UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS JABOTICABAL

USO DA TINTURA DO LÁTEX DA JANAÚBA (Synadenium

grantii) EM CADELAS COM NEOPLASIA MAMÁRIA

Milena Giovana Magrin

Médica Veterinária

2020
 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS JABOTICABAL

USO DA TINTURA DO LÁTEX DA JANAÚBA (Synadenium

grantii) EM CADELAS COM NEOPLASIA MAMÁRIA

Discente: Milena Giovana Magrin

Orientador: Prof. Dr. Andrigo Barboza de Nardi

Coorientadores: Prof. Dr. Amilcar Tanuri

Prof. Dr. Jorge Luiz Costa Castro

Dissertação apresentada à Faculdade de

Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp,
Campus Jaboticabal, como parte das
exigências para obtenção do título de
Mestre em Cirurgia Veterinária.

2020
 DADOS CURRICULARES DO AUTOR
Milena Giovana Magrin, nascida em Curitiba, estado do Paraná, no dia 30 de
Maio de 1989. Bacharel em Medicina Veterinária pela Universidade Federal do
Paraná (UFPR), em Agosto de 2013. Realizou Curso de Pós-Graduação “Latu
sensu” em Clínica Médica e Cirúrgica de Pequenos Animais, de Fevereiro 2014 a
Fevereiro 2016, pela Universidade Camilo Castelo Branco (UNICASTELO).
Participou como Residente do Programa de Residência Médico Veterinário em
Clínica Cirúrgica de Animais de Companhia da Pontifícia Universidade Católica do
Paraná (PUCPR) de fevereiro de 2015 à Julho de 2017. Ingressante em fevereiro de
2018 como aluna regular do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Veterinária da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Campus de Jaboticabal da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (FCAV-UNESP), nível de
Mestrado, sob orientação do Prof. Dr. Andrigo Barboza de Nardi.
“Penso que, quanto mais indefesa uma criatura, mais ela merece proteção do ser
humano contra a crueldade do ser humano.”
(Mahatma Gandhi)
 Dedico esse trabalho aos meus amados pais, Luiz Carlos e Jussara, que nunca
mediram esforços para apoiar meus sonhos. Ao meu amado irmão Gabriel, pelo
carinho, apoio e amor fraterno. Aos meus antepassados, que carrego comigo em
memória e energia. Aos animais e à Mãe Natureza.
 AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, primeiramente, pela minha saúde e estabilidade, me

permitindo viver plenamente bem para me dedicar a busca dos meus sonhos.
Agradeço aos meus pais Luiz Carlos e Jussara, pela vida que me deram e
ainda me proporcionam. Nunca deixando me faltar absolutamente nada, nem
emocionalmente, fisicamente e financeiramente. Agradeço pelo apoio, incentivo e
amor incondicional de vocês dois.
Agradeço ao meu irmão Gabriel, pelo companheirismo e apoio, não só nesse
projeto, como também em toda a nossa vida. Agradeço pelos ensinamentos
acadêmicos científicos e pelo auxílio na análise estatística desse trabalho.
Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Andrigo Barboza de Nardi, pelo apoio e
orientação nesse projeto de pesquisa do mestrado. Sendo sempre calmo e assertivo
nos ensinamentos e orientações. Saiba que é um exemplo de professor e médico
veterinário para mim, tanto pessoalmente quanto profissionalmente.
Agradeço ao meu coorientador, Prof. Dr. Jorge Castro pelo apoio e incentivo
para a inscrição e realização do mestrado, como também pelo exemplo de professor
e cirurgião oncologista que sempre foi para mim, desde antes da minha residência.
Através do seu exemplo e apoio que eu escolhi ser oncologista.
Agradeço ao meu coorientador, Prof. Dr. Amilcar Tanuri pela idealização
dessa pesquisa e pelo apoio em todas as fases, mesmo de longe. Agradeço pela
constante disponibilidade e credibilidade, como também pelo apoio financeiro à
pesquisa sempre que foi preciso. Admiro sua trajetória acadêmica e seu empenho e
dedicação á ciência, e o parabenizo pelo seu título de membro titular da Academia
Brasileira de Ciências.
Agradeço a Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade
Estadual Paulista – FCAV/UNESP, Câmpus Jaboticabal, por ter sido a minha “casa”
durante esse período, e por ter me dado amparo e me proporcionado possibilidades
de crescimento pessoal e profissional
Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
– CNPq, pela bolsa de estudos concedida por 12 meses, para meu auxílio e
manutenção durante o período do mestrado e realização desse projeto.
 Agradeço ao Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel” da FCAV/UNESP
- Jaboticabal, por ter aberto as portas e me cedido espaço para desenvolver não só
essa pesquisa, como também tantas outras oportunidades de crescimento
acadêmico e profissional. Por me acolherem e caminharem comigo nessa trajetória.
Agradeço a cada profissional ali atuante, como funcionários, colaboradores,
professores, médicos veterinários, enfermeiros, residentes, pós-graduandos e
graduandos. Principalmente aqueles que me auxiliaram nessa pesquisa, como os
integrantes do Laboratório de Patologia Clínica, do Setor de Reprodução, do Setor
de Diagnóstico por Imagem e Anestesiologia.
Agradeço aos meus colegas do Serviço de Oncologia Veterinária – SOV, pela
amizade, companheirismo e apoio durante esses anos de atendimento aos
pacientes oncológicos do HV. Além de aprender muito com vocês, toda essa
experiência não teria sido tão feliz e especial sem cada um vocês. Agradeço aos que
eram especialmente próximos a mim, e que me ajudaram muito para a realização
desse trabalho: Marla, Aline, Celso, Oscar, Noelia, Jorge, Stella, Gabriel, Mariana,
Isabela e Igor.
Agradeço a Dona Izildinha, colaboradora da limpeza do HV, por me ajudar
com a limpeza e manutenção dos canis onde as cadelas do meu experimento
ficavam alojadas. Sempre muito querida e carinhosa comigo e com elas. Muito
obrigada!
Agradeço a Special Dog Company pela parceria e colaboração com a doação
de ração super premium, vasilhas e baldes de armazenamento que foram
destinados à alimentação das cadelas do meu experimento durante todo o período
em que elas ficaram alojadas no Hospital Veterinário.
Agradeço ao Prof. Dr. Felipe Sueiro, CEO do Laboratório VetPat –
Campinas/SP, pela parceria e auxílio com as análises histopatológicas e confecção
das lâminas para análise imuno-histoquímica. Mesmo em um momento tão
complicado como a Pandemia da Covid-19, não mediu esforços para me auxiliar
com essas análises que foram fundamentais para a realização dessa pesquisa.
Muito obrigada!
Agradeço as cachorrinhas, pacientes desse experimento, e seus tutores.
Porque sem elas absolutamente nada disso seria possível. Espero de todo o meu
coração ter sido amável e cuidadosa com vocês, e que eu tenha trazido conforto,
qualidade de vida e esperança para enfrentarem essa luta contra o câncer.
Agradeço aos meus amigos e amigas de Curitiba/PR, minha cidade.
Especialmente as minhas irmãs de coração Bruna Rubert, Marina Rodacki, Paola da
Silva, Thayana Queiroz e Vanessa Grendel. Nossa amizade vai além desse mundo.
Muito obrigada pelo apoio e amizade, sempre se fazendo presentes, mesmo a
muitos quilômetros de distância. Amo vocês, minhas Tapos!
Agradeço especialmente também, ao Daniel Rocha. Não somente pela
incrível amizade e parceria, mas também pelo auxílio na análise das lâminas de
imuno-histoquímica desse experimento. Gratidão eterna!
Finalmente, agradeço as minhas duas cachorrinhas, Tarsila e Nina, e a minha
gatinha, Sagú. Por serem tão especiais, carinhosas e oferecerem a mim tanto amor
incondicional. Por estarem comigo no meu dia-a-dia, e em tantos outros momentos
especiais. Espero poder retribuir todo esse amor e carinho que vocês transmitem a
mim, não só a vocês, mas como também a todos os animais que cruzarão meu
caminho durante a vida. Amo vocês!
 i

SUMÁRIO

Página
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DO PROTOCOLO DA PESQUISA
PELA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA)...................... ii
RESUMO......................................................................................................... iii
ABSTRACT..................................................................................................... iv
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................... v
LISTA DE QUADROS..................................................................................... vi
LISTA DE TABELAS....................................................................................... vii
LISTA DE FIGURAS....................................................................................... viii
1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA..................................................................... 3
2.1 Neoplasias mamárias em cadelas.................................................. 3
2.1.1 Incidência........................................................................... 3
2.1.2 Sinais clínicos e Diagnóstico............................................. 3
2.1.3 Estadiamento..................................................................... 5
2.1.4 Tratamento........................................................................ 6
2.1.5 Prognóstico........................................................................ 8
2.2 Infiltrado inflamatório no tumor de mama........................................ 9
2.3 Elastografia ARFI............................................................................ 12
2.4 Synadenium grantii.......................................................................... 13
3. OBJETIVOS............................................................................................... 15
4. MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................... 15
4.1 Aspectos éticos............................................................................... 15
4.2 Delineamento experimental............................................................. 16
4.2.1 Seleção dos animais.......................................................... 16
4.2.2 Aleatoriedade..................................................................... 16
4.2.3 Preparo da tintura do látex da Janaúba e Dosagem......... 16
4.2.4 Grupos experimentais........................................................ 17
4.2.5 Critérios de inclusão.......................................................... 17
4.2.6 Critérios de exclusão......................................................... 17
4.2.7 Critérios de descontinuidade após inclusão...................... 18
4.2.8 Análise histológica e imuno-histoquímica.......................... 18
4.3 Procedimentos experimentais......................................................... 19
4.4 Análise estatística........................................................................... 20
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 20
6. CONCLUSÕES.......................................................................................... 30
7. REFERÊNCIAS.......................................................................................... 31
ii
 iii

