BIOFILMES MICROBIANOS

E SUA IMPORTANCIA NA
INDÚSTRIA ALIMENTÍCIA
 BIOFILMES - DEFINIÇAO
 Biofilmes: são complexos ecossistemas microbiológicos embebidos
em uma matriz de polímeros orgânicos, aderidos a uma superfície
(Costa, 1999; Carpentier e Cerf, 1993; Surman et al, 1996).

 Biofilmes: são comunidades de microrganismos imobilizado

agregados em uma, matriz de substâncias poliméricas extracelulares
de origem microbiana (Xavier et al, 2004).

 Biofimes: Massa composta de resíduos, microrganismos e seus

produtos extracelulares (Silva Junior, 2002)
 BIOFILMES - DEFINIÇAO

V. cholerea

WATNICK & KOLTER (2000)

Número de células que são consideradas como um biofilme

Parizi (1998) – 106 a 107, Andrade et al (1998) – 107, Ronner e Wong (1993) – 105 e
Wirtanen et al (1996) 103 / células aderidas por cm2
 BIOFILMES
RISCOS E BENEFÍCIOS
 BENEFÍCIO
 Biorreatores na produção de fermentados
 Produção de vinagre
 Tratamento de água potável

 RISCOS
 Contaminação dos alimentos com microrganismos patogênicos
e/ou deterioradores.
 Corrosão de equipamentos e utensílios.
 Porque as bactérias formam
biofilmes?
 Hipóteses
 Mecanismo de defesa: Em um biofilme os
microrganismos possuem nutrientes, estão
protegidos da mudança de pH, radicais de
oxigênio, desinfetante e antibióticos.

 Colonização: a formação de um biofilme

torna-se um ambiente favorável, possui
nutrientes e é relativamente estável com
respeito a disponibilidade de água,
oxigênio e temperatura.

 Comunidade: Heterogeneidade

 Ausência do modo de crescimento

planctônico, mais susceptíveis a
eliminação
 BIOFILMES - FORMAÇÃO

 Falhas no procedimento de HIGIENIZAÇÃO

 Resíduos aderidos aos equipamentos e superfícies

transformem-se em potencial fonte de contaminação.

 Pesquisadores tem divido de 2 a 5 etapas a

formação de biofilmes.
 BIOFILMES - FORMAÇÃO

 Marshal et al (1971) – 2 etapas

 1. Adesão – processo reversível – ocorre por forças de

van de Walls e atração eletrostática

 2. Interação física das células com a superfície – material

extracelular produzidos por bactérias (matriz de
glicocálix)
 BIOFIMES - FORMAÇÃO

 Notermans et al (1991) 3 etapas

 1. Fixação da bactéria

 2. Consolidação da bactéria na superfície – produção de

material extracelular de fixação

 3. Colonização e crescimento da bactéria

 BIOFIMES - FORMAÇÃO
 Duddidg e Pritchard, 1993; Characklis,1984; Characklis e Cooksey, 1983 – 5 etapas

 1.Condicionamento da superfície pela adsorção de material orgânico.

 2.Transporte de células e nutrientes para os sítios de aderência

 3.Adesão – processo reversível – atração eletrostática

 4.Crescimento celular, colonização e adesão irreversível

 5.Biofilme com atividade metabólica – liberação de células da periferia.

 As bactérias se aproximam das superfícies e ocorrem
forças eletrostáticas de repulsão e atração.

 Interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio

atuam como forças atrativas.

 A bactéria supera as barreiras de repulsão

eletrostática.
 Interação Termodinâmica

 Há necessidade da redução da energia livre da superfície.

 Potencial de interação Bactéria-Líquido, Bactéria-

Substrato/sólido e Líquido-Substrato/sólido

 ΔF adh = γBS – γBL – γLS

 Processo de adesão

 > 50nm: operam somente forças atrativas de Van der Waal’s, não a reconhecimento
da superfície.
 De 10 a 20nm: Repulsão eletrostática entre a bactéria e a superfície, processo
reversível.
 Para a eficiência da interação é necessário a remoção de uma fina camada de água por
grupos hidrofóbicos.
 <1,5nm: Adesão da bactéria a superfície. Esta interação inclui específicos receptores
mediadores da adesão. Processo irreversível.
 BIOFIMES - FORMAÇÃO
 Xavier et al, 2004 – 4 etapas

 1.Transporte de células para a superfície e subseqüente fixação.

 2. Crescimento e divisão celular – produção e excreção de EPS.

 3. Fixação de outras células bacterianas flutuantes.

 4. Liberação de material celular – 4a (células individuais)

4b (agregados do biofilme)
BIOFIMES - FORMAÇÃO

Xavier et al, 2004

 BIOFILMES
MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS NO
PROCESSO DE ADESÃO
 Microrganismos Patogênicos
 Listeria monocytogenes
 Salmonella thyphimurium
 Escherichi coli O157:H7
 Staphylococcus aureus
 Bacillus cereus

 Pseudomonas aeruginosa
 Pseudomonas fluorescens
Escherichia coli
 BIOFILMES - ESTRUTURA
 Estrutura do biofilme – propriedades morfológicas como espessura, densidade e
forma.

