Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
GOIÂNIA
2017
ii
iii
Área de Concentração:
Cirurgia, Patologia animal e Clínica médica - CiPAC
Linha de Pesquisa:
Patobiologia e morfofisiologia animal, experimental e
comparada
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura -
EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof.ª Dr.ª Luciana Ramos Gaston Brandstetter - EVZ/UFG
Prof.ª Dr.ª Júlia de Miranda Moraes - Campus Jataí/UFG
GOIÂNIA
2017
iv
v
vi
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela certeza mais do que absoluta de Sua presença ao meu lado
em minha caminhada diária, por ser meu alento, meu consolo e minha paz.
Agradeço aos meus pais, João Maurício Pedroso e Ana Rita Barros da Rosa, por
confiarem em mim e por me proporcionarem a possibilidade de continuar estudando. Eu amo
vocês demais!
Agradeço às minhas orientadoras, Prof.ª Dr.ª Veridiana Maria Brianezi Dignani de
Moura e Prof.ª Dr.ª Luciana Ramos Gaston Brandstetter, pela paciência, pela confiança e pelo
exemplo que são para mim. Prof.ª Veridiana, muito obrigada por ter me acolhido tão bem, pela
disposição em ajudar e, principalmente, por ter enriquecido este trabalho com seu
conhecimento. Prof.ª Luciana, muito obrigada pela orientação de tantos anos, por confiar em
mim e por não ter me deixado desistir nos momentos (muito) difíceis!
Agradeço imensamente à minha maravilhosa equipe, Ana Kellen Lima de Queiroz,
Artur Antero Silva Amorim, Joel Phillipe Costa e Souza, Letícia Hirata Mendes, Marcos Luiz
Dias Júnior, Maria Clara de Sousa Bastos, Pedro Henrique Pinheiro Queiroz e Plínio Azevedo
Coelho, por toda a ajuda, por todo o incentivo e por todos os momentos felizes que me
proporcionaram. “Meus meninos”, sem vocês este trabalho não teria sido possível. Não tenho
como agradecer tanta dedicação. Muito muito obrigada!
Agradeço aos residentes e ex-residentes do Setor de Grandes Animais, Helena
Tavares Dutra, Jéssica Alves da Silva, Mayara Leão Baylão e Victor Thiago Pires Pinheiro,
pela ajuda durante o experimento, pela companhia em tantos fins de semana de plantão e por
serem, também, amigos tão queridos. Vocês são demais!
Agradeço aos meus amigos do coração, Evelyn de Oliveira, Luíza Lucena de
Albuquerque, Paula Lima Magalhães, Paulo José Bastos Queiroz, Rodolfo Peixoto de Carvalho,
a todos os “meus meninos” e, também, aos meus novos companheiros e amigos, Gabriela do
Socorro Neves Soares, Jéssyca Ataíde Ferreira, Maria Luiza Gomes Ferreira da Costa e Pedro
Augusto Cordeiro Borges, por estarem ao meu lado nos bons e nos maus momentos, por me
proporcionarem as melhores gargalhadas do mundo, pelos espetinhos no Chiquinho e por tantos
outros momentos inesquecíveis. Eu sou muito abençoada por Deus, por ter cada um de vocês
na minha vida. Amo vocês!
viii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1
a) Revascularização .................................................................................................................... 9
a) Hemostasia ........................................................................................................................... 15
c) Imunidade ............................................................................................................................. 16
ANEXOS .................................................................................................................................. 50
xii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
FIGURA 1 – Perfil temporal das fases da cicatrização. As linhas sólidas representam o perfil
da cicatrização de animais de laboratório, enquanto que as áreas com
preenchimento representam o perfil de cicatrização de feridas em membros de
equinos. ................................................................................................................ 3
FIGURA 3 – Ferida extensa e com grande perda tecidual em região de metatarso equino. A)
Ferida uma semana após a injúria, com exposição óssea e tecido necrosado. B)
Ferida durante o tratamento, em processo de granulação e livre de infecção.
Quando a granulação torna regular, a ferida estará apta a receber enxerto. ........ 9
FIGURA 5 - Esquema de uma plaqueta em suas formas inativa (esquerda) e ativa (direita).
Quando ativadas, as plaquetas mudam de forma e desenvolvem pseudópodes, que
promovem a agregação plaquetária e a liberação dos seus grânulos. ................ 14
xiii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 3
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 3
RESUMO
ABSTRACT
The economic relevance of equine breeding in Brazil indicates the importance of the
development of new economically viable treatments to promote tissue healing. Skin grafts and
Platelet Rich Plasma (PRP) are available alternatives for improving the wound healing process
in these animals. This study aimed to establish a simple method for autologous PRP production,
as well as to evaluate its action on cutaneous wounds containing skin autografts in horses. Eight
healthy horses were used, ranging in age from 3 to 18 years and mean live weight of 350 kg.
For PRP obtention, a double centrifugation protocol was used. Two 6 x 6 cm wounds were
performed on each side of the gluteal region. After the wound was filled by granulation tissue,
punch autografts were obtained, with fragments harvested from the neck. Left-sided wounds
were treated with PRP (GT) and right-sided wounds were not treated (GC). The protocol used
to obtain PRP resulted in platelet concentration, on average, three times higher than that of
whole blood. In the evaluation of PRP action in the healing of autografts, macroscopic and
microscopic variables were considered. There was no significant difference between the groups
(p> 0.05) for the variables inflammatory infiltrate, young fibroblasts, collagenization,
epidermal thickness, macroscopic and microscopic integration of the autografts and retraction
of the wound edges. However, neovascularization was significantly greater (p = 0.0191) in the
PRP group, on the 14th day after insertion of the autografts. It is concluded that the double
centrifugation method results in PRP with adequate platelet concentration for therapeutic use.
As for the action of PRP, this favors the process of skin repair with autografts in horses, since
it increases the neovascularization in the initial phase of wound healing. Moreover, PRP seems
to positively influence the integration of skin autografts and retraction of the wound edges,
which is of fundamental importance for the reduction of hospitalization time and consequently
of the therapeutic costs.
Key words: equine, platelet concentration, punch, skin grafts, wound healing.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1. INTRODUÇÃO
O cavalo ocupa posição de destaque na economia dos países desenvolvidos; no
entanto, sua contribuição para a geração de renda e postos de trabalho no Brasil ainda é pouco
conhecida. Apesar da incorporação de máquinas de última geração e de ferramentas
tecnológicas, esses animais continuam sendo de extrema importância para o desenvolvimento
de atividades pecuárias e agrícolas na maioria das propriedades rurais. Somando-se cavalos de
lida, raça, lazer e competição, a tropa nacional é superior a cinco milhões de cabeças1.
A frequência dos ferimentos cutâneos em equinos é de grande relevância quando
comparada a outras espécies. A cicatrização dessas feridas é um processo complexo, no qual
ocorre interação entre eventos celulares e moleculares, que resultam na cicatriz2. A cicatrização
nos cavalos é comumente lenta e difícil, o que leva às feridas crônicas e, consequentemente,
aos custos elevados com tratamentos3. Essas feridas possuem menor disponibilidade de fatores
de crescimento4, que agem como sinalizadores na regulação dos eventos envolvidos na
cicatrização5 e que têm as plaquetas como principal fonte6.
O crescente número de animais e a importância econômica relevante da criação de
equinos no Brasil, além das perdas representadas pelos ferimentos cutâneos nesta espécie,
denotam a importância do desenvolvimento de novos tratamentos economicamente viáveis para
promover a cicatrização tecidual. Os enxertos de pele são boa opção quando uma ferida não
pode ser fechada cirurgicamente ou excede a capacidade de cicatrização pela contração e
reepitelização. A enxertia de uma ferida em fase de granulação é considerada um tratamento de
custo-benefício favorável e de fácil execução7.