USO DA TINTURA DO LÁTEX DA JANAÚBA (Synadenium grantii) EM

CADELAS COM NEOPLASIA MAMÁRIA

RESUMO – As neoplasias mamárias correspondem aos tumores mais

frequentes nas cadelas. O mesmo ocorre nas mulheres, sendo o câncer de mama o
tumor mais comumente encontrado. Possui alta taxa de morbidade e mortalidade, e
o seu tratamento é considerado um desafio, pois muitos ainda são os efeitos
colaterais indesejáveis causados pelas terapias existentes. Decorrente a isso, são
de extrema importância os estudos relacionados à evolução dos tratamentos e
diminuição dos efeitos colaterais. O objetivo desse trabalho foi comparar entre os
grupos estudados, alterações no tamanho dos neoplasmas mamários de cadelas,
após 90 dias de tratamento com a Tintura do Látex da Janaúba (TLJ). Como
também avaliações ultrassonográficas, análises histopatológicas e imuno-
histoquímicas (CD3+ e granzima) dos neoplasmas mamários e linfonodos inguinais
e axilares. Foram avaliadas cadelas com tumores mamários em estádio I, II e III,
separadas aleatoriamente em 2 grupos (controle e tratamento). Para as avaliações
de tamanho dos tumores foram realizadas mensurações no início, e final do
tratamento. Para avaliação e comparação histológica e imuno-histoquímica foram
obtidas duas amostras de cada paciente, a primeira por meio de biópsia do tumor
mamário, e a segunda após 90 dias de tratamento com a TLJ através da
mastectomia. Avaliações clínicas como análises hematológicas, urinárias e de
imagem também foram realizadas e acompanhadas durante todo o tempo de
pesquisa. Não foram observadas alterações significativas de rejeição ou efeitos
colaterais ao tratamento com a TLJ. Por meio da elastografia-ARFI foi observada
uma diminuição na rigidez tumoral das pacientes do grupo tratado com a TLJ,
sugerindo uma diminuição de malignidade desses tumores. A análise imuno-
histoquímica indicou um aumento na expressão de CD3+ e granzima nos tumores
do grupo tratado em comparação com o grupo controle, porém não houve diferença
estatística significativa. A partir da análise do tamanho tumoral, antes e depois do
tratamento, como resultados não foram observadas alterações. Conclui-se que o uso
via oral da TLJ por 90 dias em cadelas com neoplasia mamária sugere um aumento
na expressão de linfócitos intratumorais, como também diminuição da rigidez
tumoral. Contudo, fazendo-se necessários mais estudos para comprovação
estatística com maior poder amostral.

Palavras-chave: câncer, fitoterápico, glândula mamária, Janaúba, oncologia,

tratamento oral.
 iv

USE OF JANAUBA LATEX EXTRACT (Synadenium grantii) IN FEMALE DOGS

WITH MAMMARY NEOPLASM

ABSTRACT – Mammary neoplasms correspond to the most frequent tumors

in female dogs. The same occurs in women, with breast cancer being the most
commonly found tumor. It has a high morbidity and mortality rates, and treatment is
considered a challenge, as there are still many undesirable colateral effects caused
by existing therapies. Due to this, studies related to the evolution of treatments and
reduction of colateral effects are extremely important. The objective of this study was
compare variations on the size of bitches' breast neoplasms, between the studied
groups, after 90 days of treatment with the Janaúba Latex Extract (TLJ). As well as
ultrasound evaluations, histopathological and immunohistochemistry analyzes (CD3+
and granzyme) of breast neoplasms and inguinal and axillary lymph nodes. Bitches
with mammary tumors in stage I, II and III were randomly divided into 2 groups
(control and treatment) were evaluated. Measurements of tumor size were made at
the beginning and end of treatment. For histological and immunohistochemistry
evaluation and comparison, two samples from each patient were taken, the first
through biopsy of the breast tumor, and the second after 90 days of treatment with
TLJ, through mastectomy. Clinical evaluations such as hematological, urinary and
imaging analyzes were also performed and followed up throughout the research
period. There were no significant differences in rejection or colateral effects of TLJ
treatment. Through elastography-ARFI, a reduction in tumor stiffness was observed
in patients in treated group with TLJ, suggesting a decrease in the malignancy of
these tumors. The immunohistochemical analysis indicated an increase in expression
of CD3 + and granzyme in the tumors of the treated group compared to the control
group, however there was no statistical significant differences. From the tumor size
analysis, before and after treatment, as for results no changes or statistically
significant differences were observed. It was concluded that the oral use of TLJ for
90 days in bitches with mammary tumors suggests an increase in the expression of
intratumor lymphocytes, as well as a decrease in tumor stiffness. However, more
studies are needed for statistical proof with greater sampling power.

Keywords: cancer, herbal medicine, mammary gland, Janaúba, oncology, oral

treatment.
 v

LISTA DE ABREVIATURAS

AINE – Anti-inflamatório Não Esteroide

ARFI – Acoustic Radiation Force Impulse
CD – Cluster of Differentation
CD4+ - Linfócito T auxiliar
CD8+ - Linfócito T citotóxico
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
CONCEA – Conselho Nacional de Experimentação Animal
DC – Células Dendríticas
FCAV – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
HVGLN – Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”
IHQ – Imuno-histoquímica
Kg – Quilograma
MHC – Major Histocompatibility Complex (complexo principal de
histocompatibilidade)
NK – Natural Killer
OH – Ovário-histerectomia
OMS – Organização Mundial de Saúde
ONG – Organização não Governamental
PAF – Punção por Agulha Fina
QDMT – Quimioterapia de Dose Máxima Tolerada
RE – Receptor de Estrógeno
RP – Receptor de Progesterona
SID – sis in die (1x ao dia)
SRD – Sem Raça Definida
TLJ – Tintura do Látex da Janaúba
TNM – Tumor, Linfonodo, Metástase (estadiamento tumoral)
UNESP – Universidade Estadual Paulista
 vi

LISTA DE QUADROS

Página
Quadro 1. Estadiamento das neoplasias mamárias de
cadelas...................................................................................... 6
Quadro 2. Anticorpos utilizados para o estudo de imuno-
histoquímica.............................................................................. 19
 vii

LISTA DE TABELAS

Página
Tabela 1. Dados demográficos das fêmeas caninas incluídas no
experimento………………………………………………………... 21
Tabela 2. Dados dos tamanhos dos tumores das fêmeas caninas, dos
grupos estudados, com porcentagem de variação e
diagnóstico histopatológico....................................................... 23
Tabela 3. Comparação dos valores estatísticos de todos os dados
avaliados entre os grupos estudados…………………………… 24
Tabela 4. Resultados das frequências de quantificação imuno-
histoquímica, nos momentos inicial e final, de cada anticorpo
nos grupos tratado e controle................................................... 29
 viii

LISTA DE FIGURAS

Página
Figura 1. Imagens fotográficas de fêmea canina com um neoplasma em
mama M4 da cadeia mamária direita. Imagens A e B no dia 0
(D0) e C e D no dia 90 (D90), sendo o neoplasma mensurado
com paquímetro no eixo crânio-caudal (A e C) e no eixo latero-
lateral (B e D). Fonte: acervo pessoal......................................... 22
Figura 2. Imagens da avaliação ultrassonográfica do neoplasma
mamário de uma fêmea canina. As imagens A, C e E
demonstram a mensuração ultrassonográfica em modo-B
(eixos curto-longo) do tumor em mama M5 direita, linfonodo
inguinal direito e linfonodo axilar direito, respectivamente. As
imagens B, D e F demonstram a utilização da técnica de
elastografia, apresentando o elastograma (escala
colorimétrica) e a mensuração da velocidade de cisalhamento,
no tumor de mama, linfonodo inguinal e axilar direitos,
respectivamente. Fonte: acervo pessoal..................................... 25
Figura 3. Micrografias da lâminas de imuno-histoquímica. A: Carcinoma
em tumor misto de mama grau I apresentando negativo para
marcação de CD3. B: Carcinoma mamário papilífero grau III
evidenciando marcação de 10% (+) para CD3+. C: Carcinoma
mamário papilífero grau III evidenciando marcação de 10% (+)
para granzima-B. D: Carcinoma em tumor misto de mama grau
II evidenciando marcação de 10% a 25% para granzima-B.
Fonte: acervo pessoal................................................................. 27
 1

1. INTRODUÇÃO

Os tumores de glândulas mamárias são os tumores mais frequentes nas

cadelas, representando cerca de 50 a 70% de todas as neoplasias nessa espécie
(de Nardi et al., 2016; Vasceralli et al., 2009; Green et al., 2009; Merlo et al., 2008),
assim como nas mulheres, em que o câncer de mama também é o tumor mais
comum. Estima-se o surgimento de um milhão de novos casos no mundo a cada
ano, proporcionando alto risco de óbito por conta das metástases secundárias à
essa neoplasia (de Nardi et al., 2016).
Os fatores que influenciam na oncogênese dos neoplasmas mamários estão
ligados aos receptores de estrógeno, progesterona e hormônio do crescimento, que
por sua vez estimulam a proliferação do epitélio mamário, nos respectivos lugares
onde são expressos, incrementando a ocorrência de erros genéticos, podendo
originar mutações com potencial oncogênico (Penã et al., 2014).
As características epidemiológicas, clínicas, biológicas e genéticas dos cães
são semelhantes às da espécie humana. Entre estas, citam-se a faixa etária de
aparecimento, morfologia, efeito protetor da ovario-histerectomia, presença de
receptores de estrógeno e progesterona na massa tumoral, órgãos alvo de
metástase, evolução clínica e a hereditariedade, em alguns casos. Também foi
demonstrado que neoplasias mamárias de cadelas apresentam genótipo antigênico
comparável àquele observado em lesões de mama em seres humanos com
homologia entre ambos os genes (Queiroga et al., 2014).
O tratamento do câncer de mama envolve cirurgia, quimioterapia, radioterapia
e hormonioterapia, visando o controle local e sistêmico da doença. Muitos são os
estudos que analisam a toxicidade e os índices de respostas a essas condutas, e,
nesse contexto, é notável a necessidade de mais pesquisas que estudem
medicamentos com menor toxicidade e efeitos colaterais. Até o momento, não há
plantas medicinais indicadas para o tratamento contra o câncer de mama e a busca
por novas substâncias com atividade antitumoral é de extrema importância, uma vez
que diversos tipos de tumores adquirem resistência às drogas existentes (Martins et
al., 2017).
 2

