severidade dos sinais clínicos e a extensão das lesões intestinais.
A mucosa, especialmente na parte terminal do íleo, apresenta carac terísticas
patognomônicas de espessamento e corrugação e os linfonodos mesentéricos
podem estar aumentados e edematosos. Além disso, pode -se observar, também, um
aumento de tamanho da válvula ileocecal, que se apresenta, na maioria das vezes,
edemaciada e congesta (BARKER et al., 1993; OIE, 2000).
A baciloscopia direta de amostras da mucosa intestinal afetada e dos
linfonodos mesentéricos podem ser coradas pelo método de Ziehl-Neelsen e
observadas microscopicamente para a detecção de BAAR, que tem características
morfológicas do Mycobacterium avium paratuberculosis. No entanto, bacilos álcool-
ácido-resistentes não estão presentes em todos os casos. O diagnóstico é melhor
confirmado pela coleta de várias amostras de intestino e dos linfonodos
mesentéricos que deverão ser fixados em formol tamponado 10% e processados
histologicamente, utilizando-se a coloração de Hematoxilina e Eosina (HE) e Ziehl -
Neelsen (ZN). As lesões patognomônicas consistem de infiltrado, na lâmina própria,
placas de Payer e no córtex dos linfonodos mesentéricos, de células epitelióides e
células gigantes multinucleadas de Langhans com presença de “grumos” de bacilos
ou alguns bacilos álcool-ácido-resistente dispostos isoladamente. Células gigantes
de Langhans são comuns e contêm poucos bacilos (SANTOS e SILVA, 1956; OIE,
2000).
2.8.8. Imunoistoquímica
2.8.9. Bacteriologia
tecido devem passar por diferentes etapas como , por exemplo: o processo de
digestão do tecido, de descontaminação do inóculo e, finalmente, a inoculação em
meio de cultura e incubação. Map pode ser cultivado na maioria dos meios de
cultura utilizados para o cultivo de outras micobactérias, necessitando, no entanto,
de um aditivo nutricional, a micobactina. Os meio normalmente utilizados são Dubos,
que têm como base o soro: o Herrold Eggs Yolk Médium, que tem como base a
gema do ovo; e o meio Lowenstein-Jensen, que tem como base o ovo completo.
Além desses, podemos lançar mão de meios sintéticos como o Watson -Reid ou as
diferentes variantes do Middlebrook (WHIPPLE e MERKAL, 1983; THOREL e
HAAGSMA, 1987).
RAMOS et al. (1986) relatam que, a partir do exame bacteriológico de
amostras de intestino delgado, fezes, linfonodos mesentéricos e sêmem
provenientes de um touro reprodutor, necropsiado com suspeita de Paratuberculose,
foi possível visualizar colônias características de Map a partir da sexta semana da
inoculação dessas amostras em meio Herrold com mico batina.
As amostras intestinais de oito vacas com Paratuberculose, necropsiadas no
Rio Grande do Sul, foram cultivadas em meio Herrold, enriquecido com micobactina,
revelando o crescimento de colônias bacterianas somente após um período superior
a seis semanas (GOMES, 2002).
2.9. Tratamento
animais podem estar disseminando o agente infectante pelas fezes, sem apresentar
sinais clínicos da doença (COLLINS e MORGAN, 1991).
O sucesso de um programa de erradicação da Paratuberculose em ov inos,
caprinos ou bovinos somente é possível se forem usadas medidas de manejo
preventivas, vários testes de diagnóstico, vacinação e restrição da movimentação de
animais (BENEDICTUS et al., 2000).
Além das estratégias de manejo, para se ter sucesso no controle e
erradicação da Paratuberculose, são necessárias melhorias nas técnicas de
diagnóstico, possibilitando, de maneira mais rápida, a identificação de animais
infectados no rebanho ou a identificação da maioria dos animais que não estão
liberando a bactéria. Também são de grande importância as pesquisas para a
fabricação de vacinas que previnam a eliminação fecal do Map e a aplicação de
novos métodos terápicos e profiláticos (EMERY e WHITTINGTON, 2004).
Na maioria dos países, as implantações de medidas de controle ainda são
inteiramente dependentes dos recursos individuais das propriedades, tais como:
manejo, força de trabalho e recursos financeiros. A ausência de uma prova
diagnóstica eficiente e eficaz dificulta o controle e a erradicação da Paratuber culose.
Animais infectados em um rebanho podem ser detectados, por meio da aplicação de
provas bacteriológicas, sorológicas e da imunidade celular. Entretanto, esta última
proporciona, na maioria das vezes, um elevado número de resultados falso -
positivos. Para um controle eficiente, há a necessidade de se utilizar testes
apropriados e, atualmente, o teste de ELISA e o cultivo fecal estão sendo os mais
usados, já que os outros testes possuem limitações que impedem os seus usos
como testes de rebanho (COLLINS et al, 1996; COLLINS et al, 1991).