 A estrutura tem papel importante na atividade do biofilme

 Crescimento das células e suas divisões

 Produção e excreção de EPS Estrutura 3D de um hipotético biofilme - Xavier et al (2004)

Nas culturas em batelada a adesão

é afetada pela fase de crescimento
(fase log e fase estacionária).
 BIOFILMES - HIGIENIZAÇÃO

 ENFATIZAR MICRORGANIMOS RELACIONADOS A TOXINFECÇÕES ALIMENTARES

 E. coli (Coliformes fecais) – presença de bactérias fecais.

 S. aureus – normalmente provenientes de mãos e secreção nasal

 Streptococcus pyogenes – infecções na garganta

 Pseudomonas aeruginosa – presentes em vegetais

 Bacillus cereus – proveniente do solo e de vegetais em Geral

 Estes microrganismos indicam a falta de higienização e desinfecção ambiental.

 BIOFILMES
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO
 As bactérias num biofilme podem entrar em um
estado de vida – nestas condições as células são
viáveis mais não cultiváveis – não irão crescer
em meios de cultura normalmente utilizados para
sua detecção.

 Métodos visuais e métodos não visuais.

 BIOFILMES
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO
 Métodos Visuais
 Microscopia de Contraste – é recomendada para acompanhar o
desenvolvimento de biofilmes em tempo real, numa superfície transparente.

 Microscopia de Epifluorescência – quantificação de células viáveis,

utilizando substâncias fluorescentes.

 Microscopia Eletrônica de Varredura e Microscopia Eletrônica de

Transmissão – são utilizadas para a avaliação da interação microbiana na
matriz do biofilme – utilizam agentes químicos como fixadores ou
criofixadores.
 BIOFILMES
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO

Microscopia Eletrônica de Varredura Microscopia de Epifluorescência

,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
 BIOFILMES
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO
 Métodos Não Visuais
 Medida da Impedância – ao metabolizarem composto orgânicos
grandes são formados compostos pequenos que possuem cargas
elétrica o que leva a mudança da resistência ou impedância, a
mudança da condutividade pode se medida e relacionada com o
número de microrganismos aderidos.

 Medida de Bioluminescência – baseia-se na quantidade de ATP

(trifosfato de adenosina) – ocorre uma reação de bioluminescencia
entre a luciferina e a enzima luciferase. A quantidade de luz emitida
pode ser medida por um fluorímetro.
 BIOFILMES - RISCOS

 Podem existir em todos os tipos de superfícies de processamento de

alimentos (plásticos, vidros, metal, madeira e nos produtos
alimentícios)

 Protege os microrganismos patogênicos e deteriorados de

sanitização, UV, desidratação.

 Na superfície de equipamentos resulta em danos (corrosão) e

contaminação dos produtos.
 BIOFILMES - RISCOS

 Apresentam grande risco para a segurança de produtos minimamente

processados e alimentos crus

 Pode ser formado por mais de uma espécie de microrganismo

 A transferência de plasmideos ocorre em uma taxa maior devido a

proximidade das células (transferência de DNA – resistência a
antibiótico e aumento na virulencia)
 BIOFILMES - RISCOS

 Os microrganismos em um biofilme apresentam maior resistência a

sanitizantes.

 Microrganismos aderidos – foram 150 a 3000 vezes mais resistentes –

(ácido hipocloroso).

 Listeria monocytogenes não aderidas – 30s – cloreto de benzalcônico.



 L. monocytogenes aderidas 10 a 20 min – cloreto de benzalcônico.

 BIOFILMES - RISCOS

 Compostos de amônio
quartenário, ácido peracético e
mistura de ácido peracético e
ácido peroctanoico não
eliminou Campylobacter jejuni
em um biofilme após o
tratamento em 50ppm por 45
sec.
Campylobacter jejuni
 BIOFILMES - RISCOS

 Preferência para adesão

 L. monocytogenes, E. coli O157:H7 e
Pseudomonas fluorescens em alface.

 L. monocytogenes e E. coli O157:H7 L. monocytogenes

o canto ou as pontos do corte.
 P. fluorescens superfícies lisas

Takeuchi et al, (2000)

E. coli O157:H7
 BIOFILMES - PREVENÇÃO

 O melhor caminho para controlar biofilmes e prevenindo

o seu desenvolvimento.

 Higienização efetiva, que combina um programa de métodos

físicos e químicos.

 Cloro, iodóforos e produtos quartenários de amônio nas

concentrações recomendadas não remove biofilmes.