UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)

MARIA EDUARDA BANHATO ALBERTONI PAOLUCCI

EFEITOS DO USO DE DIETA A BASE DE CHÁ-VERDE SOBRE A PRÓSTATA DE

RATOS WISTAR SUBMETIDOS À ESTIMULAÇÃO ANDROGÊNICA
PROLONGADA

NITERÓI
2023
 MARIA EDUARDA BANHATO ALBERTONI PAOLUCCI

EFEITOS DO USO DE DIETA A BASE DE CHÁ-VERDE SOBRE A PRÓSTATA DE

RATOS WISTAR SUBMETIDOS À ESTIMULAÇÃO ANDROGÊNICA
PROLONGADA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e
Reprodução Animal) da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial à obtenção do
grau de Mestre. Área de concentração em Clínica
e Reprodução Animal.

Orientador: Prof. Dr. Maurício Alves Chagas

Coorientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Pereira Sampaio
Coorientadora: Dra. Vívian Alves Pereira da Silva

NITERÓI
2023
 MARIA EDUARDA BANHATO ALBERTONI PAOLUCCI

EFEITOS DO USO DE DIETA A BASE DE CHÁ-VERDE SOBRE A PRÓSTATA DE

RATOS WISTAR SUBMETIDOS À ESTIMULAÇÃO ANDROGÊNICA
PROLONGADA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica
e Reprodução Animal) da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial à obtenção do
grau de Mestre. Área de concentração em Clínica
e Reprodução Animal.
Niterói, 29 de dezembro de 2023

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________________
Prof. Dr. Mauricio Alves Chagas – Orientador
Universidade Federal Fluminense - UFF

____________________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Abidu Figueiredo –
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - UFFRJ

____________________________________________________
Profa. Dra. Lanna Beatriz Neves S. Correa –
Universidade Iguaçu – UNIG
 Agradecimentos

Ao meu filho, Dante Paolucci Jann, agradeço por ter entrado em nossas vidas
nesse momento incrível, nos enchendo de alegria e orgulho. Você é meu milagre,
minha benção, meu amor. É por você que acordo todos os dias e me dedico à minha
profissão, por você que dedico minha vida.
Ao meu querido companheiro Higor Wilson Jann, ao qual com certeza foi
minha base emocional durante todo esse processo e muitos outros, ao qual amo
incondicionalmente e pretendo partilhar todos os meus dias juntos.
Aos meus pais, Alessandra Banhato Albertoni e Renato Alves Paolucci,
obrigada por toda a estrutura que vocês me proporcionaram desde pequena até os
dias de hoje. Pelo carinho, pelo conforto e pela minha educação, que se tornou a
minha base para que todo esse processo fosse possível.
Aos meus queridos professores que não mediram esforços para me abrir
oportunidades e poderem me oferecerem uma das virtudes mais preciosas que é o
conhecimento. Em especial ao meu orientador Mauricio Alves Chagas, ao meu
coorientador Marco Aurélio Pereira Sampaio e a minha coorientadora Vivian Alves
Pereira da Silva. Eles não só me proporcionaram uma base intelectual como também
conselhos no caminho profissional e pessoal.
À minha família Banhato, à minha família Paolucci e à minha família Albertoni.
Obrigada pelos ensinamentos, pelo apoio, base e pelo imenso carinho que sempre
tive com vocês.
Aos incríveis profissionais que pude entrar em contato durante minha atuação
profissional e período de pesquisa. Médicos veterinários com uma gama enorme de
conhecimento, profissionalismo e dedicação. Em especial aos Doutores Renato
Abboud, e Mauro Rodrigues. Pessoas que me auxiliaram, me instruíram, dedicaram
parte de seus tempos para me ensinar, me auxiliar e me motivar dentro dessa
profissão
Por fim à Coordenação da Pós- Graduação de Clínica e Reprodução Animal
e aos professores do curso, por me permitir fazer parte de um grupo de profissionais
excelentes e dedicados. Em especial ao coordenador Professor Fellipe Zandonadi
Brandão por todo o acolhimento e auxílio durante todo o meu mestrado em períodos
tão conturbados.
 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 16
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 18
2.1 TESTOSTERONA .......................................................................................18
2.1.1 Esteroidogênese ......................................................................................19
2.1.2 Testosterona e próstata ...........................................................................22
2.2 MORFOLOGIA DA PRÓSTATA .................................................................24
2.2.1 Humano ...................................................................................................24
2.2.2 Rato .........................................................................................................24
2.3 CHÁ-VERDE................................................................................................27
2.4 BIOMARCADORES INFLAMATÓRIOS ......................................................29
2.4.1 Fator de Necrose Tumoral - TNF-α ..........................................................30
2.4.2 Fator de Crescimento Vascular Endotelial - VEGF...................................31
3 OBJETIVOS .................................................................................................. 32
3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................... 32
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 32
4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 32
4.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .......................................................... 32
4.1.1 Fases do estudo ...................................................................................... 31
4.1.2 Distribuição dos grupos ........................................................................... 33
4.2 INDUÇÃO ................................................................................................... 34
4.3 PESO E CONSUMO .................................................................................. 35
4.4 PREPARO DAS RAÇÕES PADRÃO ......................................................... 35
4.5 PREPARO DO CHÁ VERDE...................................................................... 36
4.6 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO ......................................................... 37
4.7 BIOQUÍMICA, SOROLOGIA E PERFIL HEMATOLÓGICO........................37
4.7.1 Perfil hematológico...................................................................................37
4.7.2 Bioquímica................................................................................................38
4.7.1 Sorologia..................................................................................................38
4.8 COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS................................................................39
4.8.1 Hematoxilina-eosina ................................................................................ 39
4.8.2 Picro Sirius Red........................................................................................39
4.9 IMUNOHISTOQUÍMICA ............................................................................. 40
4.10 ANÁLISE MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA ..................................... 40
4.10.1 Análise histomorfométrica da próstata .................................................. 40
4.10.1.1 Altura de epitélio..................................................................................41
4.10.1.2 Área epitelial........................................................................................41
4.10.1.3 Área alveolar individual e total das próstatas......................................42
4.11 ANÁLISE QUANTITATIVA IMUNOHISTOQUIMICA.................................43
4.12 ANÁLISE QUALITATIVA DO COLÁGENO................................................44
4.13. ANÁLISES ESTATÍSTICAS .................................................................... 44
5. RESULTADOS ............................................................................................. 45
5.1 PESO E CONSUMO....................................................................................45
5.2 PERFIL HEMATOLÓGICO.........................................................................47
5.3 PERFIL LIPÍDICO........................................................................................49
5.4 ENZIMAS HEPÁTICAS E PERFIL PROTEICO...........................................50
5.5 TESTOSTERONA E CITOCINAS SÉRICAS...............................................51
5.6 MORFOMETRIA..........................................................................................52
5.7 ANÁLISE DE COLÁGENO..........................................................................53
5.8 IMUNOHISTOQUIMICA...............................................................................55
6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 56
7 CONCLUSÕES ............................................................................................. 64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 65
ANEXO 1 .......................................................................................................... 78
ANEXO 2 ..........................................................................................................79
ANEXO 3 ..........................................................................................................80
ANEXO 4 ..........................................................................................................81
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Perfil hematológico dos grupos de ratos avaliados. ---------------------------- 48

Tabela 2 - Perfil lipídico dos grupos de ratos avaliados. ------------------------------------ 49
Tabela 3 - Enzimas hepáticas e perfil proteico dos grupos de ratos avaliados. -------50
Tabela 4 - Níveis de testosterona e citocinas séricos dos grupos de ratos avaliados.51
Tabela 5 - Parâmetros morfométricos das próstatas dos grupos de ratos avaliados-52
Tabela 6 – Valor em % de marcação específica de anticorpo VEGF em relação ao
epitélio das próstatas dos grupos de ratos avaliados. ----------------------------------------55

LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Painel de citocinas produzidas na resposta inflamatória que foram
utilizados como biomarcadores no estudo, suas características e funções básicas--30
Quadro 2 – Grupos experimentais do estudo. -------------------------------------------------33
Quadro 3 - Balanceamento de nutrientes nas rações utilizadas no estudo (g/100g)-36

LISTA DE FIGURAS
Figura 1: – Corte histológico de testículo. -------------------------------------------------------21
Figura 2: – Conversão de testosterona em di-hidrotestosterona --------------------------22
Figura 3: – Esquema da anatomia da próstata do rato. -------------------------------------25
Figura 4: –Imagem digitalizada de corte histológico da próstata de um rato. ---------26
Figura 5: – Floração e folhas de C. sinensis. --------------------------------------------------27
Figura 6:– Preparo e inserção cirúrgica do implante de silicone preenchido com
propionato de testosterona. -------------------------------------------------------------------------34
Figura 7: – Imagem digital da lâmina da próstata em HE. ----------------------------------41
Figura 8: – Imagem digital da lâmina da próstata inteira binarizada. --------------------42
Figura 9: – Imagem digital da lâmina da próstata binarizada da objetiva 4x.----------43
Figura 10: – Imagem digital da lâmina marcada com anticorpo anti- VEGF da próstata
da objetiva 40x.-----------------------------------------------------------------------------------------44
Figura 11 - Imagens da próstata dos grupos estudados evidenciando a altura do
epitélio prostático --------------------------------------------------------------------------------------53
Figura 12 - Imagens à esquerda digitalizadas sob luz polarizada de corte da próstata
em comparação com o mesmo corte não polarizado à direita. ----------------------------54
Figura 13 - Imagens da análise qualitativa da marcação citoplasmática específica de
VEGF no epitélio prostático dos grupos de ratos avaliados. --------------------------------56

LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1– Percentuais de nutrientes no chá verde-------------------------------------------29
Gráfico 2– Evolução de massa corpórea dos animais em estudo Evolução de massa
corpórea dos animais. --------------------------------------------------------------------------------45
Gráfico 3– Consumo de ração pelos animais dos grupos experimentais ao longo do
experimento. --------------------------------------------------------------------------------------------46
Gráfico 4– Consumo hídrico ao longo do período do experimento. ----------------------46
 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ACTH Hormônio adenocorticotrófico