O desenvolvimento de novos testes de diagnóstico (sondas) e imunoensaios
(ELISA) irão ajudar na identificação de animais infectados e na prevenção da
propagação da Paratuberculose. A sonda IS900 identificada por Mc Fadd en e
colaboradores, assim como a sonda F57 e o ELISA a362, podem ser consideradas
novas ferramentas diagnóticas efetivas para estudos experimentais e clínicos
(COCITO et al., 1994).
Os programas de controle da infecção têm como prioridade, mudanças no
manejo do rebanho para limitar a transmissão do Map. Testes de diagnóstico são
usados somente para dar suporte e agilidade aos programas de controle da
Paratuberculose. Testes diagnósticos em programas de controle da
46
Desde que Map foi isolado de amostras intestinais de paciente com doença
de Crohn, existe a controvérsia em relação à sua real participação na etiologia desta
patologia. Sabe-se que o leite pode ser um veículo potencial na transmissão do Map
para população humana (CORTI e STEPHAN, 2002).
Segundo HINES et al., 1987, existem várias evidências de que Map pode
estar presente no leite cru. Isto pode ocorrer devido à contaminação fecal durante a
amostragem ou pela presença da bactéria no úbere pela invasão através do canal
do teto ou como resultado de uma disseminação sistêmica.
GRANTS et al. (2002a) realizaram estudos envolvendo pasteurização e
observaram que Map de leite naturalmente infectado é capaz de sobreviver à
pasteurização hight temperatura short time (HTST), não sendo possível a sua
completa eliminação em amostras naturalmente contamin adas.
A investigação da prevalência de Map em tanque de expansão de leite em
várias regiões da Suiça estimou uma prevalência de Map em rebanhos leiteiros
infectados em torno de 19,7% utilizando um teste baseado em PCR IS900. Das
1.384 amostras de leite, 273 foram positivas, o que mostrou uma ampla distribuição
de Map em rebanhos leiteiros infectados e demonstrou a possibilidade do Map ser
freqüentemente transmitido aos humanos pelo consumo de leite (CORTI e
STEPHAN, 2002).
Embora a cultura bacteriana seja um dos métodos-diagnóstico mais sensível
e apropriado para confirmação ou exclusão da participação de uma micobactéria na
etiologia da doença de Crohn, existem alguns obstáculos que inviabilizam a
execução do método. O fato de o Map ser considerado um microrganismo fastidioso,
de crescimento lento, dependente de micobactina, capaz de apresentar-se em forma
de esferoblasto, impossibilita a utilização do citado método como diagnóstico de
rotina na doença de Crohn (HERMON-TAYLOR et al., 1994).
Há necessidade de novos métodos nos quais Map seja detectado diretamente
de amostras de intestino de pacientes com doença de Crohn. Recentes avanços em
métodos de biologia molecular têm proporcionado melhores resultados na detecção
desta bactéria. Um dos mais populares é o uso da PCR, baseada na amplificação de
uma multicópia da seqüência de inserção IS900, específica do genoma do Map. A
utilização de um duplex-PCR, baseado na seqüência F57 e na p34, poderia
contribuir de forma bem consistente e com maior rapidez para o diagnóstico de
diferenciação entre doenças infecciosas micobacterianas tuberculosas e não -
48
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.2.2. Propriedade B
3.4.2. Histopatologia
3.4.3. Imunoistoquímica:
3.4.4. Cultura
bloco parafinado (animal 981) foi cedida do arquivo do setor de Anatomia Patológica
da Universidade Federal Flumine nse (UFF).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
B
C
com o kit Dako DAB+, conforme especificação do fabri cante (Fig. 17). Também
foram obtidos resultados positivos para a IHQ, quando da submissão de amostras de
linfonodos e de fígado (Fig. 18) do bovino Garrote.
4.5. Bacteriologia
4.6. Detecção de Map nas amostras via PCR para o gene F57
10.000 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
450 pb
439 pb
Fig. 19. Resultado do nested PCR das amostras intestinais dos animais
estudados: nas linhas 2 e 3, vaca Humorista; 4 e 5, vaca Jacuba; 6 e 7,
bovino Garote; 8 e 9, a vaca Janice; 10 e 11, animal 981; e na linha 12 o
DNA bacteriano de cultura de amostra intestinal da vaca Humorista. Na linha
1 (ladder), marcador de peso molecular.
76
5. CONCLUSÕES
6. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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