Outra alternativa disponível para a melhoria da cicatrização de feridas em cavalos
é o plasma rico em plaquetas (PRP), um produto derivado da centrifugação do sangue total, rico
em citocinas e fatores de crescimento. O PRP tem sido utilizado como opção terapêutica em
diversas enfermidades em humanos e animais, porém ainda não há confirmações inequívocas
quanto a sua eficácia. Em relação às feridas cutâneas de equinos, sabe-se que os resultados
dependem da localização da lesão, da forma de obtenção e composição do PRP, da forma de
apresentação (gel ou líquido), da via e frequência de aplicação e do volume e momento em que
é administrado durante o processo de cicatrização8.
Nesse contexto, esta pesquisa teve por objetivo estabelecer um método simples e
eficiente de produzir um PRP autólogo de qualidade terapêutica, assim como avaliar sua ação
sobre feridas cutâneas contendo autoenxertos de pele em equinos, a fim de colaborar com
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Cicatrização
FIGURA 1 – Perfil temporal das fases da cicatrização. As linhas sólidas representam o perfil da
cicatrização de animais de laboratório, enquanto que as áreas com preenchimento
representam o perfil de cicatrização de feridas em membros de equinos.
Fonte: Adaptado de Theoret9.
durante todo o processo17. Quando a inflamação não se resolve, se torna crônica e se caracteriza
pelo acúmulo de tecido conjuntivo. Esse tecido é formado por componentes da matriz
extracelular, como colágenos, fibronectina e ácido hialurônico. A fibrose, a depender da
quantidade e localização, leva a prejuízos na função do órgão, falência ou mesmo a morte9.
FIGURA 2 – Ferida criada experimentalmente na região glútea de equino. A) Ferida no dia da sua
confecção. B) Ferida aos sete dias de sua criação, exibindo preenchimento por tecido
de granulação.
Fonte: Arquivo pessoal.
A fibroplasia tem início de três a cinco dias após a injúria e possui alta atividade
celular, apesar de não contribuir em força de tensão. Os fibroblastos, as células endoteliais e
epiteliais são responsáveis pela síntese e maturação da matriz extracelular. Os fibroblastos, sob
influência de citocinas e fatores de crescimento, são recrutados para a ferida, proliferam e, em
6
seguida, alteram sua função para realizar síntese proteica e substituir a matriz extracelular
provisória por colágeno. O pico de acúmulo de tecido conjuntivo ocorre de sete a quatorze dias
após a injúria, o que corresponde ao período de maior ganho em força de tensão9.
A angiogênese é caracterizada por novos capilares sanguíneos com origem naqueles
pré-existentes e, consequentemente, pelo restabelecimento da oxigenação e nutrição ao tecido
de granulação recém-formado, em resposta ao dano tecidual e à hipóxia. O estímulo
angiogênico inicia-se no segundo dia após a injúria e é induzido por fatores de crescimento,
quimiocinas e enzimas angiogênicas, além de moléculas de adesão como integrinas, a maior
parte liberada na fase inflamatória9. Após a reconstituição completa do estroma e o
preenchimento do sítio da ferida, não há mais necessidade de um fluxo sanguíneo intenso. Nesse
momento, os estímulos pró-angiogênicos diminuem e os estímulos antiangiogênicos
aumentam18,19, o que faz com que a maior parte da rede capilar recém-formada regrida, pela
ação de metaloproteinases de matriz (MMP) e apoptose seletiva de células endoteliais20.
A epitelização ou reepitelização é o processo de restabelecimento de uma superfície
epitelial exposta. A proliferação dos queratinócitos basais das margens da ferida tem início de
um a dois dias após a injúria, assim como a migração das células epiteliais, sendo necessário
um leito de granulação por onde estas possam se deslocar9. Quimiocinas, citocinas, integrinas,
queratinas, moléculas da matriz extracelular e MMP são responsáveis pela modulação da
proliferação e migração dos queratinócitos durante a epitelização21.
FIGURA 3 – Ferida extensa e com grande perda tecidual em região de metatarso equino. A)
Ferida uma semana após a injúria, com exposição óssea e tecido necrosado. B)
Ferida durante o tratamento, em processo de granulação e livre de infecção.
Quando a granulação torna regular, a ferida estará apta a receber enxerto.
Fonte: Arquivo pessoal.
a) Revascularização
A primeira ligação entre o enxerto e a ferida ocorre pela adesão da fibrina, presente
na granulação, ao colágeno exposto do enxerto31. Inicialmente o enxerto é nutrido pela
embebição plasmática, processo pelo qual o transudato é inserido passivamente, por ação dos
capilares, pelo lúmen exposto dos vasos do enxerto32,33, e que dura aproximadamente 48 horas.
Enquanto isso, o enxerto não possui suprimento sanguíneo próprio, o que leva a uma baixa
tensão de oxigênio local e, consequentemente, atividade mitótica reduzida das células do
enxerto. O estado de hipóxia faz com que o metabolismo se torne anaeróbio, levando ao
acúmulo de metabólitos. Nesse momento, o enxerto se torna edematoso25.
Depois das primeiras 48 horas há inosculação, processo pelo qual novos capilares
da ferida atravessam a matriz extracelular e de fibrina para realizar anastomose com os capilares
do enxerto33,34. A neovascularização ocorre em seguida, quando os capilares da ferida invadem
vasos pré-existentes no enxerto e formam novos canais vasculares para a sua derme. O enxerto
10
se revasculariza completamente por volta do quinto dia e depois disso pode ser considerado
integrado à ferida, mas é só depois do décimo dia que a adesão se torna firme25. A circulação
linfática é restabelecida por volta do sétimo dia, o que leva à resolução do edema34. É possível
que ocorra falha na revascularização da porção superior do enxerto, que se torna necrótica e
desintegra, deixando a derme vascularizada ou a granulação à mostra25.
Ressalte-se que alguns tipos de bactérias, como Streptococcus e Pseudomonas spp, produzem
enzimas proteolíticas que degradam o elo fibrinoso entre o leito de granulação e o enxerto.
Dessa forma, uma contagem inferior a 105 organismos por grama de tecido é suficiente para
que a ferida seja considerada infectada por essas bactérias31.
A inflamação crônica também é causa de falha na integração do enxerto, pois leva
à produção de quantidade moderada de exsudato purulento, que contém enzimas de degradação
prejudiciais à qualidade do tecido de granulação e que, consequentemente, reduzem a taxa de
aceitação do enxerto40. O acúmulo de fluido abaixo do enxerto, como sangue, soro ou exsudato,
também atrapalha a ligação fibrinosa entre o enxerto e o leito de granulação, o que obstrui a
revascularização e causa falha na integração34.
O enxerto deve permanecer imóvel após a sua inserção na ferida, pois o movimento
causa rompimento de sua ligação fibrinosa com o tecido de granulação, impedindo que ocorram
a embebição plasmática e a revascularização. Locais de alta mobilidade como articulações,
podem receber gesso, que deve permanecer de uma semana a dez dias. As trocas de curativo
devem ser realizadas com cautela, pois também podem causar a remoção física do enxerto25.
2.3. Plaquetas
As plaquetas foram descobertas em 1865 e somente após duas décadas foi
estabelecida sua função na mediação da hemostase, quando sugeriu-se que essas pareciam
14
associar-se aos leucócitos. Atualmente, sabe-se que as plaquetas apresentam ação importante
na hemostasia e também na imunidade, e as suas funções são profundamente estudadas13.
FIGURA 5 - Esquema de plaqueta em suas formas inativa (esquerda) e ativa (direita). Quando
ativadas, as plaquetas mudam de forma e desenvolvem pseudópodes, que promovem
a agregação plaquetária e a liberação dos seus grânulos.
Fonte: Adaptado de Everts et al5.
15
a) Hemostasia
As plaquetas exercem ação central na hemostasia, que é caracterizada por interação
balanceada entre estas, a vasculatura e as proteínas plasmáticas de coagulação5. Em condições
normais, as células endoteliais inibem a adesão plaquetária a partir de uma série de mediadores.