(Adrenocorticotropic hormone)
AIN American Institute of Nutrition
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais
CHCM Concentração Hemoglobina Corpuscular Média
CV Chá verde
DHEA Di-hidroepiandrosterona
DHT Di-hidrotestosterona
DNA Ácido desoxirribonucleico
EDTA Ácido etileno-diamino-tetracético
(Ethylenediamine tetraacetic)
EGC Epigalocatequina
EGCG Epigalocatequina-3-Galato
EGCOG Epigalocatequina-3-O-Galato
FSH Hormônio folículo estimulante
(Follicle-stimulating hormone)
GCA Grupo controle
GCCV Grupo controle chá verde
GIA Grupo induzido
GICV Grupo induzido chá verde
HB Hemoglobina
HDL Lipoproteína de Alta Densidade
(High Density lipoprotein)
HE Hematoxilina-eosina
HIF-1 α Fator Indutor de Hipóxia 1- alfa
HPB Hiperplasia prostática benigna
HTC Hematócrito
LaBCEx Laboratório de Biomorfologia Celular e Extracelular
LabNE Laboratório de Nutrição Experimental
LCT Leucometria Global
LDL Lipoproteína de Baixa Densidade
(Low Density Lipoprotein)
LG Contagem de Leucócitos
LH Hormônio luteinizante
(Luteinizing Hormone)
LINF Percentual de Linfócitos
MON Percentual de Monócitos
NADPH Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina
PBS Solução Salina Tamponada
(Phosphate Buffered Saline)
PLQ Contagem de Plaquetas
PSA Antígeno Prostático Específico
(Prostate-Specific Antigen)
RDW Índice de anisocitose
RIE Radioimunoensaio
SEG Percentual de segmentados
SRD5A Enzima 5-alfa-redutase
TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa
(Tumor Necrosis Factor-alpha)
TG Triglicerídeos
VCM Volume Corpuscular Médio
VEGF Fator de Crescimento Vascular Endotelial
(Vascular Endothelial Growth Factor)
VEGFR Receptor do Fator de Crescimento Vascular Endotelial
VLDL Lipoproteína de Densidade Muito Baixa
(Very Low Density Lipoprotein)
 RESUMO

Introdução: A hiperplasia prostática benigna e o câncer de próstata são afecções

comuns em homens senis. O uso da testosterona exógena vem sendo realizado como
suplementação devido às deficiências naturais ocasionadas por esse avanço da
idade, podendo gerar algumas alterações na próstata. Além disso, os alimentos
funcionais, tais como o chá verde, tem grande valor na prevenção e no controle de
processos inflamatórios, como as que ocorrem na próstata naturalmente e durante o
tratamento hormonal, já que podem diminuir o dano provocado pelo estresse
oxidativo. A hipótese científica desse trabalho é que a administração de chá verde à
ratos submetidos a doses suprafisiológicas de testosterona, atenua os danos teciduais
provocados pela estimulação androgênica prolongada na próstata. Objetivo: Avaliar
os efeitos do consumo de chá verde sobre a próstata de animais submetidos à
estimulação androgênica prolongada com doses suprafisiológicas de testosterona.
Foram avaliados através da análise morfologica da próstata; da análise
imunohistoquímica do índice de proliferação do fator de crescimento vascular
endotelial (VEGF) e dos os resultados obtidos nos testes laboratoriais (bioquímicos,
hematológicos, testosterona sérica, citocinas séricas – VEGF e TNF-α). Metodologia:
Foram utilizados 28 ratos Wistar com 42 dias de idade no início do experimento
separados em 4 grupos: GCA (Grupo Controle Água); GIA (Grupo Induzido Água);
GCCV (Grupo Controle Chá Verde); GICV (Grupo Induzido Chá Verde). Implantes
contendo propionato de testosterona foram aplicados cirurgicamente, e substituídos a
cada 3 semanas. Esses animais receberam dietas padronizadas e consumiram água
ou chá verde (2%) para sua hidratação. Após 20 semanas, os animais receberam
sofreram punção para coleta de sangue e em seguida dose letal de tiopental sódico.
Foi realizada análise sorológica do sangue e dissecção da próstata ventral para
posterior processamento e análise morfométrica. As análises contaram com avaliação
da altura do epitélio da próstata, da área epitelial, da área alveolar individual e análise
quantitativa de marcação imunohistoquímica anti-VEGF. Resultados: A partir dos
exames sorológicos observou-se que os grupos induzidos sofreram a indução
androgênica esperada. Os animais do grupo induzido com a dieta terapêutica
apresentaram efeitos deletérios reduzidos em sua morfologia prostática e na liberação
sistêmica de citocinas, quando comparados aos animais induzidos com a dieta
controle. Além disso, apresentaram menor marcação imuno-histoquímica anti –
VEGF. Conclusão: Conclui-se que o chá verde atua sobre a histomorfometria da
próstata e reduzindo a altura e área epitelial prostático em animais com HPB induzida
por testosterona. A análise imuno-histoquímica de VEGF mostra que também há um
fator anti-angiogênico no uso do chá verde sobre a próstata, reduzindo a marcação
nos animais que fizeram uso do nutracêuticos.

Palavras-chave: Próstata; chá-verde; rato

 ABSTRACT

Introduction: Benign prostatic hyperplasia are common conditions in senile men. The
use of exogenous testosterone has been carried out as a supplement due to the natural
deficiencies caused by old age, which may generate some alterations in the prostate.
In addition, functional foods, such as green tea, are of great value in the prevention
and control of inflammatory processes, such as those that naturally occur in the
prostate and during hormonal treatment reducing the damage caused by oxidative
stress. The scientific hypothesis of this work is that the administration of green tea to
rats submitted to supraphysiological doses of testosterone, attenuates the tissue
damage caused by prolonged androgen stimulation in the prostate. Objective: To
evaluate the effects of green tea consumption on the prostate of animals subjected to
prolonged androgenic stimulation with supraphysiological doses of testosterone. They
were evaluated through morphological analysis of the prostate; immunohistochemical
analysis of the vascular endothelial growth factor (VEGF) proliferation index and the
results obtained in laboratory tests (biochemical, hematological, serum testosterone,
serum cytokines – VEGF and TNF-α). Methodology: 28 Wistar rats, 42 days old, were
used at the beginning of the experiment, separated into 4 groups: GCA (Water Control
Group); GIA (Induced Water Group); GCCV (Green Tea Control Group); GICV (Green
Tea Induced Group). Implants containing testosterone propionate were surgically
applied and replaced every four weeks. These animals received standardized diets
and consumed water or green tea (2%) for hydration. After 20 weeks, the animals
received a lethal dose of sodium thiopental. The prostate dissection were performed
for further histological processing and morphometric analysis. The analyzes included
evaluation of the height of the prostate epithelium, epithelial area, individual and total
alveolar area and quantitative analysis of anti-VEGF immunohistochemical staining.
Results: Based on the serological tests done by Silva 2019, it was observed that the
induced groups suffered the expected androgen induction. The animals in the group
induced with the therapeutic diet showed reduced deleterious effects in their prostate
morphology, when compared to the animals induced with the control diet. In addition,
they showed lower anti-VEGF immunohistochemical staing. Conclusion: It is
concluded that green tea acts on prostate histomorphometry and reduces prostate
epithelial height and area in animals with testosterone-induced BPH. The
immunohistochemical analysis of VEGF shows that there is also an anti-angiogenic
factor in the use of green tea on the prostate, reducing marking in animals that used
the nutraceuticals.

Keywords: Prostate; green tea; rat

 16
16
14

1 INTRODUÇÃO
A incidência de doenças associadas ao envelhecimento vem crescendo em
consequência do aumento da expectativa de vida mundial. Na população masculina,
um dos órgãos mais atingidos por afecções patológicas é a próstata (JEMAL, 2008;
LIM, 2017). Os mecanismos que desencadeiam ou fazem progredir rapidamente as
afecções prostáticas ainda não estão totalmente compreendidas. Sabe-se que o
desequilíbrio na interação homeostática entre o epitélio e o estroma prostático pode
iniciar e promover as lesões na próstata (SUNG & CHUNG, 2002; NORMAN, 2008);
outros fatores também são relacionados com o surgimento de lesões, como os
hormônios androgênicos (JARVIS, CHUGHTAI & KAPLAN, 2015), suscetibilidade
genética, hábitos nutricionais (HO, BOILEAU & BRAY, 2004) e contaminantes
ambientais (OMABE 2011; LIM, 2017). O desbalanceamento hormonal associado ao
envelhecimento é um dos processos mais aceitos como iniciador das modificações
celulares que levam a hiperplasia prostática benigna (SAVOLAINEN et al., 2007; LIM,
2017). Geralmente nestes indivíduos, a enzima 5-α-redutase apresenta uma
capacidade aumentada de conversão da testosterona em dihidrotestosterona (DHT),
estimulando a proliferação do tecido prostático (ZHANG et al., 2008, MIRANDA,
2020). Em homens, o balanço dos níveis de androgênios e estrogênios é alterado
significativamente com a idade. O desequilíbrio hormonal leva ao comprometimento
da razão entre andrógenos e estrógenos, e esse é um fator predisponente para que
haja desenvolvimento da HPB (NICHOLSON & RICKE, 2011).
As prescrições de testosterona aumentaram mais de 3 vezes entre 2001 e 2011
em todas as faixas etárias (KWONG, 2019) A deficiência androgênica em homens
idosos é um fator de risco para diversas doenças e condições que afetam a qualidade
de vida do indivíduo (TRAISH et al., 2009; FODE, 2019). MARKS (2006) demonstrou
que o tratamento com testosterona para hipogonadismo teve um efeito nos níveis de
andrógenos do tecido prostático e nas funções celulares. Ainda há consideráveis
controvérsias sobre a influência da reposição de testosterona na próstata, pois a
incidência de HPB e câncer de próstata oculto em idosos são ambos elevados (MINER
& SEFTEL, 2007). Ensaios clínicos mostraram que o tratamento com testosterona de
homens hipogonádicos causa crescimento da próstata e aumento do antígeno
prostático específico (PSA) dentro da faixa normal (RHODEN & MORGENTALER,
2006). A testosterona acelera a mitose de células senescentes contendo defeitos de
DNA, o que resulta na falta de reparo do DNA. (NIESCHLAG et al., 2008). Parece que
 17

a testosterona aumenta o agravamento dos sintomas do trato urinário inferior em

pacientes com HPB, mas os ensaios dedicados a essas relações são muito curtos e
os dados registrados ainda são escassos (DREWA & CHŁOSTA, 2010).