Dentre os medicamentos antineoplásicos, encontram-se os que podem ser

utilizados tanto para o tratamento como para a prevenção do câncer. Nesta classe,
incluem-se os fitoterápicos, medicamentos obtidos a partir de plantas, considerando
exclusivamente os derivados de substâncias vegetais, os suplementos dietéticos
herbáceos e as plantas medicinais, íntegras ou suas partes (Fukumasu et al., 2008).
A planta Synadenium grantii é um arbusto de grande porte, nativa da região
Oeste da África. No sul do Brasil, o látex de Synadenium grantii é preparado na
forma de “garrafada”, e é popularmente conhecida como “Janaúba”, “leiteirinha”,
“tiborna” e “cola-nota” (Oliveira et al., 2013). Esta planta tem mostrado algumas
propriedades farmacológicas antitumorais, anti-inflamatórias, atividade hemostática,
ação fibrinolítica e imunorreguladora (Andersen et al., 2010).
Resultados iniciais do uso da planta Synadenium grantii observados no uso
popular ou em estudos in vitro e in vivo de carcinoma são promissores e sugerem o
potencial efeito antitumoral. Existe a perspectiva do uso terapêutico de moléculas
derivadas do látex ou outras frações da planta, caso estudos demonstrem a real
atividade antitumoral destas (Martins et al., 2017).
É possível que estudos da planta Synadenium grantii levem à descoberta de
moléculas com potencial terapêutico e, para isso, pesquisas direcionadas e
complexas passando por todas as etapas da construção do conhecimento, desde a
experimentação in vitro até o estudo em animais, precisam ser conduzidas (Martins
et al., 2017).
O objetivo desse trabalho foi comparar entre os grupos estudados, os efeitos
da administração por via oral da Tintura do Látex da Janaúba (TLJ) em cadelas com
neoplasmas mamários, analisando alterações no tamanho dos neoplasmas após 90
dias de tratamento. Como também avaliações ultrassonográficas e elastográficas,
análises histopatológicas e imuno-histoquímicas (com marcadores para CD3+ e
granzima) dos neoplasmas mamários e linfonodos inguinais e axilares.
 3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Neoplasias mamárias em cadelas

2.1.1 Incidência
Tumores mamários são as neoplasias mais comuns em cadelas inteiras ou
castradas tardiamente, representando de 50 a 70% do total de neoplasias que
acometem as fêmeas caninas (Sorenmo et al., 2013). As taxas de incidência anual
variam significativamente de acordo com a localização geográfica e é menor em
áreas como os Estados Unidos e Europa Ocidental onde a prática de castração
precoce é bem estabelecida (Sleeckx et al., 2011). A frequência de tumores
diagnosticados nos estudos europeus assemelha-se aos encontrados no Brasil
(Nunes et al., 2017). Um estudo retrospectivo realizado por De Nardi et al. (2002)
estimaram uma incidência de 45% de tumores mamários em relação às outras
afecções oncológicas, sendo 68,4% destes tumores, considerados malignos.
O risco do desenvolvimento dos tumores mamários aumenta com a
expectativa de vida. A doença acomete principalmente cadelas de meia idade (entre
9 e 11 anos), sendo considerada rara em animais jovens, com menos de quatro
anos de idade (Sorenmo et al., 2013).
A maioria dos cães com tumores mamários é clinicamente saudável no
momento do diagnóstico e os tumores podem ser identificados pelos tutores ou pelo
veterinário durante o exame clínico de rotina. As formações neoplásicas comumente
apresentam-se como nódulos circunscritos, de consistência firme, podendo ser
únicos, múltiplos, aderidos (à pele e/ou musculatura), móveis, císticos, ulcerados,
inflamados e de tamanhos variáveis (Sorenmo et al., 2013). Podem acometer uma
ou ambas as cadeias mamárias e as glândulas abdominais caudais e inguinais são,
geralmente, as mais acometidas, provavelmente devido à maior quantidade de
parênquima mamário (Cassali et al., 2014; Sorenmo et al., 2013).

2.1.2 Sinais Clínicos e Diagnóstico

O diagnóstico da doença é clínico e deve iniciar pela anamnese e
identificação do paciente quanto ao sexo, idade e status reprodutivo. Os animais
 4

devem ser inicialmente submetidos ao exame físico completo com avaliação da

condição clínica geral e coleta de informações referentes ao histórico clínico,
reprodutivo (ciclo estral, partos, castração, tratamento hormonal, abortos e
pseudociese) e da lesão da glândula mamária, como tempo de evolução e histórico
de lesões anteriores (Campos e Lavalle, 2017).
O exame físico específico deve incluir a inspeção e palpação minuciosa de
todas as glândulas mamárias, assim como dos linfonodos regionais, visto que o
sistema linfático é a principal rota de metástases das patologias malignas de mama
em cães tendo em vista que a maioria são carcinomas. Todas as informações
devem ser registradas em um prontuário ou ficha oncológica (Sorenmo, 2013;
Campos e Lavalle, 2017).
A punção por agulha fina (PAF), aspirativa ou não, é um método seguro, de
alta sensibilidade e especificidade para a identificação de neoplasias e metástases
em geral (Sorenmo, 2013). No entanto, o diagnóstico citológico na mama,
principalmente ao que se refere aos carcinomas mamários, é marcado por graus
variados de incerteza diagnóstica. É preciso ressaltar que células mesenquimais e
mioepiteliais neoplásicas benignas também exibem variados graus de atipia
citológica não relacionada à malignidade, podendo ser erroneamente interpretadas
como malignas. Além disso, não existem critérios citomorfológicos concretos que
permitam distinção entre as contrapartidas benigna e maligna nessas populações
celulares (Grandi, 2017). No entanto, a citologia é muito empregada na pesquisa de
metástase em linfonodos regionais palpáveis, principalmente quando estes
apresentarem alterações na forma, tamanho e/ou consistência. Em caso de
resultados positivos ou suspeitos para metástases, a exérese do(s) linfonodo(s)
afetado(s) deve ser realizada (Cassali et al., 2007; Sorenmo, 2013).
Os pulmões são os sítios mais comuns de metástase à distância em cães
com neoplasias mamárias malignas, entretanto, outros órgãos também podem ser
acometidos como fígado, rins, baço e, em menor frequência, sistema nervoso central
e ossos (Campos e Lavalle, 2017). Exames auxiliares de imagem devem ser
realizados como radiografias torácicas em três projeções (ventro-dorsal e latero-
lateral direita e esquerda) e ultrassonografia abdominal (Sorenmo et al., 2013). O
exame de tomografia computadorizada é o que apresenta maior acurácia na
 5

detecção de metástases pulmonares e de outros órgãos, principalmente aquelas

com diâmetros pequenos. No entanto, devido ao custo elevado e necessidade de
anestesia geral para sua realização em cães, a radiografia é o método padrão mais
utilizado para a detecção de metástases pulmonares, podendo detectar lesões
pulmonares com diâmetro superior a 6 mm (Cassali et al., 2014; Campos e Lavalle,
2017). A tomografia e ressonância magnética são também indicadas para avaliação
de outros órgãos para pesquisa de sítios metastáticos, inclusive do encéfalo, quando
há suspeita de lesão em sistema nervoso central (Campos e Lavalle, 2017).
Exames histopatológicos devem ser realizados de todas as lesões mamárias,
independentemente do tamanho, uma vez que esse exame fornece informações
para o melhor plano terapêutico do paciente. Diversos métodos de classificação
histopatológica foram propostos para os tumores mamários caninos. Alguns destes
adaptados a partir de sistemas de classificação para tumores mamários humanos
(Cassali et al., 2014).
Atualmente, o Consensus for the Diagnosis, Prognosis and Treatment of
Canine Mammary Tumors proposto por Cassali et al. (2014), contempla uma
classificação mais abrangente adotando novos subtipos não descritos anteriormente.
Essa classificação foi elaborada considerando-se o tecido de origem (epitelial,
mioepitelial, mesenquimal), suas características morfológicas e seu prognóstico. As
lesões mamárias podem ser divididas em lesões benignas não neoplásicas,
neoplasias benignas e neoplasias malignas.

2.1.3 Estadiamento
O estadiamento clínico do paciente é um fator importante para a definição da
abordagem terapêutica dos tumores mamários, pois ajuda a entender e determinar a
extensão da doença, sugere um prognóstico e, consequentemente, auxilia no
planejamento do tratamento mais adequado a ser instituído. Os parâmetros a serem
avaliados necessitam de exame físico e exames complementares para pesquisa de
metástase (Sorenmo et al., 2013; Cassali et al., 2014).
Esse estadiamento baseia-se no sistema TNM modificado, criado pela
Organização Mundial de Saúde (OMS). Como demonstrado no Quadro 1, esse
sistema considera informações como o tamanho da lesão primária (T), presença de
 6

metástase em linfonodo regional (N) e presença de metástase à distância (M)

(Cassali et al., 2014). As possíveis combinações entre T, N e M, originam o
estadiamento clínico que possibilita classificar o animal em cinco estádios (I a V),
sendo que o estadiamento mais baixo (I) possui melhor prognóstico e o
estadiamento mais alto (V), pior prognóstico (Sorenmo et al., 2013).

Quadro 1: Estadiamento das neoplasias mamárias de cadelas.