Após uma injúria, os mecanismos protetivos são inibidos e essas células ativadas, passando a
expressar P-selectina em sua superfície, onde as plaquetas se aderem e são ativadas52. As
plaquetas ativadas translocam moléculas de adesão para sua superfície, que são ligantes para
leucócitos e outras plaquetas, e ocorre, assim, agregação plaquetária com posterior liberação do
conteúdo dos seus grânulos13. A serotonina leva à vasoconstrição, o ADP estimula a liberação
dos grânulos de outras plaquetas e outros agentes liberados levam à ativação da fosfolipase A2
da membrana plaquetária. Segue-se a liberação do ácido araquidônico, que é convertido em
tromboxano A2 e também causa agregação plaquetária e liberação de fatores de crescimento.
Assim é formado um plug plaquetário, que contém a hemorragia e protege o local da injúria
contra a entrada de microrganismos. Esse processo é denominado hemostasia primária53.
A hemostasia secundária é caracterizada pela ativação dos fatores de coagulação e
pela formação da rede de fibrina que estabiliza o plug plaquetário54. O evento seguinte é a
fibrinólise, em que o sistema fibrinolítico é ativado através de citocinas liberadas por leucócitos
que foram recrutados pelos fatores de crescimento e citocinas previamente liberados pelas
plaquetas5. Dessa forma, plaquetas e proteínas liberadas por seus grânulos participam de todas
as etapas da hemostasia.
b) Cicatrização de feridas
A cicatrização é um processo complexo, que envolve uma série de interações entre
células e matriz extracelular. As plaquetas também são importantes nesse processo e participam
de todas as fases, através da liberação dos fatores de crescimento, que são mediadores de vários
16
c) Imunidade
Os chamados ligantes hemostáticos como trombina, tromboxano A2 e ADP
exercem função na regulação da inflamação e, consequentemente, na resposta imunológica61.
A inibição terapêutica da trombina mostrou resultados promissores em doenças hepáticas62,
sepse63 e lesão renal de isquemia e reperfusão64. O bloqueio dos receptores de ADP pode
atenuar a inflamação na sepse65. Além disso, as plaquetas expressam vários receptores toll-like,
reconhecedores de patógenos, e têm a habilidade de se ligar a bactérias e formar agregados,
através de mecanismo patógeno-dependente66.
As plaquetas possuem capacidade de englobar bactérias e vírus menores por
mecanismo similar à fagocitose67. Esses micro-organismos usam dessa capacidade para driblar
a resposta imune do hospedeiro68 e, dessa forma, as plaquetas podem ajudar na sua
disseminação69. Aparentemente as plaquetas são incapazes de lisar os patógenos internalizados
por não possuírem organelas bactericidas, mas podem auxiliar na sua eliminação70 pela
liberação de peptídeos antimicrobianos, incluindo quimiocinas clássicas68.
A interação com células da resposta imunológica se dá através da formação de
agregados leucócito-plaquetários, cuja presença tem sido identificada como parâmetro clínico
para avaliação da severidade da sepse71. A interação entre plaquetas e neutrófilos apresenta
meia-vida curta, mas faz sinalização a outros leucócitos, ativa as integrinas de outros
neutrófilos, promove degranulação de outras plaquetas e aumenta a fagocitose72. Os agregados
formados rapidamente, abundantemente e de forma estável são aqueles entre monócitos e
17
2.4.1. Definição
O PRP é uma preparação de plasma autólogo enriquecido com concentração
plaquetária acima daquela contida no sangue total77. O seu potencial terapêutico é atribuído à
capacidade das plaquetas de liberar e suprir quantidades suprafisiológicas de fatores de
crescimento essenciais e citocinas, que promovem estímulo regenerativo, melhorando o
processo de cicatrização78.
Os primeiros relatos de seu uso clínico são das décadas de 1980/1990, em cirurgia
cardíaca, dental e maxilofacial79,80. Atualmente, o PRP ganhou popularidade na medicina
regenerativa, esportiva e musculoesquelética, com seus potenciais benefícios no tratamento de
ampla gama de desordens degenerativas, devido à sua influência no reparo 81. Porém, ainda há
muitas questões a investigar a respeito do uso e da eficácia desse produto, como métodos de
obtenção e dose adequada para cada tipo de tratamento, melhor randomização dos estudos
clínicos, utilização de maior número de amostras nos estudos, acompanhamento posterior por,
no mínimo, dois anos e comparação entre preparados com ou sem leucócitos78.
2.4.3. Componentes
Apesar de ser um concentrado de plaquetas, o PRP também possui outras células
sanguíneas em menor quantidade, como leucócitos e hemácias. As plaquetas, como descrito,
exercem ação central na mediação dos efeitos anabólicos do PRP pela liberação do conteúdo
dos seus grânulos, e são responsáveis pelo estímulo ao recrutamento, diferenciação,
comunicação e migração celular, além da formação da matriz de fibrina e outras funções
essenciais86. A concentração ideal de plaquetas a ser obtida no PRP ainda é controversa e
necessita de mais estudos. Dados da literatura sugerem que concentrações de duas a quatro
vezes maiores do que a do sangue total devem ser atingidas, e que quantidades muito maiores
podem não trazer benefício ou até mesmo inibir o reparo91. Os dispositivos de separação mais
recentes obtêm concentração de plaquetas seis a dez vezes maior do que a do sangue total, o
que tende a ser um parâmetro qualitativo para os fabricantes5.
Os leucócitos são mediadores essenciais nas respostas inflamatória e imunológica,
e no processo de cicatrização92. Os neutrófilos são recrutados logo no início da fase inflamatória
do reparo, enquanto que monócitos e macrófagos são responsáveis pela fagocitose de bactérias
19
2.4.4. Aplicações
O PRP é um produto seguro por ser derivado do sangue autólogo, o que minimiza
o risco de transmissão de doenças infectocontagiosas. Porém, deve-se realizar avaliação
hematológica antes do seu uso, de forma a excluir disfunções plaquetárias. O uso do PRP é
contraindicado quando a contagem de plaquetas é inferior a 105/μl, a hemoglobina inferior a
10g/dl ou quando houver tumores, doenças metastáticas ou outras infecções ativas5.
A aplicação do PRP não é recomendada em indivíduos que estejam recebendo
medicação antiplaquetária, pois pode haver inibição da degranulação e liberação dos fatores de
crescimento. Agentes antiplaquetários estão presentes em fármacos de várias classes, como
inibidores reversíveis e irreversíveis de cicloxigenases, inibidores de receptores de ADP e
inibidores de fosfodiesterase94. O PRP autólogo produzido com o sangue de indivíduos que
fazem uso de anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) apresenta redução na agregação
plaquetária e, consequentemente, em seu potencial terapêutico95.
20
REFERÊNCIAS
1. Goss J. Regeneration versus repair. In: Cohen I, Diegelmann R, Lindblad W, editors. Wound
healing. Philadelphia: WB Saunders; 1992. p. 40-62.
2. Bertone AL. Management of exuberant granulation tissue. Vet Clin North Am Equine Pract.
1989;5(3):551-62.
3. Dugrillon A, Klüter H. Current Use of Platelet Concentrates for Topical Application in Tissue
Repair. Transfus Med Hemother. 2017;29(2):67-70.
4. Stadelmann WK, Digenis AG, Tobin GR. Physiology and healing dynamics of chronic
cutaneous wounds. Am J Surg. 1998;176(2A Suppl):26s-38s.
5. Everts PA, Knape JT, Weibrich G, Schonberger JP, Hoffmann J, Overdevest EP, et al. Platelet-
rich plasma and platelet gel: a review. J Extra Corpor Technol. 2006;38(2):174-87.
6. DeRossi R, Coelho AC, Mello GS, Frazilio FO, Leal CR, Facco GG, et al. Effects of platelet-
rich plasma gel on skin healing in surgical wound in horses. Acta Cir Bras. 2009;24(4):276-81.
7. Dahlgren L. Skin grafting. In: Robinson E, Sprayberry K, editors. Current Therapy in Equine
Medicine. 6 ed. St. Louis: Saunders; 2009. p. 721-26.