A angiogênese é definida como o desenvolvimento de novos vasos vasculares

a partir de vasos sanguíneos pré-existentes. A angiogênese tem um papel crítico na
cicatrização de feridas e no desenvolvimento embrionário e fornece formação de
colaterais para melhorar a perfusão de órgãos na isquemia. Em processos
inflamatórios, há uma produção constante de indutores de angiogênese, como o fator
de crescimento endotelial vascular (VEGF) assim como o fator de necrose tumoral
(TNF-α) (RASHIBI, 2017). O VEGF, tem sido extensivamente estudado e tem
demonstrado desempenhar um papel importante na angiogênese da próstata (LING,
2005). Há ampla distribuição de VEGF em amostras de câncer de próstata, assim
como na HPB, contribuindo significativamente para o aumento da vascularização
observada nessas condições. (STEFANOU, 2005; RIVERA-PEREZ, 2018). Melegh
(2019) demonstrou também que o aumento nas marcações de VEGF realizadas por
imuno-histoquímica na próstata de indivíduos com câncer de próstata estão
relacionadas com um prognóstico desfavorável da doença.

O chá verde (Camellia sinesis) é amplamente conhecido por suas propriedades

anticancerígenas e anti-inflamatórias. Entre os compostos biologicamente ativos
contidos na Camellia sinesis, os principais agentes antioxidantes são as catequinas.
Pesquisas científicas recentes indicam que o número de grupos hidroxila e a presença
de grupos estruturais característicos têm um grande impacto na atividade antioxidante
das catequinas. A melhor fonte desses compostos é o chá verde não fermentado
(MUSIAL, KUBAN-JANKOWSKA & GORSKA-PONIKOWSKA, 2019; CARDOSO,
2020). Devido às inúmeras propriedades promotoras da saúde das catequinas,
recomenda-se incluir produtos que contenham catequinas na dieta diária. A atividade
anti-inflamatória e antioxidante, bem como quimiopreventiva, é considerada a ação
mais importante do grupo das catequinas (SINGH, 2011). Tomados em conjunto a
literatura atualizada, o chá verde parece promissor em termos de efeitos
quimiopreventivos e terapêuticos contra o câncer de próstata e prevenção de HPB,
mas não há evidências estabelecidas (MUSIAL 2020; CICERO 2019).
O uso da suplementação de testosterona, devido a diminuição fisiológica de
 18

sua produção devido a idade, pode levar a alterações consideráveis na próstata. Não
se sabe se essas alterações podem levar a uma maior taxa de incidência de HPB ou
câncer prostático em indivíduos machos adultos. O câncer prostático está na segunda
posição em relação aos cânceres mais frequentes no mundo. Já a HPB está
amplamente disseminada, e acomete sobretudo homem e cão, estando sua patogenia
associada a fatores predisponentes como androgenia, estresse oxidativo e estresse
inflamatório. Devido às propriedades anticancerígenas e anti-inflamatórias, o uso de
fitoterápicos como o chá-verde vêm na atualidade para tentar diminuir os riscos de
desenvolver o câncer e HPB.
Por isso, o presente estudo é necessário para a avaliação dos efeitos
relacionados a administração de testosterona e as alterações morfológicas na
próstata, já que são escassamente descritos na literatura. Além disso, é necessária a
avaliação dos efeitos benéficos de componentes nutracêuticos em atenuar essas
alterações.
Esse trabalho tem como objetivo estudar os efeitos de uma dieta experimental
à base de chá verde sobre a morfologia da próstata de ratos submetidos à estimulação
androgênica prolongada com doses suprafisiológicas de testosterona, avaliando a
morfologia da próstata desses animais e o grau de angiogênese gerado no órgão
através da imunohistoquimica com anticorpo anti- VEGF.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 TESTOSTERONA
A testosterona é o principal esteroide circulante no homem. É sintetizada a
partir da molécula de colesterol e secretada pelas células de Leydig no testículo e pelo
córtex da glândula suprarrenal, respondendo ao estímulo do hormônio luteinizante
(LH) e do hormônio adenocorticotrófico (ACTH) respectivamente. O hormônio e seus
derivados ativos são promotores e mantedores das características sexuais masculinas
e condição anabólica dos tecidos. (ZHANG et al., 2008) A testosterona apresenta
efeitos em diversos locais no organismo, e esses efeitos são promovidos pela própria
testosterona ou mesmo pelos seus metabólitos. (HARTGENS & KUIPERS, 2004)
Como veremos a seguir, a metabolização da testosterona pode gerar
esteróides ativos como di-hidrotestosterona (DHT) e o estradiol. Em termos gerais,
sabe-se que a testosterona é convertida irreversivelmente em DHT pela enzima 5-
 19

alfa-redutase (RUBIO-GAYOSSO et al., 2013) e também é convertida em estradiol

pelo complexo enzimático aromatase presente no tecido adiposo e fígado. Esta
conversão da testosterona em estradiol corresponde a 85% do estradiol circulante
nos homens. (FORTUNATO, ROSENTHAL & CARVALHO, 2007; ZHANG et al.,
2008)

2.1.1 Esteroidogênese
Cerca de 95% da testosterona circulante no homem é de origem testicular. O
percentual restante tem origem suprarrenal, seguido da conversão periférica de
androstenediona. Outros andrógenos detectáveis no sangue têm origem no testículo,
como a di-hidrotestosterona (DHT), di-hidroepiandrosterona (DHEA) e a
androstenediona. (DA SILVA JR & DE LEYDIG, 2001)
O processo de esteroidogênese suprarrenal é altamente modulado e se inicia
pelo estímulo adeno-hipofisário por meio do hormônio adrenocorticotrófico, cujo
nome é geralmente abreviado para a sigla ACTH (adrenocorticotropic hormone em
inglês). O ACTH é um polipeptídeo com trinta e nove aminoácidos produzido pelas
células corticotróficas da adeno-hipófise.
Todos os hormônios sintetizados pelo córtex da adrenal são derivados do
mesmo precursor, o colesterol, que provém essencialmente das lipoproteínas
plasmáticas. O mesmo acontece com os hormônios secretados pelos ovários
(progesterona e estradiol) e pelos testículos (testosterona). Por esta razão, este
grupo de hormônios é chamado de hormônios esteróides. Neste processo, cada zona
do córtex adrenal secreta um distinto subgrupo de hormônios (glicocorticóides,
mineralocorticóides, esteróides sexuais), em decorrência da expressão diferencial de
enzimas envolvidas no processo de metabolização dos derivados do colesterol.
Uma vez estimulada a glândula, o colesterol é clivado de sua cadeia lateral
pela enzima colesterol desmolase, originando a pregnenolona. A pregnenolona pode
ser convertida até di-hidroepiandrosterona (DHEA - um andrógeno), e DHEA sulfato,
via enzimas 17-hidroxilase, C17-20-liase e sulfotransferase. A pregnenolona ainda
pode ser convertida a progesterona via 3-beta-hidroxiesteroide desidrogenase e a
delta-5,4-isomerase. A partir da progesterona, as enzimas 21-hidroxilase e
aldosterona sintase, sintetizam a aldosterona (sendo a desoxicorticosterona e a
corticosterona os intermediários). Assim, os principais mineralocorticóides
secretados pela zona glomerulosa são a aldosterona e a desoxicorticosterona. Ao
 20

passo que os principais andrógenos secretados pela zona reticular são a DHEA,
DHEA sulfato e a androstenediona. De uma forma geral, o ACTH estimula estas
reações de forma mais ou menos importante de acordo com a zona do córtex, sendo
seu efeito mais pronunciado sobre a zona fasciculada e a síntese de glicocorticóides.
(FARIA & LONGUI, 2006)
Nos indivíduos do sexo masculino, a produção de precursores e a conversão
em metabólitos ativos ocorre nos testículos. Essa função de sercreção e conversão
testicular da testosterona fica a cargo das células de Leydig e de Sertoli (Figura1).
(GUYTON, HALL & GUYTON, 2006)
A produção de testosterona pelas células de Leydig é controlada pelo
hormônio luteinizante (LH), que se liga especificamente à membrana das células de
Leydig, ativando a adenosina monofosfato cíclica. Este processo dá início a ativação
das proteínas cinases que catalisam a fosforilação das proteínas intracelulares e a
mobilização de precursores esteróides, principalmente através da conversão do
colesterol em pregnenolona. As principais vias biossintéticas a partir da
pregnenolona nesse caso envolvem os intermediários delta 4 e 5. A testosterona
produzida pelas células de Leydig se desloca pelo túbulo seminífero por difusão ativa
ou facilitada, mantendo a concentração de andrógenos aumentada no tecido, a fim
de que exerça suas funções.
A metabolização da testosterona ocorre no contexto das células de Sertolli no
testículo. A função secretória da célula de Sertoli é controlada pelo hormônio folículo
estimulante (FSH). O FSH (assim como o LH) é produzido pela hipófise e regula a
atividade tanto dos ovários como dos testículos. Os receptores para FSH e para
andrógenos estão presentes tanto no núcleo quanto no citoplasma da célula de
Sertoli. São estas células as responsáveis por converter a testosterona produzida
pela célula de Leydig em seus metabólitos ativos, sejam estrogênios, que serão
armazenados nos testículos, sejam andrógenos derivados da testosterona.
(SERAKIDES et al., 2001)
 21

Figura 1 – Corte histológico de testículo

Legenda: Corte histológico do testículo onde é possível visualizar as células de Leydig e Sertoli.
Coloração pela Hematoxilina-eosina. Calibração não informada. Fonte: Dutra, 2016 (USP)

É na célula de Sertoli que a testosterona é convertida em di-hidrotestosterona

(DHT), um andrógeno de maior potência biológica (Figura 2). DHT é sintetizado a
partir de testosterona pela enzima 5-alfa-redutase, na presença de NADPH. Cerca
de 5 a 7% de testosterona sofre a conversão em DHT por causa da ação dessa
enzima, e aproximadamente 200 a 300 μg de DHT são sintetizados no corpo por dia.
Existem duas isoformas principais da enzima 5-alfa-redutase: SRD5A1 (tipo I) e
SRD5A2 (tipo II); sendo esta última biologicamente mais importante. Os receptores
das duas isoformas da enzima são amplamente distribuídos, e podem ser
identificados em órgãos genitais, glândula prostática, epidídimos, glândula vesicular,
pele genital, músculo estriado, próstata e fígado (tipo II), folículos de pele/cabelo,
glândulas sebáceas e sudoríparas e certas áreas do cérebro (tipo I), entre outros.
(RUBIO-GAYOSSO et al., 2013)
 22

Figura 2– Conversão de testosterona em di-hidrotestosterona

Legenda: Representação da conversão química da testosterona em di-hidrotestosterona. Fonte:

www.saberatualizado.com.br. Produzido em 2016. Acessado em 2023.