T: diâmetro máximo do tumor
T1: diâmetro máximo <3cm
T2: diâmetro máximo de 3-5cm
T3: >5cm de diâmetro
N: envolvimento de linfonodos regionais
N0: ausência de metástases (cito ou histopatológico)
N1: presença de metástases (cito ou histopatológico)
M: presença de metástases à distância
M0: ausência de metástases
M1: presença de metástases à distância

Estádio T N M
I T1 N0 M0
II T2 N0 M0
III T3 N0 M0
IV qualquer N1 M0
V qualquer qualquer M1
Fonte: adaptado de Sorenmo, 2013

2.1.4 Tratamento
Apesar do esforço significativo para o desenvolvimento de novas modalidades
terapêuticas, a exérese cirúrgica é o método mais antigo e, ainda hoje, de maior
sucesso no tratamento das neoplasias em animais e humanos, sendo a conduta de
escolha para cadelas com tumores mamários, exceto aquelas com carcinomas
inflamatórios (Sorenmo et al., 2013; Lavalle et al, 2017). A excisão cirúrgica tem
como objetivo proporcionar o controle locorregional da doença proporcionando
melhor qualidade de vida e sobrevida do paciente. Além disso, permite a avaliação
histopatológica da lesão, conferindo informações importantes sobre a classificação
 7

tumoral, prognóstico e necessidade de terapias adjuvantes (Sorenmo et al 2013,

Lavalle et al, 2017).
A ressecção dos tumores mamários é considerada rotineira na clínica de
animais de companhia, e a escolha da técnica cirúrgica depende da extensão da
doença, drenagem linfática, tamanho e localização da lesão (Cassali et al., 2014;
Horta et al., 2014). Deve-se dar preferência às técnicas mais simples e menos
invasivas necessárias para a remoção completa dos nódulos tumorais e tecido
linfático adjacente. No entanto, é importante respeitar os princípios da cirurgia
oncológica, a anatomia e os fatores prognósticos. Dessa forma, podem ser
realizadas intervenções como lumpectomia (nodulectomia), mastectomia regional
(cranial ou caudal) e mastectomia radical unilateral ou bilateral (Horta et al., 2014).
A quimioterapia é uma modalidade de tratamento indicada para pacientes
com tumores de mama com estadiamento avançado ou com neoplasias de
prognóstico desfavorável, como terapia adjuvante para prevenir recorrências locais
ou metástases (Cassali et al., 2014). Protocolos de quimioterapia em dose máxima
tolerada (QDMT) tem como objetivo o máximo possível de citotoxicidade das células
tumorais. É considerada não específica, causando danos e toxicidade às células
neoplásicas e sadias, sendo necessário intervalo entre os ciclos para recuperação
do tecido normal (Campos et al., 2016). Esses protocolos frequentemente são
eficazes no início e resultam em regressão ou estabilização do tumor, aumento da
sobrevida e até cura. No entanto, algumas respostas positivas podem ser de curta
duração e ter recorrências, resultando em neoplasias de pior comportamento
biológico e resistentes à fármacos citotóxicos. Os principais protocolos propostos
pela literatura consistem no uso de doxorubicina associado à ciclofosfamida ou à
carboplatina, cisplatina ou carboplatina como fármaco único, ciclofosfamida
associada a 5-fluoracil, carboplatina associada à gencitabina e paclitaxel. No
entanto, estudos ainda são necessários para determinar protocolos mais eficientes
para a neoplasia mamária canina (Sorenmo et al., 2013; Lavalle et al., 2017).
A quimioterapia metronômica baseia-se na administração de agentes
citotóxicos de forma contínua em doses relativamente mais baixas do que a QDMT.
A administração metronômica proporciona baixos e contínuos níveis circulantes dos
fármacos antineoplásicos, garantindo efeitos citotóxicos, anti-angiogênicos e
 8

imunomoduladores, interferindo na progressão e metástase das neoplasias. Ainda

proporciona menores efeitos adversos e de resistência aos quimioterápicos em
comparação à QDMT. Os protocolos geralmente são bem tolerados, prolongando a
sobrevida global e aumentando a qualidade de vida do paciente. Não substitui o
tratamento convencional mas pode ser uma alternativa de tratamento paliativo em
pacientes com metástase, tumor inoperável ou resistência a quimioterápicos.
Podendo ainda ser utilizada após a QDMT com o objetivo de aumentar o intervalo
livre de doença e sobrevida global do paciente. Fármacos como lomustina,
clorambucil e ciclofosfamida podem ser utilizados isoladamente ou em associações
com outras classes farmacológicas como anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) e
inibidores de tirosina quinase (Campos et al., 2016).
Neoplasias benignas e carcinomas bem diferenciados frequentemente
apresentam positividade para receptores de estrógeno (RE) e progesterona (RP),
sendo considerado um fator preditivo para terapia adjuvante de hormonioterapia.
Essa avaliação de RE e RP pode ser realizada por meio de imuno-histoquimica
(IHQ) no tumor primário e/ou metástase e, em caso de positividade, a ovário-
histerectomia (OH) pode ser indicada devido à eliminação do estímulo hormonal e,
consequentemente, proliferação tumoral (Ferreira et al., 2017).

2.1.5 Prognóstico
Além do estadiamento, outros fatores clínicos e patológicos podem ser úteis
para a condução dos casos de câncer de mama em cadelas. O comportamento
biológico das neoplasias mamárias é extremamente variável, e encontra-se
intimamente relacionado a importantes características de malignidade como o
tamanho tumoral, presença de áreas de ulceração, invasão tecidual (aderências à
pele ou musculatura) e necrose, além das metástases em linfonodos regionais e/ou
em órgãos distantes (Cassali et al., 2014). Da mesma forma, as informações obtidas
no exame histopatológico, como tipo histológico, grau de diferenciação, polimorfismo
celular, índice mitótico, obtenção de margens cirúrgicas e presença de necrose
apresentam valor prognóstico de extrema relevância para o clínico (Cassali et al.,
2014).
 9

2.2 Infiltrado inflamatório no tumor de mama

O sistema imune é capaz de responder ao câncer com ativação sistêmica,
regional e intratumoral de leucócitos (Whiteside, 2008). O combate efetivo das
células tumorais depende basicamente da geração in vivo de número suficiente de
células imunes com grande capacidade de reconhecimento de antígenos tumorais;
da migração e infiltração destas células no estroma tumoral; e da ativação das
células imunes no microambiente tumoral resultando em mecanismos efetores
apropriados (Rosenberg et al., 2004).
As respostas imunes inata e adaptativa formam um sistema integrado de
defesas do hospedeiro, no qual diversas células e moléculas funcionam
cooperativamente (Male et al., 2006). A imunidade inata é considerada a primeira
linha do mecanismo de defesa e envolve uma ampla variedade de células, fatores
humorais e respostas tissulares, entretanto é inespecífica ao antígeno e não
apresenta memória (Snyder, 2009). A resposta adaptativa é a segunda linha de
defesa sendo caracterizada pela especificidade aos antígenos, diversidade, memória
e reconhecimento de moléculas estranhas pelo organismo (Male et al., 2006). Os
tumores expressam antígenos que são capazes de induzir uma resposta imune
específica celular e/ou humoral, entretanto a maioria dos tumores é fracamente
imunogênica e as respostas com freqüência não previnem o crescimento de tumores
(Snyder, 2009).
Os linfócitos T são os principais constituintes da resposta imune celular e, têm
por objetivo reconhecer e destruir antígenos de microrganismos intracelulares e de
células tumorais. As células T apresentam especificidade restrita para antígenos,
reconhecendo apenas aqueles apresentados pelo complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) e que se expressam na superfície de outras células
(Snyder, 2009). Os linfócitos T possuem subpopulações funcionalmente distintas, as
células T CD4+ auxiliares e os linfócitos T CD8+ citotóxicos.
. Em resposta à estimulação antigênica, as células T CD4+ auxiliares
secretam proteínas denominadas citocinas, cuja função é estimular a proliferação e
a diferenciação das células T, assim como de outras células, incluindo as células B,
os macrófagos e outros leucócitos (Male et al., 2006). Os linfócitos T CD8+
citotóxicos destroem as células que produzem antígenos estranhos, como células
 10

infectadas por vírus e células tumorais. Existem ainda as células T reguladoras

(Tregs) que apresentam como principal função a inibição de respostas imunológicas.
Outra classe de linfócitos é representada pela célula natural killer (NK), a qual
apresenta função importante na imunidade natural contra vírus e alguns organismos
extracelulares e principalmente contra células tumorais (Orr e Lanier et al., 2009).
A resposta inata contra os tumores tem como principal via efetora as células
NK, linfócitos granulares assim denominados por eliminar células tumorais in vitro
sem a necessidade de estímulos ou sensibilização prévia (Whiteside e Herberman,
1995). A função citotóxica das células NK ocorre pela liberação de grânulos de
perforina e granzimas, que lisam as células-alvo. Perforinas e granzimas são
também mediadores pré formados armazenados em grânulos nos linfócitos T CD8+
citotóxicos (Torrezini e Athanazio, 2008). As perforinas são capazes de formar poros
transmembrana na célula-alvo, que permitem a entrada de outras moléculas efetoras
como as granzimas, ou de água, causando a lise por osmose, ativando proteínas
intracelulares (caspases) e induzindo apoptose (Abbas e Lichtman, 2005).
Assim, o papel aparente das células NK é de detectar as células alteradas,
quando estas tentam evadir o sistema imune, não sendo reconhecidas pelas células
T CD8+. Desta forma, a existência das células NK não permite que a queda da
expressão de MHC classe I possa ser usada como mecanismo de escape de células
tumorais (Moretta et al., 2002). Entretanto, a ausência de sinais inibitórios não é
suficiente para que ocorra a destruição via célula NK, sendo necessária a
combinação da ligação de receptores estimulantes com o desligamento de
receptores inibitórios (Torrezini e Athanazio, 2008).
O principal mecanismo da resposta imune adaptativa contra as células
tumorais é a ação direta das células T CD8+ citotóxicas que reconhecem antígenos
tumorais apresentados ao MHC classe I. Estes antígenos derivados de tumores
também podem ser processados e apresentados às moléculas do MHC de classe II
na superfície das células dendríticas (DC) e induzem a proliferação das células T
CD4+ auxiliares (Huttner et al., 2005). Entretanto, o papel dos mecanismos imunes
efetores na proteção de indivíduos contra tumores não está bem definido.
Aparentemente, a efetividade do sistema imune ao tumor é determinada pelo tipo de
resposta obtida (Whiteside, 2008).
 11