8. Souza MV, Pinto JO, Costa MM, et al. Quantificação de fatores de crescimento na pele de
equinos tratada com plasma rico em plaquetas. Pesq Vet Bras. 2014;34(6):599-612.
9. Theoret C. Physiology of wound healing. In: Theoret C, Schumacher J, editors. Equine Wound
Management. 3 ed. Iowa: John Wiley & Sons, Inc.; 2017. p. 1-13.
10. Wulff BC, Wilgus TA. Mast cell activity in the healing wound: more than meets the eye? Exp
Dermatol. 2013;22(8):507-10.
11. Jones T, Hunt R, King N. Patologia Veterinária. 6 ed. São Paulo: Manole; 1997. 1415p.
12. de Groot PG, Urbanus RT, Roest M. Platelet interaction with the vessel wall. Handb Exp
Pharmacol. 2012(210):87-110.
13. Herter JM, Rossaint J, Zarbock A, et al. Platelets in inflammation and immunity. J Thromb
Haemost. 2017;12(11):1764-75.
14. Singer AJ, Clark RA. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 1999;341(10):738-46.
15. Mahdavian BD, van der Veer WM, van Egmond M, Niessen FB, Beelen RH. Macrophages in
skin injury and repair. Immunobiology. 2011;216(7):753-62.
16. Novak ML, Koh TJ. Phenotypic transitions of macrophages orchestrate tissue repair. Am J
Pathol. 2013;183(5):1352-63.
17. Greenhalgh DG. The role of apoptosis in wound healing. Int J Biochem Cell Biol.
1998;30(9):1019-30.
18. Bodnar RJ, Yates CC, Rodgers ME, Du X, Wells A. IP-10 induces dissociation of newly formed
blood vessels. J Cell Sci. 2009;122(Pt 12):2064-77.
19. Wietecha MS, Chen L, Ranzer MJ, Anderson K, Ying C, Patel TB, et al. Sprouty2
downregulates angiogenesis during mouse skin wound healing. Am J Physiol Heart Circ Physiol.
2011;300(2):H459-67.
20. Zhu WH, Guo X, Villaschi S, Francesco RN. Regulation of vascular growth and regression by
matrix metalloproteinases in the rat aorta model of angiogenesis. Lab Invest. 2000;80(4):545-55.
21. Pastar I, Stojadinovic O, Yin NC, Ramirez H, Nusbaum AG, Sawaya A, et al. Epithelialization
in Wound Healing: A Comprehensive Review. Adv Wound Care (New Rochelle). 2014. p. 445-64.
22. Wong VW, Gurtner GC, Longaker MT. Wound healing: a paradigm for regeneration. Mayo
Clin Proc. 2013;88(9):1022-31.
21
23. Desmoulière A, Redard M, Darby I, Gabbiani G. Apoptosis mediates the decrease in cellularity
during the transition between granulation tissue and scar. Am J Pathol. 1995;146(1):56-66.
24. Grinnell F, Zhu M, Carlson MA, Abrams JM. Release of mechanical tension triggers apoptosis
of human fibroblasts in a model of regressing granulation tissue. Exp Cell Res. 1999;248(2):608-19.
25. Schumacher J, Wilmink J. Free Skin Grafting. Equine Wound Management. 3 ed. Ames, Iowa:
John Wiley & Sons, Inc; 2017. p. 422-48.
26. Booth LC. Split-thickness autogenous skin transplantation in the horse. J Am Vet Med Assoc.
1982;180(7):754-7.
27. Wilson DG. Applications of skin grafting in large animals. Probl Vet Med. 1990;2(3):442-62.
28. May SR. The effects of biological wound dressings on the healing process. Clin Mater.
1991;8(3-4):243-9.
29. Frankland AL. Autologous split skin transplantation on the lower limbs of horses. Vet Rec.
1979;104(26):590-5.
30. Hogle R, Kingrey BW, Jensen EC. Skin grafting in the horse. J Am Vet Med Assoc.
1959;135(3):165-70.
31. Teh BT. Why do skin grafts fail? Plast Reconstr Surg. 1979;63(3):323-32.
32. Tavis MJ, Thornton JW, Harney JH, Danet RT, Woodroof EA, Bartlett RH. Mechanism of skin
graft adherence: collagen, elastin, and fibrin interactions. Surg Forum. 1977;28:522-4.
33. Vistnes LM. Grafting of Skin. Surg Clin North Am. 1977;57(5):939-60.
34. Converse JM, Smahel J, Ballantyne DL, Jr., Harper AD. Inosculation of vessels of skin graft
and host bed: a fortuitous encounter. Br J Plast Surg. 1975;28(4):274-82.
35. Rudolph R. Inhibition of myofibroblasts by skin grafts. Plast Reconstr Surg. 1979;63(4):473-
80.
36. Bristol DG. Skin grafts and skin flaps in the horse. Vet Clin North Am Equine Pract.
2005;21(1):125-44.
37. French DA, Fretz PB. Treatment of equine leg wounds using skin grafts: Thirty-five cases,
1975-1988. Can Vet J. 1990;31(11):761-5.
38. Flowers RS. Unexpected postoperative problems in skin grafting. Surg Clin North Am.
1970;50(2):439-56.
39. Eade GG. The relationship between granulation tissue, bacteria, and skin grafts in burned
patients. Plast Reconstr Surg Transplant Bull. 1958;22(1):42-55.
40. Wilmink JM, van Weeren PR, Stolk PW, Van Mil FN, Barneveld A. Differences in second-
intention wound healing between horses and ponies: histological aspects. Equine Vet J. 1999;31(1):61-
7.
41. Meagher DM, Adams OR. Split-thickness autologous skin transplantation in horses. J Am Vet
Med Assoc. 1971;159(1):55-60.
42. Robson MC, Edstrom LE, Krizek TJ, Groskin MG. The efficacy of systemic antibiotics in the
treatment of granulating wounds. J Surg Res. 1974;16(4):299-306.
43. Boon RJ, Beale AS. Response of Streptococcus pyogenes to therapy with amoxicillin or
amoxicillin-clavulanic acid in a mouse model of mixed infection caused by Staphylococcus aureus and
Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother. 1987;31(8):1204-9.
44. Šmahel J. Free skin transplantation on a prepared bed. Brit J Plast Surg. 1971;24:129-32.
45. Wilmink JM, Van Weeren PR. Treatment of exuberant granulation tissue. Clin Tech Equine
Pract. 2004;3(2):141-7.
22
46. Edlich RF, Schmolka IR, Prusak MP, Edgerton MT. The molecular basis for toxicity of
surfactants in surgical wounds. J Surg Res. 1973;14(4):277-84.
47. Stashak T. Equine Wound Management. Philadelphia: Lea and Febiger. 1991.
48. Smith BW, Murphy GJ. Stem cells, megakaryocytes, and platelets. Curr Opin Hematol.
2014;21(5):430-7.
49. Burkhart JM, Vaudel M, Gambaryan S, Radau S, Walter U, Martens L, et al. The first
comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative
analysis of structural and functional pathways. Blood. 2012;120(15):e73-82.
50. White GC, Rompietti R. Platelet secretion: indiscriminately spewed forth or highly
orchestrated? J Thromb Haemost. 2007;5(10):2006-8.
51. Italiano JE, Jr., Richardson JL, Patel-Hett S, Battinelli E, Zaslavsky A, Short S, et al.
Angiogenesis is regulated by a novel mechanism: pro- and antiangiogenic proteins are organized into
separate platelet alpha granules and differentially released. Blood. 2008;111(3):1227-33.
52. Ruggeri ZM, Mendolicchio GL. Adhesion mechanisms in platelet function. Circ Res.
2007;100(12):1673-85.
53. Sixma JJ, Sakariassen KS, Beeser-Visser NH, Ottenhof-Rovers M, Bolhuis PA. Adhesion of
platelets to human artery subendothelium: effect of factor VIII-von Willebrand factor of various
multimeric composition. Blood. 1984;63(1):128-39.