2.1.2 Testosterona e a próstata

Com o início da puberdade os níveis de testosterona e DHT aumentam de
forma fisiológica, assumindo um intacto eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. Este
evento impulsiona as mudanças físicas associadas a maturidade sexual. As células-
tronco espermatogoniais nos testículos então começam a sofrer divisão meiótica em
espermatozóides. Na próstata, há proliferação de células epiteliais para que ocorra
um crescimento do órgão que participa da composição do líquido seminal a partir de
suas secreções prostáticas (ALUKAL, 2016). Sendo assim, a testosterona possui
uma influência na proliferação das células epiteliais da próstata fisiologicamente, e a
partir do uso de testosterona exógena para tratamento de reposição hormonal o
indivíduo poderia apresentar um desenvolvimento anormal dessas células,
possivelmente contribuindo para o desenvolvimento de HPB (MARKS, 2006). No
momento, não há evidências conclusivas que a terapia com testosterona aumenta o
risco de HBP. No entanto, há evidências de que a testosterona pode estimular o esse
crescimento epitelial no homem senil e agravar sintomas de trato urinário inferior
(NIESHLAG, et.al., 2008).
Alguns estudos ao longo dos anos confirmaram algumas relações entre a
terapia hormonal de reposição e a HBP; as várias formulações de testosterona que
estão atualmente disponíveis comercialmente incluem advertências sobre piora dos
sintomas urinários no início da terapia. Essa relação provavelmente se dá pela
 23

conversão da testosterona aumentada/suplementada em DHT. Esse aumento dos

níveis de DHT conduziria à HBP e piora os sintomas urinários em alguns pacientes
(ALUKAL, 2016). A próstata não é um receptor passivo de testosterona e DHT
circulantes, mas tem a capacidade de sintetizar e metabolizar esses andrógenos.
Portanto, exceto quando os níveis séricos de testosterona são extremamente baixos,
os níveis intraprostáticos de DHT são controlados principalmente por fatores
intraprostáticos, e não pelos níveis circulantes desses hormônios. Em revisões
abordando os níveis intraprostáticos de testosterona e DHT na HBP, houve grandes
variações nos níveis de DHT intraprostático, mas não houve diferenças
demonstráveis entre esses níveis no tecido prostático normal e no tecido da HBP. Em
um estudo que explorou a resposta androgênica intraprostática em pacientes com
HBP tratados com inibidores da 5α-redutase, que diminuem os níveis de DHT nos
tecidos, houve reduções marcantes nos níveis séricos de DHT e testosterona. Porém
os níveis intraprostáticos de andrógenos estavam acima do limiar necessário para a
ativação de receptores de andrógenos que promovem um feedback negativo na
produção de testosterona (SWERDLOFF, 2017).
Os andrógenos são necessários, mas não suficientes para o desenvolvimento
da HBP. Já se tem estabelecida a relação de componentes da síndrome metabólica
(obesidade, hipertensão, dislipidemia, comprometimento regulação da glicose e
resistência à insulina) a baixos níveis séricos de testosterona em homens
(NIESHLAG, et.al., 2008) Estudos em animais têm ajudado a elucidar esse papel. Em
um estudo canino, jovens cães castrados só desenvolveram HBP após reposição de
testosterona. HBP regrediu em idosos cães após a castração, mas retornaram após
administração de testosterona exógena (BERRY et. al., 1986). Homens com
hipogonadismo primário, que normalmente não desenvolveriam HPB, agora podem
desenvolver HPB após terapia de reposição de testosterona (SASAWAGA, 1990).
Dessa forma, essa relação entre a terapia hormonal com testosterona e o
desenvolvimento de HPB ainda possui diversas controvérsias na literatura
necessitando de estudos mais aprofundados no tema.
 24

2.2 MORFOLOGIA DA PROSTATA

2.2.1 Humano
A próstata humana é um conjunto de 30 a 50 glândulas túbulo-alveolares
ramificadas que envolvem uma porção da uretra chamada uretra prostática. A próstata
tem três zonas distintas: a zona central, a zona de transição e a zona periférica; seus
ductos desembocam na uretra prostática. As glândulas túbulo-alveolares da próstata
são formadas por um epitélio cuboide alto ou pseudoestratificado colunar (figura 1).
Um estroma fibromuscular cerca as glândulas. A próstata é envolvida por uma cápsula
fibroelástica rica em músculo liso. Septos dessa cápsula penetram a glândula e a
dividem em lóbulos. As glândulas produzem secreção e a armazenam para expulsá-
la durante a ejaculação. Da mesma maneira como a glândula vesicular, a estrutura e
a função da próstata são reguladas por testosterona. Pequenos corpos esféricos
formados por glicoproteínas, medindo 0,2 a 2 mm de diâmetro e frequentemente
calcificados, são frequentemente observados no lúmen de glândulas da próstata de
adultos. Eles são chamados concreções prostáticas ou corpora amylacea. A HPB é
um aumento do volume da próstata que ocorre normalmente na zona de transição,
podendo causar a obstrução da uretra, levando a sintomas clínicos em 5 a 10% dos
casos. Já os tumores prostáticos malignos ocorrem principalmente na zona periférica
do órgão (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).

2.2.2 Rato
A próstata do rato é uma glândula exócrina túbulo-alveolar altamente
especializada (LEE & HOLLAND, 1987). Consiste em quatro lobos pares distintos
(direito e esquerdo), a próstata dorsal, a próstata lateral, a próstata ventral e a próstata
anterior ou glândula coaguladora, classificadas de acordo com sua posição em
relação ao uretra, para onde drenam os ductos glandulares (LEE & HOLLAND,
1987; HAYASHI, 1991). O esquema da anatomia desses orgãos pode ser visualizado
mais detalhadamente na figura 3.
A próstata ventral consiste em dois lobos discretos que estão ligados à uretra
por uma camada de tecido conjuntivo e por uma série de ductos revestido
principalmente por epitélio cuboidal que drena para a uretra. Ela surge da face ventral
da uretra, imediatamente abaixo da bexiga. É o maior lobo, constituindo
 25

aproximadamente metade da massa de todo o tecido prostático, e é mais facilmente

separado do resto da próstata. É composto por ácinos de tamanhos variados
compactados, revestidos por epitélio colunar baixo a alto, citoplasma basofílico (Figura
4). As glândulas apresentam dobramento muito escasso, são cercadas por uma
quantidade muito pequena de músculo liso e contêm secreções serosas eosinofílicas
(CREASY, et. al., 2012; HAYASHI, 1991; JESIK, et al., 1982).
A próstata lateral está logo abaixo da glândula vesicular e da glândula
coaguladora e com poucas a moderadas áreas de dobramento epitelial. Devido à
relativa dificuldade associada à individualização anatômica dos lobos dorsal e lateral
e às características histológicas sobrepostas semelhantes, esses lobos são
geralmente classificados como um único elemento, denominado próstata dorsolateral.
A próstata dorsal está localizada abaixo e atrás da fixação da glândula vesicular e da
glândula coaguladora e circunda a uretra dorsalmente. Microscopicamente,
assemelha-se à glândula coaguladora. Os ácinos são pequenos, com dobramento
reduzido do epitélio e estão frouxamente distribuídos dentro do estroma Os alvéolos
dos lobos dorsais são grandes e menos enovelados do que os lobos ventral ou dorsal,
além de serem frouxamente distribuídos dentro o tecido estromal (JESIK, et al., 1982;
HAYASHI, 1991).

Figura 3– Esquema da anatomia da próstata do rato.

Legenda: Disposição dos lobos prostaticos em relação aos orgão adjacentes; Lobo Ventral (V); Lobo
Lateral (L); Lobo Dorsal (D); Conteudo adaptado de Nascimento-Gonçalves, et. al.
 26

Porções de outras glândulas acessórias sexuais próximas à próstata incluem

as glândula vesicular, glândulas coaguladoras, vasos deferentes e ampolas, uretra,
bexiga urinária e ureteres. As glândula vesicular e seus ductos podem ser
identificados pela sua localização, principalmente pelo epitélio cuboidal (JESIK, et al.,
1982). A glândula coaguladora é às vezes chamada de próstata dorsocranial, cranial
ou anterior e fica adjacente e paralela à superfície côncava da glândula vesicular. As
glândulas são revestidas por epitélio simples cubóide a colunar, as células estão
dispostas em extenso padrão de ramificação, formando estruturas papilares ou
cribriformes, e o lúmen contém uma secreção proteica eosinofílica pálida, abundante
e homogênea semelhante a aquele visto na próstata dorsal. A altura epitelial varia em
toda a glândula, assim como a atividade secretora (CREASY, et. al., 2012; HAYASHI,
1991)
Figura 4– Imagem digitalizada de corte histológico da próstata ventral de um rato

Legenda: Imagem evidenciando o epitélio das glândulas tubuloalveolares da próstata ventral

constituído de células cuboides ou colunares e o estroma fibromuscular ao redor do epitélio. Coloração
de Hematoxilina-eosina (HE). 40x. Fonte: Chagas, 2019 – LaBCEx
 27

2.3 CHÁ-VERDE
O chá verde (CV) é um tipo de chá feito a partir da infusão da planta Camellia
sinensis (Figura 5). O preparo das folhas para a confecção do chá verde difere das
demais porque estas sofrem pouca oxidação durante o processamento. Existem
algumas outras ervas que são comercializadas sob o título de chá verde, mas
originalmente considera-se chá verde apenas a infusão das folhas de C. sinensis.
A infusão desta erva está entre as mais populares bebidas do mundo e seus
benefícios para o ser humano são conhecidos. Os extratos do chá verde e dos seus
polifenóis exibem efeitos inibitórios contra a formação e desenvolvimento de tumores
em diversos sítios do organismo – pulmão, esôfago e cólon - em modelos animais.
(YANG & WANG, 2010; YUAN, 2011) Estudos mostram que a administração do
extrato do CV pode reduzir a incidência e proliferação de tumores no pulmão, em
camundongos. (GU et al., 2013)

Figura 5 – Floração e folhas de C. sinensis.