A ativação e a inibição de células T dependem da presença ou ausência de

citocinas em seu microambiente. Aparentemente, existe um ciclo de alimentação
entre macrófagos e linfócitos importante para o desenvolvimento ou inibição do
desenvolvimento tumoral (Denardo e Coussens, 2007). Em um estudo realizado por
Damasceno (2009), a partir da análise morfológica e morfométrica do infiltrado
inflamatório associado aos carcinomas mamários de cadelas, foi observado
predomínio de linfócitos nos tumores mais agressivos enquanto o infiltrado
histiocitário apresentou correlação com tumores de melhor prognóstico.
Alguns estudos relatam que os carcinomas mamários em mulheres são
infiltrados por linfócitos, predominantemente linfócitos T, e que sua presença está
relacionada a um melhor prognóstico por inibir a angiogênese e conter o
crescimento neoplásico (Camp et al., 1996). No entanto, atualmente tanto os
estudos que utilizam modelos experimentais quanto aqueles que usam tumores
mamários espontâneos na mulher, apoiam a hipótese de que a inflamação
desempenha um papel na promoção do câncer de mama (Lin e Karen, 2007).
Estudos com histologia e citometria de fluxo têm demonstrado que as
neoplasias mamárias em mulheres são infiltradas por uma população heterogênea
de células imunes, constituídas de diferentes proporções de linfócitos T, linfócitos B,
células NK e macrófagos (Camp et al., 1996). Kim e colaboradores (2010)
observaram que os tumores mamários malignos em cadelas são caracterizados por
marcante infiltração de mononucleares, particularmente linfócitos presentes no
estroma, ao redor de vasos e células neoplásicas. Ao contrário, linfócitos são
raramente observados na glândula mamária normal e em tumores benignos da
mama.
Nesse contexto, a compreensão dos mecanismos básicos envolvidos no
crescimento tumoral, bem como a resposta imune contra o tumor, são fundamentais
para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, especialmente para as
formas mais avançadas da doença para as quais as opções atuais de tratamento
têm impacto limitado na sua progressão (Torrezini e Athanazio, 2008).
 12

2.3 Elastografia ARFI

A Elastografia “Acoustic Radiation Force Impulse – ARFI” é um método
ultrassonográfico que utiliza o conceito de uma das mais antigas ferramentas da
clínica médica, a palpação, na qual se avalia a forma e a rigidez do órgão de
interesse (Ophir, 2002). A elasticidade é a propriedade de um corpo que o permite
ser deformado quando sujeitos a uma força externa e possa retomar a sua forma
original ou o tamanho, quando esta é removida. Essa deformação é inversamente
proporcional à rigidez e ao tempo de reparo do tecido (Goddi et al., 2012).
O método ARFI é uma técnica de imagem segura e não invasiva, que fornece
medidas quantitativas e qualitativas da rigidez dos tecidos. Para avaliação
qualitativa, são utilizados impulsos acústicos curtos e de alta intensidade para
deformar os elementos do tecido e criar um mapa estático (elastograma) de rigidez
tecidual relativa. Esse método fornece mapeamento em escala colorimétrica (escala
de cinza ou colorido) que demonstra a rigidez relativa dos tecidos da região
estudada, comparando-se com a imagem ultrassonográfica convencional
correspondente. De maneira geral, as áreas mais claras (ou azul/verde) representam
os tecidos mais deformáveis do que as áreas escuras (vermelho/amarelo) (Goddi et
al., 2012).
Na avaliação quantitativa ARFI, é utilizado um impulso acústico primário em
direção à região a ser examinada, o qual promove a formação de ondas de pressão
em propagação, capaz de deformar os tecidos, ocorrendo à captação da velocidade
de propagação das ondas de pressão (cisalhamento). A velocidade de propagação e
atenuação das ondas estão relacionadas com a rigidez e viscoelasticidade do tecido,
sendo que as ondas apresentam maior velocidade em tecidos rígidos (Comstock,
2011).
Através dos estudos de Feliciano et al (2017) concluiu-se que a avaliação da
rigidez pela elastografia ARFI resultou em uma técnica excepcionalmente eficaz
para a predição de malignidade em neoplasmas mamários caninos. Com base nos
resultados deste estudo, a elastografia quantitativa ARFI provou ser o melhor
método de predição ultrassonográfica de malignidade em massas mamárias.
Valores de corte acima de 2,57 m/s mostraram uma impressionante precisão
 13

diagnóstica de 95% e acurácia de 98%, com valores adequados de sensibilidade e

especificidade.
De acordo com Silva et al (2018), a elastografia ARFI demonstrou ser o
método mais apropriado e acurado na detecção de metástases nos tecidos linfoides
sentinelas em cadelas com tumor de mama. A velocidade de cisalhamento foi
significativamente maior nos tecidos metastáticos, com variáveis do desempenho
preditivo elevados.
Recomenda-se a inclusão da elastografia ARFI na avaliação de paciente
oncológicos por ser uma técnica de rápida execução, não invasiva, livre de
complicações, com elevada sensibilidade, especificidade e acurácia, capaz de
auxiliar na conduta cirúrgica dos pacientes oncológicos (Feliciano et al., 2017; Silva
et al., 2018).

2.4 Synadenium grantii

O gênero Synadenium pertence à família Euphorbiaceae e possui 19
espécies identificadas, incluindo a Synadenium grantii que é uma planta de origem
africana e americana. No Brasil, a espécie é encontrada principalmente na Região
Amazônica e no estado do Mato Grosso, apresentando-se na forma de arbusto,
podendo atingir até 5 m de altura. É popularmente conhecida como “Janaúba”,
“leiteirinha”, “tiborna”, “cancerola” e “cola-nota”. É cultivada pela população para uso
como ornamento e também como medicamento em diversos países (Oliveira et al.,
2013).
A vida de todo ser vido é compreendida por etapas (nascimento, crescimento,
reprodução, envelhecimento e morte) a qual é assegurada e controlada pelas
transformações químicas realizadas pelo metabolismo deste organismo, que é um
conjunto de reações químicas que ocorrem no interior das células (Costa et al,
2012). No caso das plantas estas reações podem ser divididas didaticamente em
metabolismo primário e secundário (Simões et al, 2003). Em resumo, o metabolismo
primário assume importância no crescimento e rendimento agrícola, o metabolismo
secundário contribui com os aromas, as cores dos alimentos e com a resistência
contra pestes e doenças mantendo a sobrevivência nas condições ambientais
 14

favoráveis. Existem três grandes grupos de metabólitos secundários: terpenos,

compostos fenólicos e alcaloides (Costa et al, 2012).
Foram isolados diversos metabólitos secundários da S. grantii, como ésteres
de forbol, tripertenos, dipertenos, antocianinas, lecitinas e até algumas serino-
proteases. O látex dessa planta tem como característica uma alta toxidade, podendo
causar lesões dérmicas e oftálmicas em pessoas e animais que entrarem em contato
com a mesma. O látex é empiricamente recomendado para tratar inflamações,
gastrite, úlcera péptica, doenças neoplásicas e outras patologias. A administração
ocorre popularmente em forma de “garrafada”, obtida pela diluição de 18 gotas do
látex em 1 litro de água pura e fresca, ingerida em pequenas doses três vezes ao dia
(Oliveira et al., 2013).
A Janaúba tem mostrado algumas propriedades farmacológicas antitumorais,
anti-inflamatórias, atividade hemostática, ação fibrinolítica e imuno reguladora. Os
principais reagentes usados na extração dos componentes ativos no látex fresco são
o etanol, metanol, clorofórmio, acetato de etila e hexano. Estudos prévios mostram
que tanto o látex fresco quanto a garrafada possuem efeitos inibitórios da replicação
celular, indução de morte celular e parada do ciclo celular na fase S-G2-M de
linhagem celulares de melanoma. (Oliveira et al., 2013).
Campos (2016) e Hassan, Mohammed e Mohamed (2012) em seus estudos
fitoquímicos identificaram e isolaram de partes da S. grantii um éster de forbol raro, o
20-fenilacetato-3,4,12,13-tetraacetilforbol, chamado de C1. Campos (2016) também
observou que esse forbol raro apresentava uma maior concentração nos extratos da
planta, na estação da primavera, e menor no outono/inverno. Este forbol raro
apresentou atividade antiproliferativa moderada contra as linhagens celulares de
glioma, rim, pulmão, próstata e linhagens celulares de câncer de mama triplo-
negativo (MDA-MB231 e HBL100).
Levando em consideração essa ação antitumoral da Janaúba, de Amorim et
al (2017) avaliaram a atividade anticâncer do extrato metanólico de hastes de S.
grantii e seu composto isolado C1, o forbol raro, usando o modelo de xenoenxerto de
melanoma B16F10 em camundongos. E concluíram que foi eficiente na redução do
tamanho dos tumores, na proliferação celular e na concentração de algumas
proteínas envolvidas no processo de carcinogênese. Essa atividade pode ser
 15

atribuída à presença de C1, pois teve um efeito mais significativo em comparação

com o extrato da planta e o quimioterápico utilizado no estudo.

3. OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi comparar entre os grupos estudados se

houve redução significativa dos neoplasmas mamários de cadelas, por meio de
mensuração com paquímetro, após noventa dias de tratamento com a Tintura do
Látex da Janaúba (TLJ).
Como objetivos específicos, avaliar alterações na expressão de linfócitos T
(CD3+) e “Natural Killers” (granzima B), por meio de análise imuno-histoquímica;
avaliar alterações ultrassonográficas através de mensuração dos tumores mamários
e linfonodos inguinais e axilares, como também pela elastografia (ARFI); verificar
através de análises clínicas, hematológicas, urinárias e de imagem a progressão da
doença e se há possíveis efeitos adversos ou tóxicos das pacientes tratadas com a
TLJ.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Aspectos éticos

Este projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de
Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da
Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" - UNESP - Campus de
Jaboticabal-SP, sendo realizado segundo os Princípios Éticos de Experimentação
Animal adotado pelo Conselho Nacional de Experimentação Animal (CONCEA), sob
número de protocolo 009283/18.
As pacientes selecionadas para esse estudo foram oriundas de Organizações
Não Governamentais (ONGs) da cidade de Jaboticabal-SP e região, e do
atendimento clínico-cirúrgico do Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”
(HVGLN). Foram incluídas no projeto obedecendo critérios de inclusão/exclusão
propostos nesse estudo e mediante autorização de seus tutores. Estes foram
devidamente informados quanto aos procedimentos, e todos os detalhes em relação
 16

ao uso dos animais, através do “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” para

a pesquisa, o qual foi assinado, datado e rubricado pelo tutor.