54. Dhall TZ, Shah GA, Ferguson IA, Dhall DP. Fibrin network structure: modification by platelets.
Thromb Haemost. 1983;49(1):42-6.
55. McGrath MH. Peptide growth factors and wound healing. Clin Plast Surg. 1990;17(3):421-32.
56. Pakyari M, Farrokhi A, Maharlooei MK, Ghahary A. Critical Role of Transforming Growth
Factor Beta in Different Phases of Wound Healing. Adv Wound Care (New Rochelle). 22013. p. 215-
24.
57. Pierce GF, Mustoe TA, Altrock BW, Deuel TF, Thomason A. Role of platelet-derived growth
factor in wound healing. J Cell Biochem. 1991;45(4):319-26.
58. Mustoe TA, Pierce GF, Morishima C, Deuel TF. Growth factor-induced acceleration of tissue
repair through direct and inductive activities in a rabbit dermal ulcer model. J Clin Invest.
1991;87(2):694-703.
59. Nanney LB. Epidermal and dermal effects of epidermal growth factor during wound repair. J
Invest Dermatol. 1990;94(5):624-9.
60. Stenberg BD, Phillips LG, Hokanson JA, Heggers JP, Robson MC. Effect of bFGF on the
inhibition of contraction caused by bacteria. J Surg Res. 1991;50(1):47-50.
61. Ma L, Dorling A. The roles of thrombin and protease-activated receptors in inflammation.
Semin Immunopathol. 2012;34(1):63-72.
62. Kassel KM, Sullivan BP, Cui W, Copple BL, Luyendyk JP. Therapeutic administration of the
direct thrombin inhibitor argatroban reduces hepatic inflammation in mice with established fatty liver
disease. Am J Pathol. 2012;181(4):1287-95.
63. Kalle M, Papareddy P, Kasetty G, Morgelin M, van der Plas MJ, Rydengard V, et al. Host
defense peptides of thrombin modulate inflammation and coagulation in endotoxin-mediated shock and
Pseudomonas aeruginosa sepsis. PLoS One. 2012;7(12):e51313.
64. Thuillier R, Favreau F, Celhay O, Macchi L, Milin S, Hauet T. Thrombin inhibition during
kidney ischemia-reperfusion reduces chronic graft inflammation and tubular atrophy. Transplantation.
2010;90(6):612-21.
23
65. Totani L, Dell'Elba G, Martelli N, Di Santo A, Piccoli A, Amore C, et al. Prasugrel inhibits
platelet-leukocyte interaction and reduces inflammatory markers in a model of endotoxic shock in the
mouse. Thromb Haemost. 2012;107(6):1130-40.
66. Kastrup CJ, Boedicker JQ, Pomerantsev AP, Moayeri M, Bian Y, Pompano RR, et al. Spatial
localization of bacteria controls coagulation of human blood by 'quorum acting'. Nat Chem Biol.
2008;4(12):742-50.
67. Youssefian T, Drouin A, Masse JM, Guichard J, Cramer EM. Host defense role of platelets:
engulfment of HIV and Staphylococcus aureus occurs in a specific subcellular compartment and is
enhanced by platelet activation. Blood. 2002;99(11):4021-9.
68. Yeaman MR. Platelets in defense against bacterial pathogens. Cell Mol Life Sci. 672010. p.
525-44.
69. Kahn F, Hurley S, Shannon O. Platelets promote bacterial dissemination in a mouse model of
streptococcal sepsis. Microbes Infect. 2013;15(10-11):669-76.
70. McMorran BJ, Wieczorski L, Drysdale KE, Chan JA, Huang HM, Smith C, et al. Platelet factor
4 and Duffy antigen required for platelet killing of Plasmodium falciparum. Science.
2012;338(6112):1348-51.
71. Gawaz M, Fateh-Moghadam S, Pilz G, Gurland HJ, Werdan K. Platelet activation and
interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. Eur J Clin Invest.
1995;25(11):843-51.
72. Page C, Pitchford S. Neutrophil and platelet complexes and their relevance to neutrophil
recruitment and activation. Int Immunopharmacol. 2013;17(4):1176-84.
73. van Gils JM, Zwaginga JJ, Hordijk PL. Molecular and functional interactions among
monocytes, platelets, and endothelial cells and their relevance for cardiovascular diseases. J Leukoc
Biol. 2009;85(2):195-204.
74. Scull CM, Hays WD, Fischer TH. Macrophage pro-inflammatory cytokine secretion is
enhanced following interaction with autologous platelets. J Inflamm (Lond). 2010;7:53.
75. Hamzeh-Cognasse H, Cognasse F, Palle S, Chavarin P, Olivier T, Delezay O, et al. Direct
contact of platelets and their released products exert different effects on human dendritic cell maturation.
BMC Immunol. 2008;9:54.
76. Li N. Platelet-lymphocyte cross-talk. J Leukoc Biol. 2008;83(5):1069-78.
77. Malanga GA, Goldin M. PRP: review of the current evidence for musculoskeletal conditions.
Cur Phys Med Rehabil Rep. 2014;2(1):1-15.
78. Wu PI, Diaz R, Borg-Stein J. Platelet-Rich Plasma. Phys Med Rehabil Clin N Am.
2016;27(4):825-53.
79. DelRossi AJ, Cernaianu AC, Vertrees RA, Wacker CJ, Fuller SJ, Cilley JH, Jr., et al. Platelet-
rich plasma reduces postoperative blood loss after cardiopulmonary bypass. J Thorac Cardiovasc Surg.
1990;100(2):281-6.
80. Ferrari M, Zia S, Valbonesi M, Henriquet F, Venere G, Spagnolo S, et al. A new technique for
hemodilution, preparation of autologous platelet-rich plasma and intraoperative blood salvage in cardiac
surgery. Int J Artif Organs. 1987;10(1):47-50.
81. Nguyen RT, Borg-Stein J, McInnis K. Applications of platelet-rich plasma in musculoskeletal
and sports medicine: an evidence-based approach. Pm r. 2011;3(3):226-50.
82. DeLong JM, Russell RP, Mazzocca AD. Platelet-rich plasma: the PAW classification system.
Arthroscopy. 2012;28(7):998-1009.
24
83. Davis VL, Abukabda AB, Radio NM, Witt-Enderby PA, Clafshenkel WP, Cairone JV, et al.
Platelet-rich preparations to improve healing. Part I: workable options for every size practice. J Oral
Implantol. 2014;40(4):500-10.
84. Marx RE, Carlson ER, Eichstaedt RM, Schimmele SR, Strauss JE, Georgeff KR. Platelet-rich
plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.
1998;85(6):638-46.
85. Roh YH, Kim W, Park KU, Oh JH. Cytokine-release kinetics of platelet-rich plasma according
to various activation protocols. Bone Joint Res. 2016;5(2):37-45.
86. Scherer SS, Tobalem M, Vigato E, Heit Y, Modarressi A, Hinz B, et al. Nonactivated versus
thrombin-activated platelets on wound healing and fibroblast-to-myofibroblast differentiation in vivo
and in vitro. Plast Reconstr Surg. 2012;129(1):46e-54e.
87. Lacoste E, Martineau I, Gagnon G. Platelet concentrates: effects of calcium and thrombin on
endothelial cell proliferation and growth factor release. J Periodontol. 2003;74(10):1498-507.
88. Zehnder JL, Leung LL. Development of antibodies to thrombin and factor V with recurrent
bleeding in a patient exposed to topical bovine thrombin. Blood. 1990;76(10):2011-6.
89. Tsay RC, Vo J, Burke A, Eisig SB, Lu HH, Landesberg R. Differential growth factor retention
by platelet-rich plasma composites. J Oral Maxillofac Surg. 2005;63(4):521-8.
90. Braune S, Walter M, Schulze F, Lendlein A, Jung F. Changes in platelet morphology and
function during 24 hours of storage. Clin Hemorheol Microcirc. 2014;58(1):159-70.