Legenda: Figura extraída da página da internet dos Laboratórios Chamel e Kittmed. Acesso
18/06/2023. URL: https.://chamel.com.br/loja/chas-plantas-medicinais/cha-verde-2

Os extratos do CV têm efeito antioxidante, que reduz a ação destrutiva das

moléculas de radicais livres que degeneram as células, auxiliando também no
combate aos efeitos do envelhecimento, no metabolismo de lipídios e na redução do
risco de doenças vasculares. (KISHIMOTO, TANI & KONDO, 2013) Entre os
componentes do CV estão bioflavonoides, catequinas, polifenóis e tanino. O CV
também é rico em micronutrientes (vitaminas e minerais como manganês,
 28

potássio, ácido fólico, vitamina C, vitamina K, vitamina B1 e a vitamina B2) e

apresenta propriedades diuréticas (Gráfico 1). (SANG et al., 2011)
Um dos principais polifenóis do Chá verde é a Epigalocatequina-3-galato
(EGCG), que é um potente indutor de apoptose, além de ser capaz de inibir a
migração de células tumorais em casos de câncer nas vias respiratórias. (HAZGUI
et al., 2008) Além da EGCG, outro polifenol presente no CV - a Epigalocatequina
(EGC) - tem um importante efeito inibidor do crescimento celular em algumas
linhagens de câncer de pulmão.
Existem evidências na literatura da influência dos componentes do chá verde
sobre hormônios esteróides. Um estudo utilizando cultura de células mostrou que os
polifenóis presentes no CV têm ação sobre o metabolismo da testosterona, através
da via de conversão do hormônio em seus metabólitos ativos. A EGCG e a EGC
promovem inibição da enzima 5-alfa-redutase, e assim também diminuem a atividade
da DHT. (HIIPAKKA et al., 2002) Além disso, há evidências que a administração de
extrato composto por polifenóis (sobretudo EGCG e EGC purificados), provenientes
do chá verde, diminui a produção de testosterona pelas células de Leydig.
(FIGUEIROA et al., 2009). Sendo assim, o efeito protetivo à próstata do CV está
relacionado não só a suas propriedades anti-oxidativas, mas também a sua
capacidade de diminuir níveis séricos de testosterona ao inibir a aromatase (MUSIAL
et al., 2019; SATOH et al., 2002). Uma outra via de atuação seria a via das
aromatases - enzimas do citocromo p450 que agem como mediadores
da aromatização de andrógenos em estrógenos - que sofre influência dos
componentes do chá verde. (MONTEIRO et al., 2008).
Estudos mostraram que os polifenóis presentes no chá verde têm a
capacidade de influenciar o metabolismo de lipídios no organismo. Um dos indícios
dessa ação é a redução de acúmulo de lipídios no fígado e no tecido adiposo de ratos
que consumiram chá verde. (WANG et al., 2016) Outro potencial benéfico do chá
verde se mostra na perda de peso e na melhora da tolerância à glicose mesmo em
ratos que consumiram dietas altamente gordurosas. (SNOUSSI et al., 2014) Uma
das explicações para esse efeito está na capacidade que os componentes do chá
verde têm de inibir a proliferação e estimular apoptose das células do tecido adiposo.
(MONTEIRO et al., 2008) Além disso, o efeito antioxidante dos componentes do chá
verde já se mostrou capaz não só de reduzir o colesterol e lipídios séricos, como
também de diminuir a oxidação desses lipídios. (ROSENBLAT et al., 2008;
 29

KISHIMOTO, TANI & KONDO, 2013). Como já se tem estabelecida a relação de

componentes da síndrome metabólica (obesidade, hipertensão, dislipidemia,
comprometimento regulação da glicose e resistência à insulina) a baixos níveis
séricos de testosterona em homens, CV pode auxiliar nesse aspecto na redução de
desenvolvimento de HPB (NIESHLAG, et.al., 2008).

Gráfico 1 - Percentuais de nutrientes no chá verde

Polifenóis 35%
Proteínas 14%
Minerais 10%
Cafeína 5%
Clorofila 3%
Lignina 3%
Aminoácidos 3%
Ácidos orgânicos 3%
Outros 21%

Legenda: O conteúdo do gráfico foi adaptado de Sang et. al. (2011).

2.4 BIOMARCADORES INFLAMATÓRIOS

A HPB e o câncer de próstata provocam respostas inflamatórias locais e
sistêmicas no individuo (ZHOU et al., 2018; RASHIBI, 2017). Sendo assim, os
marcadores da inflamação são alvos potenciais para a avaliação tanto dos efeitos de
agentes pró-inflamatórios quanto de anti-inflamatórios (presentes no CV) sobre a
próstata. Nesse estudo avaliaremos os efeitos da indução e das dietas sobre os
níveis séricos do Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) - que é uma citocina pró-
inflamatória e do Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF) – um dos fatores
responsáveis pela angiogênese (Quadro 1).
 30

Quadro 1 - Painel de citocinas produzidas na resposta inflamatória que foram

utilizados como biomarcadores no estudo, suas características e funções básicas.
Nome Categoria Sigla Fonte Funções
Ativa
macrófagos;
Fator de Macrófagos,
Citocina pró- regula outras
Necrose TNF-α mastócitos e
infamatória citocinas;
Tumoral linfócitos T
múltiplas
funções.
Aumenta a
permeabilidade
vascular;
Fator de Proteína mitogênico
Células
Cresciment hemodimérica VEGF- para
mesenquimais
o Vascular Isoforma A A Células
(vários)
Endotelial endoteliais;
angiogênese
Regulação da
inflamação
Fonte: Adaptado de Alberts e colaboradores (2009) e Robbins e colaboradores (2014)

2.4.1 Fator de Necrose Tumoral – TNF-α

O TNF-α é uma citocina com ação autócrina, parácrina e endócrina. (RUAN &
LODISH, 2003) Age no adipócito, desempenhando um papel regulador no acúmulo
de gordura corporal, pela inibição da lipogênese, bem como com o aumento da
lipólise. (ARNER, 1995; MONTAGUE et al., 1998; VOLP et al., 2008) Por causa de
sua atividade biológica pleiotrópica, esta citocina está envolvida no processo de
inflamação, estimulando a síntese de outras citocinas. (FRANCISCO, HERNÁNDEZ
& SIMÓ, 2006) Por este fator, o TNF-α é classificado como uma citocina “pró-
inflamatória”. (COUFFINHAL et al., 1997) O aumento de TNF- α, está associado a
rápida e grave evolução de doenças de diferentes sistemas. A HPB provoca um
ambiente inflamatório local que pode levar a um aumento de citocinas pró-
 31

inflamatórias. Esse aumento foi observado em alguns espécimes com HPB quando
comparados aos grupos controles (ZHOU et al., 2018).

2.4.2 Fator De Crescimento Vascular Endotelial – VEGF

O endotélio, interagindo com as células circulantes presentes na parede
vascular e sobre as paredes de células de músculo liso, desempenha um papel
essencial no controle da permeabilidade celular, tônus vascular, coagulação do
sangue, fluxo sanguíneo e angiogênese. (VERMA, BUCHANAN & ANDERSON,
2003; BALAKUMAR, KAUR & SINGH, 2008) . Em processos inflamatórios, há uma
produção constante de indutores de angiogênese, como o VEGF (RASHIBI, 2017).
O VEGF, tem sido extensivamente estudado e tem demonstrado desempenhar um
papel importante na angiogênese da próstata (LING, 2005).
Os VEGFs constituem uma família de proteínas homodiméricas que
incluem VEGF-A (referida sempre como VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e PIGF
(fator de crescimento placentário). O VEGF é um potente mitógeno, capaz de
estimular a migração celular, angiogênese e a permeabilidade microvascular.
(ALBERTS et al., 2009) Essa citocina é responsável por induzir a formação de vasos
sanguíneos no início do desenvolvimento (vasculogênese) e exerce um papel central
no crescimento de novos vasos sanguíneos (angiogênese) em adultos. Por esse fator
também, a avaliação de suas concentrações plasmáticas pode auxiliar a avaliação
da gravidade de neoplasias. Esse fator de crescimento é produzido por todas as
células de origem mesenquimal. O VEGF promove a angiogênese também na
inflamação crônica, nos tumores e para a cura de feridas. Por suas implicações na
inflamação, o VEGF é considerado também uma adipocina. A concentração sérica
de VEGF aumentada já foi correlacionada positivamente com o aumento da massa
de gordura visceral, sobretudo o VEGF secretado por adipócitos de indivíduos em
situação de obesidade. (BERGER & DANNENBERG, 2013)
Os membros da família VEGF sinalizam através de três receptores
tirosina-cinases: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Foi mostrado que o receptor
VEGFR-1 atua facilitando a mobilização de células-tronco endoteliais e exerce um
papel na inflamação. O VEGFR-2 exerce uma função importante na angiogênese e
o VEGFR-3 está ligado à linfoangiogênese (produção de vasos linfáticos). (ROBBINS
& COTRAN, 2014)
 32