4.2 Delineamento experimental

4.2.1 Seleção dos animais

Foram selecionadas dez (n=10) fêmeas caninas, sem raça definida (SRD),
adultas (4 – 12 anos), com peso variando entre 5 - 20 kg, diagnosticadas com
neoplasma mamário em estádio I, II ou III, de acordo com estadiamento das
neoplasias mamárias em cadelas (de Nardi, 2016).

4.2.2 Aleatoriedade
Os animais foram distribuídos em delineamento inteiramente casualizado, em
dois grupos: controle e tratado.

4.2.3 Preparo da Tintura do Látex da Janaúba e Dosagem

O látex da planta foi colhido na Fazenda Seringal Vista Alegre, na cidade de
Barretos – SP, e enviado para Instituto de Tecnologia em Fármacos Farmanguinhos
em Jacarepaguá – RJ, onde foi realizada a formulação do estudo. Primeiramente, o
látex da Synadenium grantii foi liofilizado e seu material seco pulverizado para
formulação. O material seco foi diluído de novo em etanol na concentração de 50%
e sonicado para atingir a homogeneização da solução. As formulações foram
envasadas em frasco com conta-gotas para facilitar a dispensação para os animais.
O extrato foi armazenado em geladeira e agitado vigorosamente antes de ser
utilizado.
A dosagem do produto terapêutico a ser administrado aos pacientes foi obtida
através da diluição do látex a 50% em etanol. O humano, na “garrafada tradicional”,
utiliza diariamente na dosagem de 36gts/litro. Somente 216µl de látex puro ou 4µl/kg
de peso (homem de 60 kg). Assim a dose padrão humana na tintura 2,5% é 10X
maior (40µl da tintura por kg de peso). Nos animais, para facilitar o cálculo, foi
utilizada 0,4 gota do extrato diluído a 50% para cada kg de peso por dia.
 17

Para uma melhor aceitação da TLJ pelos animais, o mesmo foi administrado
com conta-gotas e misturado em diferentes porções de alimentos considerados
atrativos aos animais (petiscos), como biscoitos caninos e patês.

4.2.4 Grupos experimentais

Previamente ao início do tratamento das pacientes, uma lista aleatória foi
gerada por um pesquisador não envolvido em outras etapas da pesquisa, com a
sequência dos pacientes alocados nos grupos da pesquisa. Os animais foram
distribuídos em dois grupos distintos de acordo com o tipo de terapia aplicada:
 Grupo Controle – placebo (n=5): solução de etanol 50%, na dose diária de 0,4
gota de solução para cada kg de peso, uma (SID) vez ao dia durante 90 dias.
 Grupo Tratamento (n=5): dosagem diária de 0,4 gota da TLJ 50% para cada
kg de peso, uma (SID) vez ao dia durante 90 dias.

4.2.5 Critérios de inclusão

 Pacientes que estavam dentro da faixa etária e peso estabelecidos para essa
pesquisa;
 Pacientes que possuíam pelo menos um nódulo mamário em uma das
cadeias mamárias.

4.2.6 Critérios de exclusão

 Pacientes que apresentavam idade e/ou peso fora dos estabelecidos para
essa pesquisa;
 Pacientes que apresentavam estadiamento acima do estádio 3, ou seja, com
nódulo mamário acima de 5 cm de diâmetro, ou ulcerado;
 Pacientes com problemas comportamentais que pudessem interferir na
condução do estudo;
 Pacientes que apresentassem alterações clínicas ou enfermidades
concomitantes que pudessem interferir diretamente com o andamento da
pesquisa.
 18

4.2.7 Critérios de descontinuação após inclusão

 Pacientes que apresentassem aumento rápido e progressivo do nódulo
mamário, ou ulceração;
 Pacientes que apresentassem qualquer alteração clínica ou enfermidade que
inviabilizasse sua continuidade ou que ameaçasse seu bem-estar devido a
qualquer condição ou circunstância;
 Pacientes que apresentassem sensibilidade ou efeitos colaterais a algum dos
componentes da terapia.
Ao longo do estudo, o pesquisador teve autonomia para descontinuar
qualquer paciente que julgasse necessário visando sua segurança e bem-estar, bem
como instituir novos tratamentos objetivando-se a recuperação do paciente.

4.2.8 Análises histológicas e imuno-histoquímicas

As análises histológicas e o processamento das lâminas para imuno-
histoquímicas das amostras de biópsia (antes do tratamento) e de mastectomia
(após o tratamento) foram realizadas no ©Vetpat Laboratório de Análise Veterinária
Ldta., de acordo com os protocolos e padrões de análise macro e microscópica
estabelecidos de rotina do laboratório.
Primeiramente, um fragmento do tumor mamário foi colhido por meio de
biópsia para análise histopatológica e imuno-histoquímica antes do início do
tratamento com TLJ, sendo utilizada anestesia geral dose/efeito para remoção do
fragmento tumoral com auxílio de um Punch nº 6.
Após 90 dias de tratamento, por ocasião da cirurgia de mastectomia,
realizada com anestesia geral inalatória e monitoração pré, trans e pós-operatória,
uma nova amostra de tecido tumoral mamário foi colhida. Caso houvesse regressão
total do neoplasma e a cirurgia não fosse necessária, seria colhida uma nova
amostra de tecido por meio de biópsia com punch da região onde havia o
neoplasma.
As amostras colhidas foram fixadas em solução de formol a 10% e, após 48
horas, a solução foi substituída por álcool 70%. Em seguida o material foi
armazenado para posterior envio ao laboratório.
 19

A confecção das lâminas para análise histopatológica foi realizada com

inclusão das amostras teciduais em blocos de parafina e realização dos cortes
histológicos em micrótomo, com espessura de 5 μm. Na sequência, permaneceram
em estufa overnight à 37ºC, sendo hidratados em diluições crescentes de álcoois,
diafanizados em xilol e realizado as reações de colorações específicas para a
técnica.
As avaliações microscópicas da quantificação celular imuno-histoquímica,
com os marcadores CD3+ e Granzima-B, e intensidade da imunomarcação foram
realizadas em microscópio óptico L3000-T (Labor Import). O painel específico para
os anticorpos estão apresentados na Quadro 2.

Quadro 2. Anticorpos utilizados para o estudo de imuno-histoquímica.

Tipo de Sistema de
Anticorpo Clone Empresa Diluição
Marcação detecção
tm
Polyclonal Novolink
Dako Citoplasma
Rabbit Anti- Pronto Polymer
Anti –CD3 Denmark e/ou
Human CD3 pra uso Detection
A/S Membrana
(GA503) Systems
Granzyme B Cell tm
Novolink
Rabbit Marque,
Polymer
Anti-Granzyme B Polyclonal Tissue 1:200 Citoplasma
Detection
Antibody Diagnosti
Systems
(262A) cs
Fonte: elaboração própria.

Foram escolhidos cinco campos aleatórios por lâmina da área tumoral, em

objetiva de 40x. O percentual de células positivas foi obtido e classificado em um
sistema de cruzes proposto por Allred et al (1989) e utilizado em outros estudos
imuno-históquimicos com tumor de mama canino como o de Terzian et al. (2007).
Sendo uma cruz (+) quando menos de 10% das células eram marcadas pelo
anticorpo, duas cruzes (++) quando 10% a 25% apresentavam marcação positiva,
três cruzes (+++) marcação entre 25% a 50% e quatro cruzes (++++) mais de 50%
de marcação positiva.

4.3 Procedimentos experimentais

Os procedimentos deste estudo foram realizados no Hospital Veterinário
“Governador Laudo Natel” (HVGLN) da Faculdade de Ciências Agrárias e
 20

Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista (UNESP) “Júlio de Mesquita

Filho”, Câmpus de Jaboticabal – SP. Durante todo o período de tratamento, as
pacientes ficaram alojadas no canil da instituição, recebendo água e ração seguindo
as recomendações do Setor de Nutrição de Cães e Gatos, com monitoramento
constantemente pela equipe do projeto.
Como parâmetros clínicos, foram avaliadas as características gerais de cada
paciente, através de anamnese, exames físico geral e específico. A mensuração do
neoplasma foi realizada com paquímetro digital e as fotografias com uma câmera
digital da marca Canon (EOS REBEL T5i). Foram feitas análises hematológicas e
urinárias, exames de imagem, como ultrassonografia abdominal, radiografia torácica
em três projeções (ventro-dorsal, latero-lateral direita e esquerda) e ecocardiografia.
Esses exames foram realizados antes do início do tratamento, e mensalmente após
o início do tratamento, até a realização da mastectomia.
Todas as pacientes incluídas no estudo tiveram seus parâmetros fisiológicos,
alterações nos exames físico geral, específico e complementares avaliados de forma
individualizada e obedecendo os critérios de inclusão/exclusão para esse estudo.

4.4 Análise estatística

As analises estatísticas foram realizadas no Software Prism v7 (GraphPad
Software, La Jolla, CA, EUA) com nível de significância de 5%. Os dados analisados
não apresentaram distribuição normal, portanto, as comparações entre os grupos
foram realizadas por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com relação às características das fêmeas selecionadas para essa pesquisa,

observamos que de 10 fêmeas, oito (8/10 – 80%) eram inteiras, ou seja, não
castradas. As duas (2/10 – 20%) que eram castradas, uma delas havia sido castrada
quando adulta, e a outra havia passado por um procedimento de castração, porém
permaneceram os ovários. Esta paciente apresentava sinais específicos da
síndrome do ovário remanescente, como sinais de cio e pseudosciese. Essas
informações corroboram de Nardi (2016) quanto à influência hormonal no
 21

desenvolvimento das neoplasias mamárias em cadelas, como também sustenta a

indicação de castração precoce como uma forma preventiva de tumores mamários.
A idade das cadelas entre 8 e 12 anos, ou classificadas como adultas quando
não era sabido a idade correta, apresenta relação com a etiologia dos neoplasmas
mamários em cadelas, onde a faixa etária de apresentação mais comum é de meia-
idade a idosa, entre 7 a 12 anos (Cassali et a.l, 2014; de Nardi et al., 2016; Lavalle
et al., 2017).
Oitenta por cento (8/10) das cadelas apresentou tumor nas mamas abdominal
caudal (M4) e inguinal (M5), sendo esse resultado justificado pela maior
concentração de tecido mamário nas mamas dessa região. Portanto são mais
susceptíveis ás alterações no parênquima mamário decorrente da estimulação
hormonal e desenvolvimento glandular (Seeckx et al., 2011; Sorenmo et al., 2013;
Horta et al., 2014; Campos e Lavalle, 2017).
A Tabela 1 apresenta os principais dados das pacientes incluídas no
experimento, como também o estádio em que se encontravam e o grupo
experimental no qual foram alocadas aleatoriamente.