91. Boswell SG, Schnabel LV, Mohammed HO, Sundman EA, Minas T, Fortier LA. Increasing
platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in
tendons. Am J Sports Med. 2014;42(1):42-9.
92. Boswell SG, Cole BJ, Sundman EA, Karas V, Fortier LA. Platelet-rich plasma: a milieu of
bioactive factors. Arthroscopy. 2012;28(3):429-39.
93. McCarrel TM, Minas T, Fortier LA. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich
plasma for the treatment of tendinopathy. J Bone Joint Surg Am. 2012;94(19):e143(1-8).
94. Varon D, Spectre G. Antiplatelet agents. Hematology Am Soc Hematol Educ Program.
2009:267-72.
95. Schippinger G, Prüller F, Divjak M, Mahla E, Fankhauser F, Rackemann S, et al. Autologous
Platelet-Rich Plasma Preparations: Influence of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs on Platelet
Function. Orthop J Sports Med. 32015.
25
ABSTRACT: There is no consensus in the literature about the best method of obtaining platelet
rich plasma (PRP) or ideal platelet concentration with the objective of positive results in
stimulating tissue repair. In addition, some methods described are difficult to reproduce.
Therefore, the objective of this study was to develop a method of obtaining PRP that is simple,
cheap and reproducible. The method was standardized in horses and the protocol used was
based on double centrifugation, the first one at 900 rpm for one minute and the second at 1800
rpm for five minutes. It is concluded that the double centrifugation method, one in low and one
in high rotation, results in PRP with platelet concentration, on average, 3,23 times above the
basal total blood concentration, which is considered adequate for therapeutic use. Moreover,
the protocol applied is a simple, easily reproducible and low-cost method to obtain autologous
PRP in horses.
INTRODUÇÃO
desde o início dos anos 2000 em tratamento de feridas, tendinites, desmites, osteoartrites e
consolidação de fraturas11.
Os métodos descritos para a obtenção do PRP consistem em centrifugações, com o
objetivo de concentrar as plaquetas e reduzir hemácias e leucócitos12. São descritos dois tipos
de protocolo. O primeiro consiste em uma centrifugação lenta e curta, com isolamento do
plasma e plaquetas e redução da concentração de hemácias e leucócitos. Nesse caso, obtém-se
um número de plaquetas de uma a três vezes acima do nível sérico basal do indivíduo; o segundo
consiste em duas centrifugações, sendo a segunda mais rápida e longa que a primeira. Nesse
caso, obtém-se um número maior de plaquetas, de três a oito vezes acima do nível sérico basal
do indivíduo, porém hemácias e leucócitos permanecem no preparo.
Há vasta literatura acerca do PRP, porém os estudos são distintos entre si no que
diz respeito, principalmente, à metodologia aplicada a sua obtenção. Dessa forma, há
dificuldade na padronização de novos estudos e comparação dos resultados a partir dos
trabalhos disponíveis13. Dessa forma, objetivou-se padronizar uma técnica simples, barata e
facilmente reprodutível para a obtenção do PRP em concentração terapêutica adequada, a fim
de tornar seu uso uma alternativa viável na prática da clínica de equinos.
MATERIAL E MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSSÃO
CONCLUSÃO
Conclui-se que o método de dupla centrifugação, com a primeira a 900 rpm, por um
minuto, e a segunda a 1800 rpm, por cinco minutos, resulta em PRP com concentração
plaquetária, em média, 3,23 vezes acima da concentração basal do sangue total, o que é
considerado adequado ao uso terapêutico. Ainda, o protocolo aplicado constitui-se em método
simples, facilmente reprodutível e de baixo custo à obtenção do PRP autólogo em equinos.
32
REFERÊNCIAS
21. Weibrich G, Hansen T, Kleis W, Buch R, Hitzler WE. Effect of platelet concentration in platelet-
rich plasma on peri-implant bone regeneration. Bone. 2004;34(4):665-71.
22. Giusti I, Rughetti A, D'Ascenzo S, Millimaggi D, Pavan A, Dell'Orso L, et al. Identification of
an optimal concentration of platelet gel for promoting angiogenesis in human endothelial cells.
Transfusion. 2009;49(4):771-8.
23. Anitua E, Aguirre JJ, Algorta J, Ayerdi E, Cabezas AI, Orive G, et al. Effectiveness of
autologous preparation rich in growth factors for the treatment of chronic cutaneous ulcers. J Biomed
Mater Res B Appl Biomater. 2008;84(2):415-21.
24. Anitua E, Orive G, Pla R, Roman P, Serrano V, Andia I. The effects of PRGF on bone
regeneration and on titanium implant osseointegration in goats: a histologic and histomorphometric
study. J Biomed Mater Res A. 2009;91(1):158-65.
25. Sanchez M, Anitua E, Azofra J, Prado R, Muruzabal F, Andia I. Ligamentization of tendon
grafts treated with an endogenous preparation rich in growth factors: gross morphology and histology.
Arthroscopy. 2010;26(4):470-80.
26. Graziani F, Ivanovski S, Cei S, Ducci F, Tonetti M, Gabriele M. The in vitro effect of different
PRP concentrations on osteoblasts and fibroblasts. Clin Oral Implants Res. 2006;17(2):212-9.
27. Andrade MG, de Freitas Brandao CJ, Sa CN, de Bittencourt TC, Sadigursky M. Evaluation of
factors that can modify platelet-rich plasma properties. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod. 2008;105(1):e5-e12.
34
RESUMO: Este estudo avaliou a ação do PRP autólogo em feridas cutâneas, contendo
autoenxertos de pele em equinos. Foram utilizados sete equinos hígidos, nos quais foram
produzidas duas feridas cutâneas de 6 x 6 cm, em cada um dos lados da região glútea. Oito dias
após a indução das feridas, foram realizados enxertos com fragmentos de pele colhidos do
pescoço, assim como a aplicação do PRP, preparado através de protocolo de dupla
centrifugação. As feridas com autoenxertos do lado esquerdo receberam PRP, compondo o
grupo tratado (grupo T), e as com autoenxertos do lado direito não receberam tratamento,
compondo o grupo controle (grupo C). Foram realizadas avaliações macroscópica e
microscópica, considerando as variáveis integração dos autoenxertos e retração das bordas da
ferida, além de neovascularização, infiltrado inflamatório, fibroblastos jovens, colagenização,
reepitelização, integração dos autoenxertos e espessura da epiderme. Não houve diferença entre
os grupos (p>0,05) em relação à maioria das variáveis macroscópicas e microscópicas.
Contudo, a neovascularização foi significativamente maior (p=0,0191) no GT, no 14º dia após
a realização da enxertia. Conclui-se que o PRP favorece o processo de reparo da pele com
autoenxertos em equinos, já que aumenta a neovascularização na fase inicial da cicatrização da
ferida. Ainda, o PRP parece influenciar positivamente a integração dos autoenxertos de pele e
a retração das bordas da ferida.
ABSTRACT: This study evaluated the action of autologous PRP on cutaneous wounds,
containing skin autografts, in the gluteal region of horses. Seven healthy horses, aged between
3-18 years and mean live weight of 350 kg, were used. Two 6 x 6 cm cutaneous wounds were
produced on each side of the gluteal region. Eight days after wound induction, grafts were
performed with skin fragments harvested from the neck, as well as the application of PRP,
prepared by double-centrifugation protocol. Wounds with autografts on the left side received
PRP, composing the treated group (group T), and those with autografts on the right side did not
receive treatment, composing the control group (group C). Macroscopic and microscopic
evaluations were performed, considering the integration of autografts and retraction of wound
edges, as well as neovascularization, inflammatory infiltrate, young fibroblasts,
collagenization, reepithelization, autografts integration and epidermal thickness. There was no
difference between the groups (p> 0.05) in relation to most macroscopic and microscopic
variables. However, neovascularization was significantly greater (p = 0.0191) in WG, on the
14th day after grafting. It is concluded that PRP favors the process of skin repair with autografts
in horses, since it increases the neovascularization in the initial phase of wound healing.