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar os efeitos das dietas experimentais à base de chá verde sobre a
morfologia da próstata de ratos submetidos à estimulação androgênica prolongada
com doses suprafisiológicas de testosterona.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Os objetivos específicos deste estudo são:
• Avaliar a morfologia da próstata pela mensuração da área alveolar e da altura
e área total epitelial prostática;
• Avaliar através da imunohistoquímica o índice de proliferação do fator de
crescimento vascular endotelial (VEGF);
• Comparar os resultados obtidos nos testes laboratoriais nos animais
suplementados e alimentados com o CV, com os resultados obtidos dos animais
utilizados como controle submetendo os dados aos testes estatísticos.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

4.1.1 Fases do estudo
O uso das amostras de tecido dos animais foi submetido ao Comitê de Ética no
Uso de Animais (CEUA-UFF), tendo sido aprovado sob o número 765/2016. O
experimento já foi realizado, tendo sido parte da tese de Doutorado da aluna Vivian
Alves Pereira da Silva no PPG de Patologia do HUAP-UFF (enfoque no sistema
cardiovascular). Nesse estudo, foram processadas e avaliadas as amostras das
próstatas, que não foram analisadas anteriormente.
 33

4.1.2 Distribuição dos grupos

Ao todo, fora, utilizados materiais provenientes de 28 ratos Wistar já coletados
e armazenados no laboratório. No Quadro 2 é possível visualizar um resumo da
distribuição desses grupos, de maneira esquematizada. Os animais em estudo foram
subdivididos em quatro grupos de sete animais cada, dispostos da seguinte maneira:
• Grupo Controle (GCA) - animais alimentados com ração controle e
hidratados com água;
• Grupo Chá verde (GCCV) - animais alimentados com ração controle e
hidratados com chá verde;
• Grupo Induzido (GIA) – animais com aumento de testosterona induzido
(induzidos), alimentados com ração controle e hidratados com água;
• Grupo Induzido Chá verde (GICV) - animais induzidos, alimentados com
ração controle e hidratados com chá verde;

Quadro 2 – Grupos experimentais do estudo.

Hidratação Grupo Controle Grupo Induzido
(SEM indução com (COM indução com
testosterona) testosterona)
Água GCA GIA
Ração controle Ração controle

Chá Verde GCCV GICV

Ração controle Ração controle

Foram estudadas as próstatas de ratos machos adultos jovens (42-50 dias)

que foram acondicionados em gaiolas plásticas individuais, com ciclo constante de
12 horas de luz e 12 horas de escuro, em temperatura de 22 ± 1ºC, no biotério do
Departamento de Morfologia da Universidade Federal Fluminense. Os animais
receberam ração e água ou chá verde à vontade, e foram monitorados
semanalmente o peso corporal, o consumo de ração e o consumo hídrico de todos
os animais.
 34

4.2 INDUÇÃO
A indução com testosterona foi realizada através da introdução de implantes
de silicone de 5cm (Silastic® Cat.No 508-009 - Dow Corning) preenchidos com
propionato de testosterona (1mg). O procedimento obedece ao seguinte protocolo:
Anestesiar os animais utilizando 75mg/kg de xilazina (2%) e 10mg/kg de ketamina
(10%), via intraperitoneal. Após a constatação do plano anestésico através da
ausência do reflexo podal, realizar a tricotomia na região dorso escapular do animal
e fazer a antissepsia do local com álcool 70%. Posicionar o animal em decúbito
ventral e realizar uma pequena incisão (de aproximadamente 10 mm) com um bisturi.
(ABBOUD, 2015)
Figura 6 - Preparo e inserção cirúrgica do implante de silicone preenchido com
propionato de testosterona

1 2

3 4

Legenda: 1 – Preenchimento do implante de silicone; 2 – Delimitação da área dorso-escapular do rato

Wistar após a tricotomia; 3 – Incisão de 10mm na região dorso-escapular para inserção do implante;
4 – Inserção do implante; 5 – União das bordas da incisão cirúrgica, utilizando adesivo cirurgico à
base de cianoacrilato. Fonte: Abboud, 2015 – LaBCEx.
 35

Com o auxílio da ponta de uma pinça hemostática, divulsionar o tecido e

introduzir o implante de silicone no espaço subcutâneo. Para a síntese de pele,
utilizar um adesivo cirúrgico à base 20 de cianoacrilato. O procedimento cirúrgico é
considerado minimamente invasivo, por isso, o protocolo anestésico utilizado é de
curta duração, com pronta recuperação do animal. Durante este período de
recuperação pós cirurgia, os animais são deixados em repouso ao abrigo da luz, em
suas gaiolas individuais. É feita hidratação ocular com solução fisiológica, sob
orientação do médico veterinário, responsável técnico do biotério experimental. A
cada 3 semanas o procedimento deve ser repetido, para troca do implante, até o fim
do período de experimento (HSU et al., 2011; RIBEIRO et al., 2016). O tempo de
exposição proposto neste trabalho permite avaliar efeitos em longo prazo (acima de
12 semanas) e é o indicado para que a exposição ao hormônio não cause neoplasias
(e seus efeitos celulares) que começam a surgir a partir de 20 semanas. (KESSLER
et al., 1998). O processo de colocação dos implantes pode ser observado na figura
6.

4.3 PESO E CONSUMO

Para determinar a curva de peso dos animais, o peso de todos os animais foi
avaliado no início do estudo, e posteriormente a cada semana, em balança digital,
marca Gehaka, com capacidade de 3 Kg e precisão de 0,05 g. Para a análise do
consumo hídrico e da ração, foi realizado o controle três vezes por semana.
Contabilizaram-se a oferta e o resto de ração de cada animal a fim de determinar o
perfil alimentar. Semelhantemente, foi avaliado o consumo hídrico, contabilizando
oferta e resto de água ou chá, medidos em uma proveta graduada com capacidade
para 500 mL.

4.4 PREPARO DAS RAÇÕES PADRÃO

As rações balanceadas à base de caseína foram fornecidas pelo Laboratório
de Nutrição Experimental (LabNE) da UFF. As rações experimentais preparadas no
LAbNE são isocalóricas e adicionadas de misturas de vitaminas e minerais segundo
as normas do Committee on Laboratory Animal Diets, 1979, modificadas segundo as
recomendações do American Institute of Nutrition (AIN)-93, garantindo que cada
 36

nutriente exerça suas funções específicas durante o período experimental.

(REEVES, NIELSEN & FAHEY JR, 1993) (Quadro 1).
Os ingredientes das rações experimentais foram pesados e homogeneizados
em batedeira industrial Hobart® (São Paulo, SP, Brasil), com água fervente para
gelatinização do amido. A massa obtida foi transformada em pellets e seca em estufa
ventilada (Fabbe-Primar® n°171, São Paulo, SP, Brasil) a 60°C por 24h e, após
identificação, armazenada sob refrigeração até o uso.

Quadro 3 - Balanceamento de nutrientes nas rações utilizadas no estudo (g/100g).

Nutrientes g/100g
Caseína 14,00
Amido 58,95
Açúcar 10,00
Minerais 3,50
Vitaminas 1,00
Óleo de soja 7,00
Celulose 5,00
Colina 0,25
Cistina 0,30
Tert-Burt
0,0014
Hidroquinona

4.5 PREPARO DO CHÁ VERDE

O protocolo de preparo do chá foi baseado na metodologia utilizada na
literatura consultada e na concentração em que o produto é consumido usualmente.
O chá foi preparado através da infusão das folhas de Camellia sinensis
(Yamamotoyama-Midori nº262, São Miguel Arcanjo, SP, Brasil) a uma concentração
de 2%, calculada por peso/volume (ORNER, DASHWOOD & DASHWOOD, 2004).
Para tanto, foram utilizadas 20g de folhas, pesadas em balança digital previamente
tarada, para cada 1000ml de água. Nesse protocolo as folhas são deixadas em
infusão por dois minutos e o chá é então filtrado e resfriado imediatamente. Os
 37

animais dos grupos chá verde tiveram sua hidratação exclusivamente através do chá,
e a oferta foi de 200ml ao dia.

4.6 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

Para o processamento, seguiu-se o seguinte protocolo: Após 20 semanas de
experimento, os ratos eutanasiados com uma dose letal de tiopental sódico a 5%,
intraperitoneal, (Tiopental sódico 1G, Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos
LTDA, Brasil; 0,15 ml/100g p.c., i.p.) foram submetidos a retirada da próstata ventral,
tecido de interesse para o estudo. Estes fragmentos foram então fixados em
formalina tamponada a 10%. O material foi processado e destinado à análise
histomorfométrica segundo a rotina para inclusão em parafina seguindo a técnica
utilizada no Laboratório de Biomorfologia Celular e Extracelular, Departamento de
Morfologia/ Instituto Biomédico da UFF. Obtivemos através de microtomia os cortes
de 5 μm de espessura para posterior coloração por métodos histológicos e marcação
por métodos imuno-histoquímicos.

4.7 BIOQUÍMICA, SOROLOGIA E PERFIL HEMATOLÓGICO

Após as 20 semanas de experimento, antes da eutanásia dos animais que já
estavam sobre anestesia geral, foi realizada a punção cardíaca para coleta do
sangue. Logo em seguida os ratos seguiram para a eutanásia.