Tabela 1. Dados demográficos das fêmeas caninas incluídas no experimento.

Mama Inteira / Grupo
Peso Idade afetada Castrada Estádio experimental
Animais
Fêmea A 20 Adulta M5 dir Castrada III Tratamento
Fêmea B 10 ≈ 12 M5 esq Inteira I Controle
Fêmea C 6 12 M4 dir Inteira II Controle
Fêmea D 13,6 Adulta M4 esq Inteira III Tratamento
Fêmea E 4,5 8 M5 dir Inteira I Controle
Fêmea F 10,7 12 M4 dir OR III Tratamento
Fêmea G 6,4 Adulta M3 dir Inteira II Controle
Fêmea H 8,5 Adulta M2 dir Inteira I Tratamento
Fêmea I 11,6 8 M4 esq Inteira II Tratamento
Fêmea J 15,6 ≈9 M5 dir Inteira III Controle
*≈, aproximadamente; M, mama; dir, direita; esq, esquerda; OR: ovário remanescente.
*Peso apresentado em quilogramas (kg); idade está apresentada em anos; o tamanho dos tumors
está apresentado em centímetros.
Fonte: elaboração própria.

A avaliação de tamanho dos neoplasmas mamários foi realizada mensurando-

os com paquímetro em duas direções, crâniocaudal e latero-medial, como
 22

observado nas Figura 1. Com as duas medidas foi possível avaliar a área dos
nódulos transformando-a em centímetros quadrados, de forma bidimensional,
multiplicando as duas medidas obtidas. Assim, foram comparadas as medidas em
centímetros quadrados dos nódulos no primeiro dia de tratamento (D0 – dia 0) até o
dia final de tratamento (D90 – dia 90).
Quanto à análise de tamanho dos tumores na comparação entre os dois
grupos estudados, das quais foram mensurados 10 tumores mamários de 10 fêmeas
caninas (tratamento n=5; controle n=5), não foi observado diferença estatística
significativa (p>0,05), decorrente ao baixo poder amostral.

A B

C D
Figura 1. Imagens fotográficas de fêmea canina com um neoplasma
em mama M4 da cadeia mamária direita. Imagens A e B no dia 0 (D0)
e C e D no dia 90 (D90), sendo o neoplasma mensurado com
paquímetro no eixo crânio-caudal (A e C) e no eixo latero-lateral (B e
D). Fonte: acervo pessoal.

No entanto, quando analisado de forma relativa, pôde-se perceber diminuição

na porcentagem total dos tamanhos dos tumores das pacientes. Foi observado que
somente quatro das pacientes avaliadas (4/10 – 40%) apresentou porcentagem de
aumento relativo do tumor desde o início do tratamento, sendo duas do grupo
controle e duas do grupo tratado. As outras seis pacientes (6/10 – 60%)
 23

apresentaram diminuição do tamanho tumoral ao longo do tratamento, como

apresentado na Tabela 2.
Essa diminuição, mesmo sendo relativa, corrobora o estudo de Oliveira e
colaboradores (2013) onde eles comprovaram o efeito do látex de Synadenium
grantii na progressão do ciclo celular de linhagens celulares de melanoma. O látex
induziu a morte celular dependente da dose, seguida de uma redução no número de
células na fase S-G2 / M. Como também no teste in vivo que realizaram, onde houve
uma inibição de 40% do crescimento do tumor dos camundongos no grupo tratado
em comparação com o grupo controle não tratado. No presente estudo, das cinco
fêmeas do grupo tratado, três (3/5 – 60%) apresentaram diminuição dos tumores,
sendo um dos casos com redução de até 39,06% do tamanho tumoral, como
observado na Tabela 4.

Tabela 2. Dados dos tamanhos dos tumores das fêmeas caninas, dos grupos
estudados, com porcentagem de variação e diagnóstico histopatológico.
D0 D90 ≠
Indivíduo Diagnóstico Histopatológico Grupo 2 2 2 ≠ em %
(cm ) (cm ) (cm )

Fêmea A Carcinosarcoma mamário misto grau III Tratamento 23,78 14,49 ↓-9,29 -39,06%
Fêmea D Carcinoma mamário papilífero grau III Tratamento 35,93 48,88 12,95 36,04%
Fêmea F Carcinoma em tumor mamário misto grau I Tratamento 31,16 29,59 ↓-1,57 -5,03%
Fêmea H Carcinoma em tumor mamário misto grau I Tratamento 5,06 7,1 2,04 40,31%
Fêmea I Carcinoma em tumor misto grau II Tratamento 16,57 15,96 ↓-0,61 -3,68%
Fêmea B Carcinoma em tumor mamário misto grau I Controle 3,85 2,48 ↓-1,37 -35,58%
Fêmea C Carcinoma em tumor mamário misto grau I Controle 8,73 8,3 ↓-0,43 -4,92%
Fêmea E Carcinoma em tumor mamário misto grau I Controle 2,77 2,56 ↓-0,21 -7,58%
Fêmea G Carcinoma mamário papilífero grau III Controle 15,09 26,78 11,69 77,46%
Fêmea J Carcinoma em tumor misto grau II Controle 21,5 25,73 4,23 19,67%
D0: dia inicia (0)l; D90: dia final (90); ≠: diferença entre os momentos.
Fonte: Elaboração própria.

Mesmo a avaliação do tamanho dos tumores antes e depois do tratamento

não apresentando diferença estatística favorável (Tabela 3), pelos valores de
P>0,05, esses resultados sugerem uma tendência de redução tumoral, e estimulam
a continuação dos estudos com a utilização da TLJ em projetos futuros, com
desenhos experimentais mais adequados e maior poder amostral.
As avaliações ultrassonográficas realizadas, tanto dos tumores mamários
quanto dos linfonodos inguinais e axilares, nos momentos D0 e D90, demonstraram
 24

resultados interessantes, principalmente com relação à elastografia ARFI. Foram

realizadas medidas através da ultrassonografia em modo-B, onde as mensurações
dos eixos curto-longo (Figura 2) não apresentaram diferença significativa entre os
grupos (tabela 3), tanto dos tumores mamários quanto dos linfonodos avaliados.

Tabela 3. Comparação dos valores estatísticos de todos os dados avaliados entre

os grupos estudados.
Média ± DP Mediana Valor mín. Valor máx. Valor P
T C T C T C T C
Tamanho
0,70±8,04 2,78±5,43 -0,61 -0,21 -9,29 -1,37 12,95 11,69 0,5317
tumoral
Tamanho
-0,11±3,86 0,06±4,86 -0,86 0,74 -4,22 -7,65 6,2 4,98 0,8016
tumoral pelo US
ARFI Vs -2,96±1,97 0,08±1,66 -4,09 0,34 -4,65 -2,9 0 1,4 0,0397*
Tumor Depth 0,24±0,18 0,04±0,25 0,29 0,04 0,02 -0,31 0,49 0,4 0,1984

ARFI Vs 0,97±0,99 0,86±1,41 0,8 0,94 -0,07 -1,17 2,6 2,32 0,9444
Linf Ing Depth -0,004±0,19 -0,10±0,21 0,03 -0,17 -0,24 -0,3 0,26 0,2 0,3095

ARFI Vs 0,90±1,55 0,69±2,56 1,52 -0,5 -1,49 -1,61 2,3 4,89 0,5317
Linf Axi Depth 0,24±0,61 0,32±0,36 0 0,26 -0,35 -0,07 1,2 0,9 0,6667
DP: desvio padrão; mín: mínimo; máx: máximo; T: tratamento; C: controle; US: ultrassonografia; ARFI:
Elastografia - Acoustic radiation force impulse; Linf: linfonodo; Ing: inguinal; Axi: axillar; Vs: velocidade de
cisalhamento; Depth: profundidade.
*Considerado estatisticamente significativo pelo teste de Mann-Whitney (P<0,05).
Fonte: Elaboração própria.

Entretanto, a velocidade da onda de cisalhamento (Vs) da elastografia ARFI

(demonstrados na Figura 2) dos tumores mamários das cadelas que fizeram uso da
TLJ foi estatisticamente significativo, apresentando valor p<0,05, como apresentado
na Tabela 3. Indicando que os tumores das pacientes tratadas sofreram uma
diminuição da rigidez tecidual, em comparação com as pacientes do grupo controle.
Considerando o estudo de Feliciano e colaboradores (2017) onde demonstrou que a
rigidez dos tumores de mama, avaliados na elastografia, é maior de acordo com a
malignidade, podemos evidenciar que no presente estudo as pacientes do grupo
tratado apresentaram diminuição ou estabilização da malignidade do tumor,
comparadas com o grupo controle. Isso sugere um possível aumento da reação
imunitária contra o tumor das pacientes que receberam o tratamento com a
Synadenium grantii.
 25

A B

C D

E F
Figura 2: Imagens da avaliação ultrassonográfica do neoplasma mamário de uma
fêmea canina. As imagens A, C e E demonstram a mensuração ultrassonográfica
em modo-B (eixos curto-longo) do tumor em mama M5 direita, linfonodo inguinal
direito e linfonodo axilar direito, respectivamente. As imagens B, D e F demonstram
a utilização da técnica de elastografia, apresentando o elastograma (escala
colorimétrica) e a mensuração da velocidade de cisalhamento, no tumor de mama,
linfonodo inguinal e axilar direitos, respectivamente. Fonte: acervo pessoal.