Furthermore, the PRP seems to positively influence the integration of the skin autografts and
the retraction of the wound edges.
Keywords: Granulation tissue, retraction of the wound edges, skin grafts, wound healing.
35
INTRODUÇÃO
a ação do PRP autólogo em feridas cutâneas contendo autoenxertos na região glútea de equinos,
por meio de avaliações macroscópicas e microscópicas.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção do PRP
Algumas horas antes da aplicação dos autoenxertos, o PRP foi preparado. Para isso,
20 ml de sangue de cada animal foram colhidos, através de punção jugular, com o auxílio de
agulha 21G e tubos a vácuo com citrato de sódio a 3,2%. Para a obtenção do PRP foi utilizado
protocolo adaptado de Carmona17, com dupla centrifugação, sendo a primeira por 1 min, a 900
rpm, e a segunda por 5 min, a 1800 rpm. O PRP foi utilizado imediatamente após o seu preparo.
Avaliação macroscópica
Macroscopicamente, a integração dos autoenxertos foi avaliada aos dias 14 e 28
após a realização do procedimento de enxertia, considerando-se a quantidade de fragmentos de
38
pele que permaneceram no local do implante. Dessa forma, foram considerados os valores de
100%, 83%, 66%, 50%, 33% e 16% para a integração de seis, cinco, quatro, três, dois e um
autoenxertos, respectivamente. A retração das bordas da ferida foi avaliada por morfometria, a
partir de fotografias digitais, obtidas semanalmente, até o 35º dia após a realização do
procedimento de enxertia, perfazendo sete momentos de avaliação. Foi utilizado paquímetro
como referência para a avaliação computadorizada, que foi realizada com o programa Image
J®, através do qual se obteve a área de granulação da ferida nos sete momentos de avaliação.
Avaliação microscópica
Foram realizadas biopsias das feridas, com o auxílio de bisturi com lâmina nº 15,
aos dias 14, 28 e 35 após a inserção dos autoenxertos, de ambas as feridas, contemplando uma
porção do fragmento enxertado e uma porção do tecido de granulação. Os fragmentos foram
fixados em formalina tamponada a 10% por 48 horas, processados, incluídos em parafina e
corados com hematoxilina e eosina (HE). A avaliação foi realizada em microscópio óptico,
considerando as variáveis intensidade de neovascularização, infiltrado inflamatório,
fibroblastos jovens e colagenização, para as quais, quando presentes, foram atribuídos os
escores discreto (1), moderado (2) e acentuado (3). Também foi avaliada a integração do
autoenxerto, considerada presente quando da continuidade tecidual observada entre o tecido de
granulação do leito receptor e a derme do fragmento implantado. Ainda, quanto à reepitelização,
esta foi considerada completa quando constatada continuidade entre o epitélio do fragmento
implantado e aquele das bordas da ferida ou incompleta quando da descontinuidade. Para a
variável acantose, realizou-se a média da espessura de três pontos da epiderme em cada
fragmento.
Análise estatística
A análise estatística dos parâmetros avaliados foi realizada inicialmente de forma
quantitativa, calculando-se a média e desvio padrão para as variáveis paramétricas e a mediana
para as variáveis não paramétricas. Posteriormente, as variáveis paramétricas foram submetidas
à análise de variância (ANOVA) e ao Teste de Tukey. Destas, as que não apresentaram
normalidade pelo Teste de Shapiro-Wilk, foram então submetidas ao teste não-paramétrico
Kruskal-Wallis. Diferenças estatísticas foram consideradas quando do valor de probabilidade
menor que 0,05 (p<0,05) na tabela ANOVA. Variáveis não paramétricas foram analisadas pelo
teste de Wilcoxon (Teste T) para dados pareados. Para a análise dos dados utilizou-se o
programa estatístico R (Versão 3.3.1 – 2016 – The R Foundation for Statistical Computing).
39
RESULTADOS
120
100
80
60 C/ PRP
S/ PRP
40
20
0
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7
40
35
30
25
20 COM PRP
15 SEM PRP
10
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
FIGURA 3 - Fotomicrografias da ferida da pele de equino ao 14º dia após a realização de procedimento
de enxertia. A) Neovascularização acentuada (escore 3), em ferida cutânea de animal do
grupo (T). B) Neovascularização discreta (escore 1), observada em ferida de pele de
equino do grupo (C). HE, objetiva 10x.
43
DISCUSSÃO
do gel de PRP foi avaliado, associado a enxertos de pele, no tratamento de úlceras crônicas em
pacientes diabéticos e resultados significativamente melhores em relação à integração no grupo
tratado foram encontrados23. Ainda, outro trabalho24, relatou menor perda de enxertos ao avaliar
o efeito do gel de PRP na cicatrização de enxertos cutâneos de equinos. O resultado dessas
pesquisas, somado ao fato de todos os animais tratados deste estudo terem apresentado 100%
de integração dos autoenxertos, reforçam a ideia quanto ao efeito benéfico das plaquetas no
processo de cicatrização de feridas cutâneas tratadas com autoenxertos e PRP.
O resultado macroscópico referente à integração dos fragmentos de pele no GT não
foi observado à avaliação microscópica desta mesma varável, o que pode ser explicado pela
agressão mecânica causada no momento da colheita da amostra. A ligação entre o leito receptor
e o fragmento implantado se dá, inicialmente, pela adesão da fibrina presente na ferida e,
posteriormente, pela neovascularização, proliferação fibroblástica e colagenização. Embora o
enxerto possa ser considerado firmemente aderido após o décimo dia8, a agressão mecânica
causada pela lâmina de bisturi e pinça no momento da realização da biopsia, pode ter colaborado
para o rompimento dessa adesão.
A avaliação morfométrica, em que se considerou macroscopicamente a área da
ferida coberta por epitélio, não demonstrou diferença significativa entre os grupos, apesar de a
maioria das feridas do grupo tratado com PRP apresentar maior epitelização. Aliado a isso, o
tempo de fechamento completo das feridas foi menor em seis animais do grupo tratado. Nesse
contexto, um estudo22 também relatou melhor evolução dos enxertos quando do uso do PRP em
feridas crônicas em humanos. Ainda, outro estudo23 corrobora esses achados, tendo em vista
que os autores relataram menor tempo na completa cicatrização de úlceras cutâneas tratadas
com enxertos de pele e PRP em pacientes diabéticos.
Considera-se que os resultados do grupo tratado com PRP foram positivos à
avaliação macroscópica, mesmo sem diferença estatística entre os grupos. Acerca disso,
pondera-se que resultados mais consistentes poderiam ser obtidos com um maior número
amostral. Além disso, os trabalhos que apresentaram dados macroscópicos significativos em
favor do PRP foram realizados com feridas crônicas, que apresentam baixas quantidades de
fatores de crescimento, devido à diminuição da sua produção ou liberação, sequestro, aumento
da degradação ou a combinação desses fatores25,26. No presente estudo, as feridas eram agudas,
o que pode ter acarretado na ausência de resultados impactantes, tendo em vista que, neste caso,
a modulação da resposta inflamatória foi suficiente para favorecer a adesão dos autoenxertos e
a rápida retração da ferida.
45
das análises histológicas, o que continua gerando controvérsias a respeito da eficácia do PRP.
Apesar deste estudo não demonstrar resultados positivos em relação à resposta inflamatória,
reepitelização e presença de fibroblastos jovens, houve aumento significativo da
neovascularização, o que é um parâmetro importante, uma vez que a angiogênese possui papel
fundamental no processo de cicatrização e na integração dos enxertos ao leito da ferida.