4.7.1 Perfil hematológico

O sangue armazenado em tubo com anticoagulante EDTA foi enviado
imediatamente para avaliação do hemograma. Para realização do mesmo, foi
utilizado o método do teste automatizado por troca de impedância, para contagem
de leucócitos, plaquetas, hemácias, basófilos e hematócrito. Já para a análise da
hemoglobina o princípio do teste utilizado foi o da espectrofotometria. Para a análise
dos percentuais dos tipos individuais de leucócitos, foi utilizado também o método de
troca de impedância e dispersão de luz.
Para a realização do processamento, foi adotado o seguinte protocolo: antes
da coleta foi respeitado um jejum de 4 horas. A análise automatizada foi realizada
imediatamente após a coleta, portanto não houve riscos de resultados inconsistentes
devido a problemas de armazenamento. Para análises de hematológicas foram
 38

coletados de cada animal 3ml de sangue total com EDTA (para a análise quantitativa
automatizada) e foi feito um esfregaço sanguíneo (para a análise qualitativa); foram
rejeitadas para a análise amostras com sinais de hemólise ou com coágulos/fibrinas.
Após prévia homogeneização do sangue, o número de identificação do indivíduo
testado foi inserido no equipamento e iniciou-se o processamento da amostra. O
equipamento utilizou 110μl da amostra, e a temperatura do teste variou entre 16 a
32°C. A análise quantitativa foi realizada por meio de diferentes métodos de
avaliação de alta tecnologia combinados para uma maior precisão. No momento da
coleta, também foram realizados esfregaços sanguíneos que foram corados pelos
métodos de coloração segundo Romanowsky (Giemsa e Wright) que são usuais da
hematologia. A análise qualitativa pela avaliação do esfregaço corado foi feita
utilizando microscópio óptico (microscopia de luz), e esses resultados foram
comparados aos resultados obtidos pela avaliação automatizada. Todo o conjunto
do hemograma foi avaliado em parceria com o médico veterinário participante do
grupo de estudo, para aumentar a acurácia dos resultados. O cálculo dos resultados
foi impresso de acordo com as configurações do equipamento.
4.7.2 Bioquímica
O sangue coletado em tubo sem anticoagulante foi mantido em repouso por
cerca de duas horas à temperatura ambiente para retração do coágulo. Após esse
período, foi centrifugado a 958,5 G durante cinco minutos para a obtenção do soro,
e armazenado a -20ºC. As análises bioquímicas (de albumina, proteínas totais,
colesterol, triglicerídeos, LDL [lipoproteína de baixa densidade] e HDL [lipoproteína
de alta densidade] e enzimas hepáticas) foram realizadas mediante a utilização de
kits colorimétricos da LabTest (LabMax, Belo Horizonte, Brasil). A dosagem da
testosterona sérica foi realizada através do método de radioimunoensaio (RIE),
usando kit comercial, em estado sólido, da Beckman Coulter (Immunotech®). Os
exames foram realizados no laboratório do Instituto Brasileiro de Diagnóstico e
Especialidades Veterinárias (PROVET/São Paulo, Brasil), usando o equipamento
WIZARD2, da Perkin Elmer (RIA).
4.7.3 Sorologia
A avaliação de marcadores sorológicos foi também realizada a partir do
sangue armazenado em tubo sem anticoagulante, utilizando-se o soro obtido pela
centrifugação. Foram realizados os marcadores TNF-alfa e VEGF, através do método
 39

imunológico, por meio de leitura de microesferas marcadas com anticorpo específico,

no citômetro de fluxo. Foi utilizado o painel Milliplex Map Rat Cardiovascular Disease
Panel 1(RCVD1-89K-02), da Millipore, no aparelho Luminex™ 200. A análise foi
realizada utilizando o programa System Software xPonent/Analyst versão 4.2. Essas
análises foram realizadas no Laboratório Especializado em Análises Científicas
(LEAC, SP, Brasil).

4.8 COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS

4.8.1 Hematoxilina-eosina
Foi realizada a técnica de coloração pela hematoxilina eosina, para avaliação
da integridade dos espécimes e para a avaliação da morfologia através da análise
microscópica. As lâminas coradas pelas colorações de rotina foram utilizadas para a
avaliação da morfologia da próstata. Sendo assim, a partir dessa coloração foram
avaliadas a média da altura epitelial, a média da área alveolar, a área alveolar total
e a área epitelial total. Os tons da coloração podem variar de rosa claro à roxo. Os
núcleos ficam corados em roxo e o citoplasma, em rosa-claro. Há diferentes formas
comerciais usadas para a eosina, mas a mais comum é a eosina amarelada
(BANCROFT & COOK, 1994). Protocolo de coloração descrito detalhadamente em
anexo 2.
4.8.2 Picro Sirius Red
A maioria dos corantes que permitem a visualização de colágenos oferecem
poucas informações sobre a natureza química dos componentes do tecido. Essa
técnica mostra a birrefringência sugestiva dos tipos I (birrefringência vermelho
alaranjada) e III (birrefringência verde) de colágeno. A análise qualitativa e da
integridade do colágeno foi feita através da coloração pelo Picro Sirius Red, com
observação sob luz polarizada. As lâminas foram coradas por 30 min com Sirius red
(0,1% de Sirius red em ácido clorídrico) para coloração de feixe de colágeno.
(JUNQUEIRA, BIGNOLAS & BRENTANI, 1979). Protocolo de coloração descrito
detalhadamente em anexo 3.
 40

4.9 IMUNOHISTOQUÍMICA
Foi utilizado o Anticorpo Monoclonal Mouse Anti – human Vascular Endothelial
Growth Factor (VEGF) – Clone VG1 pronto para uso, marca DAKO M7273, juntamente
com o kit TrilogyTM. Os cortes histológicos foram obtidos em micrótomo manual Leica
RM2125 com espessura de 4 μm e coletados em lâminas sinalizadas. Após secagem
em estufa a 60°C por 60 minutos, as lâminas foram submetidas ao processo
automatizado de desparafinização, hidratação e recuperação antigênica. A
recuperação antigênica foi realizada com o kit Trilogy em panela de pressão elétrica
por 15 minutos e posteriormente lavada com tampão PBS (Phosphate Buffered
Saline). O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com água oxigenada 10%,
as seções então foram enxaguadas em água destilada em 3 banhos por 2 minutos
cada e lavadas com PBS. Em seguida, os cortes foram contornados por uma caneta
hidrofóbica Dako e aplicado o Anticorpo anti VEGF incubado overnight e lavado em
tampão fosfato PBS. Em seguida as lâminas foram incubadas com o polímero
específico para VEGF 30 minutos em temperatura ambiente. A revelação da coloração
foi revelada com DAB incubados por 5 minutos em temperatura ambiente. Por fim foi
realizado uma contra-coloração com hematoxilina para visualização de demais
estruturas do tecido. Para todos os anticorpos primários utilizados foram realizados
simultaneamente, controles negativos, onde o anticorpo primário será substituído por
PBS e controles positivos, usando fragmentos de tecido que apresentam os antígenos
pesquisados, conforme prévia descrição literária (de DE AMORIM RIBEIRO et al.,
2017).

4.10 ANÁLISE MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA

4.10.1 Análise histomorfométrica da próstata
As imagens para análise da morfologia e quantificação dos parâmetros
histomorfométricos da próstata dos animais estudados foram obtidas em microscópio
óptico Olympus BX-51 acoplado a uma câmera de vídeo Olympus DP-72, sendo a
imagem dos campos microscópicos transferida para um monitor LG Flatron W1752T.
Para tais análises foram utilizadas imagens captadas a partir de cortes corados pela
hematoxilina – eosina.
 41

4.10.1.1 Altura de epitélio

As imagens para análise e quantificação da altura epitelial da próstata dos
ratos estudados foram obtidas de uma lente objetiva de 40 vezes. Para cada animal,
cinco cortes foram analisados em pontos diferentes, totalizando 10 campos em cada
corte. Em cada campo foram realizadas 3 aferições da altura epitelial. As imagens
foram digitalizadas para a mensuração de espessura do epitélio da próstata
utilizando o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
Essas aferições foram realizadas a partir da calibração do programa em micrômetro
(µm) (Figura 7)

Figura 7: – Imagem digital da lâmina da próstata em HE.

Legenda: Mensuração da altura epitelial no aumento de 400 vezes realizada no programa Image J.

4.10.1.2 Área epitelial

Para a captura da área total da próstata dos animais em estudo, as imagens
foram captadas em um microscópio estereoscópico que possibilitou a captura de toda
a área do corte, facilitando os procedimentos de morfometria. As imagens captadas
foram binarizadas para evidenciar o epitélio dos alvéolos prostáticos em preto. A
medida da área do epitélio foi obtida com o auxílio do software Image J, já calibrado
para o tamanho dos componentes do tecido epitelial a partir de uma régua
fotografada no mesmo aumento (Figura 8).
 42

Figura 8: – Imagem digital da lâmina da próstata inteira binarizada.

Legenda: Imagem binarizada da captura de todo o corte da próstata para análise de partículas e
obtenção da área epitelial no programa Image J.

4.10.1.3 Área alveolar individual e total das próstatas

As imagens foram captadas no aumento de 40x, sendo captadas campos o
suficiente para totalizar o corte inteiro da próstata. Os alvéolos que apareciam em
mais de um campo eram contabilizados em apenas um deles e excluídos da aferição
no novo campo. As imagens captadas foram binarizadas para evidenciar a área da
luz alveolar em branco. Essas imagens foram analisadas utilizando software Image
J, através de uma ferramenta de seleção automática de área, que possibilitará medir
individualmente cada alvéolo chamada magic wand (Figura 9). A área média
individual luminal foi obtida pela soma da área de cada alvéolo dividido pelo número
total de alvéolos de cada próstata. A área luminal total dos alvéolos prostáticos será
obtida através do somatório das áreas individuais. Para a captura da área total da
próstata dos animais em estudo, as imagens foram captadas em um microscópio
estereoscópico que possibilitou a captura de toda a área do corte, facilitando os
procedimentos de morfometria.
 43

Figura 9: – Imagem digital da lâmina da próstata binarizada da objetiva 4x.

Legenda: Imagem binarizada de um fragmento da próstata no aumento de 40 vezes para a

mensuração dos alvéolos prostáticos com a ferramenta magic wand no programa Image J.

4.11 ANÁLISE QUANTITATIVA IMUNOHISTOQUIMICA

As imagens para análise quantitativa da porcentagem da marcação específica
anti VEGF da próstata dos animais estudados foram obtidas em microscópio óptico
Olympus BX-51 acoplado a uma câmera de vídeo Olympus DP-72, sendo a imagem
dos campos microscópicos transferida para um monitor LG Flatron W1752T. As
imagens foram obtidas após o processamento imunohistoquímico com Anticorpo anti
VEGF e contra coloração com hematoxilina. Foram capturadas 25 fotomicrografias
de cada animal dos 4 grupos estudados em um aumento de 400x. As imagens foram
tratadas para que apenas o epitélio prostático fosse evidenciado e em seguidas
foram analisadas individualmente utilizando a plug-in Color Segmentation do
software Image J. Sendo assim, a porcentagem de coloração das marcações
amarronzadas (marcação anti VEGF) foram fornecidas pelo software em relação a
imagem total do campo (figura 10). Em seguida a área em branco foi excluída e uma
nova porcentagem em cima da área epitelial total da imagem foi realizada, sendo
fornecido no final um valor em porcentagem da quantidade de marcação presente no
citoplasma epitelial prostático de cada animal.
 44

Figura 10: – Imagem digital da lâmina marcada com anticorpo anti VEGF da próstata
da objetiva 40x.