Sadeghi-Aliabadi e colaboradores (2009) realizaram um estudo com a

Euphorbia macroclada, planta da mesma família da S. grantii. Em resumo, os
 26

resultados deste estudo indicaram que os extratos de diclorometano e acetato de

etila tiveram efeitos citotóxicos na linhagem celular de adenocarcinoma de mama
humano (MDA-MB-468). Os dados desta investigação sugeriram que os extratos
não polares de Euphorbia macroclada possuem maior atividade citotóxica, como
terpenóides, e podem ser extraídos por solventes não polares. Sendo a Janaúba da
mesma família Euphorbia e apresentando o mesmo composto bioativo terpenóide,
comparamos essa informação com nosso estudo realizado e corroboramos que
pode haver efeito citotóxico da TLJ nos tumores de mama caninos.
A análise imuno-histoquímica da marcação do infiltrado inflamatório pelos dois
anticorpos utilizados no nesse estudo, foi realizada de forma qualitativa das células
imunopositivas. As lâminas foram analisadas por um patologista, que não teve
participação em outras etapas da pesquisa, como também não tinha conhecimento
de quais amostras eram do grupo controle e quais eram do grupo tratamento.
Obtivemos somente nove amostras viáveis para a realização do teste, pois a
amostra de biópsia de uma das pacientes foi considerada inconclusiva,
apresentando somente necrose tecidual. Desta forma, para essa amostra, não pôde
ser realizado a análise de antes e depois do tratamento, sendo excluída dessa fase
da pesquisa. Portanto, o grupo tratado foi avaliado contendo quatro (n=4) amostras e
o grupo controle contendo 5 amostras (n=5).
Os resultados da análise da IHQ demonstraram que somente as
classificações de negativo (-), marcação de até 10% (+), e de 10 a 25% (++) foram
observadas nas amostras. Nenhuma lâmina apresentou marcação de 25% a 50%
(+++) ou acima de 50% (++++). Corrobora-se Estrela-Lima, et al (2012) quando é
levado em consideração que o subtipo de linfócito, a quantidade e o momento do
início da resposta inflamatória, induzida pela ação de citocinas, são fatores que
definem se o processo inflamatório atuará como promotor ou inibidor do
desenvolvimento tumoral.
Kim e colaboradores (2010) observaram que os tumores mamários malignos
em cadelas são caracterizados por marcante infiltração de mononucleares,
particularmente linfócitos presentes no estroma, ao redor de vasos e células
neoplásicas. Ao contrário, linfócitos são raramente observados na glândula mamária
normal e em tumores benignos da mama.
 27

A B

C D
Figura 3. Micrografias da lâminas de imuno-histoquímica (40x). A: Carcinoma em
tumor misto de mama grau I apresentando negativo para imunomarcação de CD3.
B: Carcinoma mamário papilífero grau III evidenciando imunomarcação de 10% (+)
para CD3+. C: Carcinoma mamário papilífero grau III evidenciando imunomarcação
de 10% (+) para granzima-B. D: Carcinoma em tumor misto de mama grau II
evidenciando imunomarcação de 10% a 25% para granzima-B. Fonte: acervo
próprio.

Na análise das lâminas marcadas para identificação de CD3+ no tumor de

mama das pacientes no momento inicial (D0) foi observado, no grupo tratado (T)
com a TLJ, que houve frequência de uma amostra negativa (1/4 – 25%) e três (3/4 –
75%) amostras com (+) de imunopositividade. No momento final (D90), ou seja, após
o tratamento, duas (2/4 – 50%) apresentaram marcação de (+) e duas (2/4 – 50%)
de (++). Em contrapartida, o grupo controle (C) apresentou negatividade de
marcação em duas pacientes (2/5 – 40%) no momento D0 e duas (2/5 – 40%) no
momento D90. Marcaram em (+) duas pacientes (2/5 – 40%) no momento D0 e uma
paciente (1/5 – 20%) no momento D90. Por fim, a imunomarcação de (++) foi
 28

apresentada em uma das pacientes (1/5 – 20%) no momento inicial, e em duas (2/5
– 40%) no momento final.
A partir dessa análise, podemos observar que houve uma tendência de
aumento do infiltrado de linfócitos no tumor apenas nas amostras que inicialmente já
apresentavam imunomarcação de 10 a 25% (++). Amostras que eram negativas ou
apresentavam marcação de até 10% (+) das células, não apresentaram diferença
após o tratamento. De Nardo e Coussens (2007) sugerem que em tumores de
crescimento rápido a presença de linfócitos T, tem sido proposta como um
interessante indicador prognóstico quando comparado com tumores não
imunogênicos, apresentando correlação positiva com a ausência de metástase nos
linfonodos, menor tamanho tumoral, menor graduação histológica e maior tempo de
sobrevida livre da doença.
Com relação à imuno-histoquímica de células NK no tumor das fêmeas
caninas, foi utilizada para marcação o anticorpo anti-granzima-B. A função citotóxica
das células NK ocorre pela liberação de grânulos de perforina e granzimas, que
lisam as células-alvo. Perforinas e granzimas são também mediadores pré-formados
armazenados em grânulos nos linfócitos T CD8+ citotóxicos (Torrezini e Athanazio,
2008)
Nos tumores das pacientes do grupo tratamento, nenhum apresentou
negatividade, mostrando que haviam células NK nos tumores tanto antes quanto
depois do tratamento. Na marcação de (+), três (3/4- 75%) apresentaram marcação
no momento D0, e um (1/4 – 25%) apresentou marcação no momento D90. E na
marcação em (++) das células positivas, houve uma (1/4 – 25%) no momento inicial
e três (3/4 – 75%) no momento final. Diferentemente no grupo controle, uma (1/5 –
20%) apresentou negatividade no momento D0. Na imunomarcação de uma cruz,
houveram três (3/5 – 60%) no momento D0 e três (3/5 – 60%) no momento D90. Por
fim, de uma (1/5 – 20%) amostra que apresentou duas cruzes no momento inicial, foi
para duas amostras (2/5 – 40%) no momento final.
Observamos dessa forma, como ocorreu com as amostras marcadas pelo
CD3+, as amostras de granzima-B apresentaram aumento de infiltrado de células
NK no tumor somente nos casos em que a marcação era classificada como duas
cruzes (de 10 a 25% das células positivas). Não havendo diferenças entre o grupo
 29

controle e o grupo tratado. De acordo com Rosenberg, et al (2004) o combate efetivo

das células tumorais depende basicamente da geração in vivo de número suficiente
de células imunes com grande capacidade de reconhecimento de antígenos
tumorais; da migração e infiltração destas células no estroma tumoral; e da ativação
das células imunes no microambiente tumoral resultando em mecanismos efetores
apropriados.
Nenhum teste estatístico pode ser aplicado nessa fase da pesquisa,
decorrente do baixo poder amostral. Sendo assim, os resultados apresentados na
Tabela 4 mostram tendências de alterações de frequência das amostras dos grupos
nos diferentes momentos em que foram colhidos.

Tabela 4. Resultados das frequências de quantificação imuno-histoquímica, nos

momentos inicial e final, de cada anticorpo nos grupos tratado e controle.
Avaliação da frequência de CD3+ Granzima-B
≠ ≠
marcação IHQ pré (D0) pós (D90) pré (D0) pos (D90)
Fêmea A Tratamento - - - -
Fêmea D Tratamento 10% 25% ↑ 25% 10% ↓
Fêmea F Tratamento 0% 10% ↑ 10% 25% ↑
Fêmea H Tratamento 10% 25% ↑ 10% 25% ↑
Fêmea I Tratamento 10% 10% = 10% 25% ↑

Fêmea B Controle 10% 25% ↑ 0% 25% ↑

Fêmea C Controle 0% 0% = 25% 10% ↓
Fêmea E Controle 0% 0% = 10% 10% =
Fêmea G Controle 25% 25% = 10% 25% ↑
Fêmea J Controle 10% 10% = 10% 10% =
CD3+: anticorpo anti-CD3; Granzima-B: anticorpo anti-granzimaB; (0%): imonomarcação negativa;
(10%) imunomarcação de 10%; (25%): imunomarcação de até 25%; D0: amostra antes do
tratamento; D90: amostra após o tratamento; ↓: diminuição da frequência; ↑: aumento na
frequência. Fonte: Elaboração própria.

Com relação à rejeição ao tratamento e/ou possíveis efeitos colaterais

caudados pela TLJ ás pacientes tratadas, não foi observado intolerância ou efeitos
adversos na dose utilizada, e pelo período de 90 dias, no presente estudo. Nenhuma
paciente apresentou alterações em exames hematológicos, urinários e de imagem,
que permaneceram dentro da normalidade do início ao final do tratamento.
 30

Juntamente com os dados de possível diminuição dos tumores, e diminuição

na sua rigidez, indicando uma ação positiva na estimulação imunológica antitumoral
da TLJ nas pacientes tratadas, podemos sugerir que análises imuno-histoquímicas
mais detalhadas, apontem resultados satisfatórios quanto a alterações na expressão
de linfócitos CD3+ e NK no tumor de mama das cadelas. Tornando assim possível a
realização de mais estudos com esse mesmo escopo e futuramente, apresentando
resultados promissores, essa substância poderá ser utilizada na rotina oncológica
como complementar no tratamento das neoplasias mamárias das fêmeas caninas.

6. CONCLUSÕES

A partir dos resultados obtidos nesse estudo, nas condições metodológicas

empregadas, podemos concluir que:
 O uso da Tintura do Látex da Janaúba em cadelas com tumor de mama
demonstrou diminuição na rigidez dos tumores, sendo comprovado com
significância pela utilização da Elastografia-ARFI. Contudo, estudos com
um maior poder amostral se faz necessário para comprovar este resultado.
 A análise imuno-histoquímica dos tumores mamários em cadelas para
avaliação do infiltrado inflamatório tumoral, com marcação de linfócitos
CD3+ e NK, sugeriu que a TLJ estimulou de forma relativa um aumento da
resposta linfocitária em tumores que já expressavam essas células, porém
não houve diferença significativa quando comparado com o grupo
controle.
 O uso TLJ não apresentou efeitos adversos ou intolerâncias nas pacientes
desse estudo. Sugerindo ser um composto seguro na dose e frequência
utilizados.
 31

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