A espessura da epiderme foi avaliada após a realização dos autoenxertos de pele e
não se observou diferença entre os grupos tratado e não tratado. Resultados diferentes foram
encontrados em estudo34 que avaliou a epitelização em sítio doador de enxerto de pele de
espessura parcial em humanos. Os autores relataram que, no grupo tratado com PRP, a
espessura da epiderme foi significativamente maior do que no grupo controle, que apresentou
queratinização insuficiente. Durante a cicatrização, os queratinócitos sofrem migração,
proliferação e diferenciação35, eventos que poderiam ser influenciados positivamente pelo uso
do PRP. No estudo realizado pelos autores citados, o enxerto foi de espessura parcial, enquanto
que no presente estudo foram realizados autoenxertos de espessura total. Além disso, foram
feitas aplicações seriadas de PRP, diferentemente deste estudo, em que foi realizada uma única
aplicação, o que poderia justificar os diferentes resultados encontrados.
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS
1. Cochrane CA, Freeman KL, Knottenbelt DC. Effect of growth factors on the characteristics of
cells associated with equine wound healing and sarcoid formation. Wound Repair and Regeneration.
2017;4(1):58-65.
2. Wilmink JM, van Weeren PR, Stolk PW, Van Mil FN, Barneveld A. Differences in second-
intention wound healing between horses and ponies: histological aspects. Equine Vet J. 1999;31(1):61-
7.
3. Theoret CL, Barber SM, Moyana TN, Gordon JR. Expression of transforming growth factor
beta(1), beta(3), and basic fibroblast growth factor in full-thickness skin wounds of equine limbs and
thorax. Vet Surg. 2001;30(3):269-77.
4. Schwartz AJ, Wilson DA, Keegan KG, Ganjam VK, Sun Y, Weber KT, et al. Factors regulating
collagen synthesis and degradation during second-intention healing of wounds in the thoracic region
and the distal aspect of the forelimb of horses. Am J Vet Res. 2005;63(11):1564-1570.
5. Lepault É, Céleste C, Doré M, Martineau D, Theoret CL. Comparative study on microvascular
occlusion and apoptosis in body and limb wounds in the horse. Wound Repair and Regeneration.
2017;13(5):520-9.
6. Bertone AL. Management of exuberant granulation tissue. Vet Clin North Am Equine Pract.
1989;5(3):551-62.
7. Jones T, Hunt R, King N. Patologia Veterinária. 6 ed ed. São Paulo: Manole; 1997. 1415 p.
8. Schumacher J, Wilmink J. Free Skin Grafting. Equine Wound Management. 1. 3 ed. ed. Ames,
Iowa: John Wiley & Sons, Inc; 2017. p. 422-48.
9. Bristol DG. Skin grafts and skin flaps in the horse. Vet Clin North Am Equine Pract.
2005;21(1):125-44.
10. Dahlgren L. Skin grafting. In: Robinson E, Sprayberry K, editors. Current Therapy in Equine
Medicine. 6 ed. ed. St. Louis: Saunders; 2009. p. 721-26.
11. Marx RE. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP? Implant Dent.
2001;10(4):225-8.
12. Pierce GF, Mustoe TA, Altrock BW, Deuel TF, Thomason A. Role of platelet-derived growth
factor in wound healing. J Cell Biochem. 1991;45(4):319-26.
13. Vendramin FS, Franco D, Franco TR, Brésil. Método de obtenção do gel de plasma rico em
plaquetas autólogo. Rev bras cir plást. 2009;24(2):212-8.
14. Badylak SF. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transpl
Immunol. 2004;12(3-4):367-77.
15. Marx RE. Platelet-rich plasma: evidence to support its use. J Oral Maxillofac Surg.
2004;62(4):489-96.
16. Wu PI, Diaz R, Borg-Stein J. Platelet-Rich Plasma. Phys Med Rehabil Clin N Am.
2016;27(4):825-53.
17. Carmona J. Use of autologous platelet concentrates for the treatment of musculoskeletal injuries
in the horse. Barcelona: Universidade Autonoma de Barcelona; 2006.
18. Lansdown DA, Fortier LA. Platelet-Rich Plasma: Formulations, Preparations, Constituents, and
Their Effects. Operative Techniques in Sports Medicine. 2017;25(1):7-12.
19. Sanchez M, Anitua E, Azofra J, Andia I, Padilla S, Mujika I. Comparison of surgically repaired
Achilles tendon tears using platelet-rich fibrin matrices. Am J Sports Med. 2007;35(2):245-51.
48
20. Hee HT, Majd ME, Holt RT, Myers L. Do autologous growth factors enhance transforaminal
lumbar interbody fusion? Eur Spine J. 2003;12(4):400-7.
21. Bauer JA, Correa L, Lima FLM, Lima LAPA, Pustiglioni FE. Efeitos do plasma rico em
plaquetas no processo de reparação de feridas dérmicas padronizadas em ratos. Periodontia.
2009;19(3):98-108.
22. Vendramin FS, Franco D, et al. Use of autologous platelet-rich plasma in skin grafts surgeries
in chronic wounds. Rev Bras Cir Plást. 2010;25(4):589-94.
23. Tzeng YS, Deng SC, Wang CH, Tsai JC, Chen TM, Burnouf T. Treatment of nonhealing
diabetic lower extremity ulcers with skin graft and autologous platelet gel: a case series. Biomed Res
Int. 2013;2013:837620.
24. Bonfá AF, Nomura RHC, Prado AM, Silveira AB, Dornbusch LPTC, Dornbusch PT. Effect of
platelet-rich plasma gel on graft skin healing in equines. Ciência Animal Brasileira. 2017;18.
25. Crovetti G, Martinelli G, Issi M, Barone M, Guizzardi M, Campanati B, et al. Platelet gel for
healing cutaneous chronic wounds. Transfus Apher Sci. 2004;30(2):145-51.
26. Stadelmann WK, Digenis AG, Tobin GR. Physiology and healing dynamics of chronic
cutaneous wounds. Am J Surg. 1998;176(2A Suppl):26s-38s.
27. Monteiro SO, Lepage OM, Theoret CL. Effects of platelet-rich plasma on the repair of wounds
on the distal aspect of the forelimb in horses. Am J Vet Res. 2009;70(2):277-82.
28. DeRossi R, Coelho AC, Mello GS, Frazilio FO, Leal CR, Facco GG, et al. Effects of platelet-
rich plasma gel on skin healing in surgical wound in horses. Acta Cir Bras. 2009;24(4):276-81.
29. Pazzini JM, De Nardi, Andrigo Barboza. Uso de esponja cirúrgica em enxertos cutâneos
associado ao plasma rico em plaquetas em coelhos (Oryctolagus cuniculus). Rev Bras Med Vet.
2016;38(4):397-405.
30. Carter CA, Jolly DG, Worden CE, Sr., Hendren DG, Kane CJ. Platelet-rich plasma gel promotes
differentiation and regeneration during equine wound healing. Exp Mol Pathol. 2003;74(3):244-55.
31. Vendramin FS, Franco D, Schamall RF, Franco TR, Brésil. Utilização do plasma rico em
plaquetas (PRP) autólogo em enxertos cutâneos em coelhos. Rev bras cir plást. 2010;25(1):4-10.
32. Hermeto LC, Rossi Rd, UFMS MGdS, Brazil, Pádua SBd, Pontes ERJ, UFMS MGdS, Brazil,
et al. Comparative study between fibrin glue and platelet rich plasma in dogs skin grafts. Acta Cir Bras.
2012;27(11):789-94.
33. Kimura A, Ogata H, Yazawa M, Watanabe N, Mori T, Nakajima T. The effects of platelet-rich
plasma on cutaneous incisional wound healing in rats. J Dermatol Sci. 40. Netherlands2005. p. 205-8.
34. Kakudo N, Kushida S, Minakata T, Suzuki K, Kusumoto K. Platelet-rich plasma promotes
epithelialization and angiogenesis in a splitthickness skin graft donor site. Med Mol Morphol.
2011;44(4):233-6.
35. Kurokawa I, Mizutani H, Kusumoto K, Nishijima S, Tsujita-Kyutoku M, Shikata N, et al.
Cytokeratin, filaggrin, and p63 expression in reepithelialization during human cutaneous wound healing.
Wound Repair Regen. 2006;14(1):38-45.
49
ANEXOS