Legenda: Imagem de um dos campos das lâminas de próstata submetidas à imunohistoquímica no

aumento de 400 vezes para quantificação de marcações amarronzadas com o plug-in color
segmentation no programa Image J.

4.12 ANÁLISE QUALITATIVA DO COLÁGENO

As imagens das lâminas coradas à partir da coloração Picro Sirius Red
foram obtidas em microscópio óptico Olympus BX-51 acoplado a uma câmera de
vídeo Olympus DP-72, sendo as imagens dos campos microscópicos transferida para
um monitor LG Flatron W1752T. Sobre uma objetiva de 20x vezes foram capturadas
imagens sem a polarização e com polarização para análise do tipo de biorrefringência
predominante de cada grupo estudado. Sendo então realizada uma análise
qualitativa das fibras colágenas presentes na próstata.

4.13. ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os dados foram apresentados sob a forma de média e desvio padrão. A
distribuição normal dos valores encontrados foi avaliada através do teste de
Kolmogorov-Smirnov. Para o presente estudo foi utilizado o Teste ANOVA univariada
associado ao teste de múltiplas comparações de Tukey-Kramer.
 45

5. RESULTADOS

5.1 PESO E CONSUMO

A massa corpórea dos animais estudados evoluiu conforme representado no
Gráfico 2. A média de peso dos animais no início do experimento era de 260±10g.
Os animais dos grupos controlem e controle chá mostraram evolução semelhante.
Os animais induzidos apresentaram uma sutil redução da massa corpórea após cada
indução, mas a cada ciclo mantinham o ganho de peso. Mesmo com a indução, os
animais do GICV apresentaram menor variação de peso. Ao final do experimento
todos os animais apresentaram valores de massa corpórea semelhantes.

Gráfico 2– Evolução de massa corpórea dos animais em estudo Evolução de massa

corpórea dos animais.

Evolução de massa corpórea dos animais

600
GCA
GIA
GCCV
GICV
Massa corpórea (g)

400

200

0
0 5 10 15 20 25
Semanas

O consumo de ração foi semelhante em todos os grupos, aumentando ao

longo do experimento. É possível visualizar o consumo das rações ofertadas aos
animais no gráfico 3, onde observamos a média do consumo por grupo a cada 5
semanas.
O consumo hídrico e de chá verde se manteve semelhante para todos os
grupos durante o curso do experimento, com pouca variação a cada semana. O
grupo controle apresentou maior consumo de líquidos no início e no final do
experimento, mas essa diferença foi significativa apenas quando comparamos a
GICV na última semana. É possível visualizar no Gráfico 4 as médias do consumo
hídrico a cada 5 semanas.
 46

Gráfico 3– Consumo de ração pelos animais dos grupos experimentais ao longo do

experimento.

Consumo de ração
80
Consumo de ração (g)

60
GCA
GIA
40 GCCV
GICV

20

0
0 5 10 15 20 25
Semanas

Gráfico 4– Consumo hídrico ao longo do período do experimento.

Consumo hídrico
150
Consumo de líquidos (ml)

100

GCA
GIA
GCCV
50
GICV

0
0 5 10 15 20 25
Semanas
 47

5.2 PERFIL HEMATOLÓGICO

Os resultados do perfil hematológico foram expressos resumidamente na
tabela 2 demonstrando a média e desvio padrão de cada parâmetro em cada grupo
estudado. Os parâmetros avaliados nesse perfil incluem:
1. Hemácias: hematócrito (HTC), hemoglobina (HB), índice de anisocitose
(RDW), volume corpuscular médio (V.C.M) e a concentração de hemoglobina
corpuscular média (C.H.C.M);
2. Leucócitos: contagem de leucócitos (LG) e proporção de linfócitos (LINF),
monócitos (MON) e segmentados (SEG);
3. Plaquetas: contagem de plaquetas (PLT).
Em relação ao hematócrito, os grupos não sofreram alterações
estatisticamente relevantes, contudo os outros parâmetros sofreram algumas
diferenciações entre si. A contagem total de hemoglobina foi estável em todos os
grupos exceto no GICV, o qual apresentou uma concentração menor. O índice de
anisocitose (RDW), aferido pelo sistema automatizado, se mostrou 13,5% menor no
grupo controle, enquanto nos demais grupos se mostraram estatisticamente iguais.
O V.C.M se mostrou 14% menor no GIA em relação ao controle, enquanto nos grupos
que receberam a dieta de chá verde eles se mostraram com essa diferença mais
reduzida, sendo 6,6% menor. Já o C.H.C.M se apresentou 7,5% menor nesses
grupos que receberam a dieta com chá verde.
A contagem de leucócitos foi significativamente mais alta no GIA, em relação
aos demais grupos. Observamos que nesse grupo o aumento na leucometria global
se deu predominantemente pelo aumento linfocitário enquanto os segmentados
sofreram uma queda em comparação aos outros grupos. Além disso, os animais que
receberam a dieta com chá verde sofreram aumento da população de segmentados,
porém não o suficientemente para causar um aumento significativo na leucometria
global. Já os monócitos se apresentaram estatisticamente iguais nos grupos, exceto
no GCCV o qual se mostrou um pouco menor. Não houve alteração significativa na
contagem de plaquetas entre nenhum grupo de animais.
 48

Tabela 1 - Perfil hematológico dos grupos de ratos avaliados.

Grupo Grupo
Grupo Grupo
Controle Induzido Valor P
Parâmetros Controle Induzido
Chá Verde Chá Verde (<0,05)
(GCA) (GIA)
(GCCV) (GICV)
42,27 ± 41,91 ± 44,00 ± 41,30 ±
HTC (%) 0.2339
1,93 1,83 3,35 2,08
14,74 ± 14,35 ± 14,06 ± 13,33 ±
HB (g/dL) 0,0121
0,63 a 0,57 a 0,90 a 0,61 b
13,58 ± 15,72 ± 15,78 ± 15,65
R.D.W (%) 0,0001
0,72 a 0,48 b 0,64 b ±0,40 b
55,39 ± 47,62 ± 51,56 ± 51,82 ±
V.C.M (fL) 0,0001
0,50 a 2,39 b 0,60 c 1,03 c
34,90 ± 34,42 ± 32,17 ± 32,37 ±
C.H.C.M (%) 0,001
0,37 a 0,78 a 0,55 b 0,60 b
LG (x 10³ 3,57 ± 6,80 ± 3,97 ± 3,71 ±
0,003
/mm³) 1,43 a 1,51 b 0,90 a 1,64 a
35,29 ± 17,20 ± 50,16 ± 51,85 ±
SEG (%) 0,001
9,45 a 6,06 b 6,18 c 5,08 c
58,65 ± 80,20 ± 48,67 ± 47,00 ±
LINF (%) 0,001
10,00 a 4,55 b 6,98 a 4,83 a
3,70 ± 2,40 ± 0,50 ± 1,00 ±
MON (%) 0,021
2,50 a 2,08 a 0,55 b 0,82 a
PLT (x 731,14 ± 593,00 ± 530,57 ± 563,00 ±
0,083
10³/mm³) 147,06 89,08 62,83 131,37
Legenda: As letras a, b e c representam as diferenças significativas entre os grupos. Foi utilizado o
teste ANOVA univariado associado ao teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. A
significância em todos os testes foi estabelecida ao nível de p < 0,05. Siglas: HT –hematócrito; HB –
hemoglobina; RDW –índice de anisocitose das hemácias; V.C.M –Volume corpuscular médio,
C.H.C.M- concentração de hemoglobina corpuscular média LG – contagem de leucócitos; LINF –
percentual de Linfócitos; MON – percentual de Monócitos; SEG – percentual de segmentados
(Neutrófilos); PLT – contagem de plaquetas.
 49

5.3 PERFIL LIPÍDICO

Foram avaliados os triglicerídeos totais, colesterol total suas frações (HDL –
High Density Lipoprotein, LDL - Low Density Lipoprotein e VLDL- Very Low Density
Lipoprotein). Os resultados para esses parâmetros estão resumidos na tabela 2, em
forma de média e desvio padrão.
Tabela 2 - Perfil lipídico dos grupos de ratos avaliados.

Grupo Grupo Grupo Grupo

Valor P
PARÂMETROS Controle Induzido Controle Chá Induzido Chá
(<0,05)
(GCA) (GIA) Verde (GCCV) Verde (GICV)
Colesterol Total 55,51 ± 60,84 ± 37,42 ± 12,00 33,50 ± 5,85
0,0002
(mg/dL) 15,97 a 13,92 a b b
4,47 ± 3,57 21,9 ± 8,84 5,23 ± 1,11
LDL (mg/dL) 8,31 ± 7,36 a 0,0001
a b a
21,53 ± 26,72 ± 5,42 17,14 ± 4,70 16,83 ± 5,00
HDL (mg/dL) 0,0001
3,21 a b a a
23,28 ± 33,97 ± 6,92 11,43 ± 4,60
VLDL (mg/dL) 11,97 ± 4,80 c 0,0001
5,78 a b c
Triglicerídeos 129,29 ± 121,31 ± 57,17 ± 23,04 59,85 ±
0,0001
(mg/dL) 33,43 a 39,62 a b 24,05 b
Legenda: As letras a, b e c representam as diferenças significativas entre os grupos. Foi utilizado o
teste ANOVA univariado associado ao teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. A
significância em todos os testes foi estabelecida ao nível de p < 0,05. Siglas: HDL – High Density
Lipoprotein; LDL - Low Density Lipoprotein; VLDL- Very Low Density Lipoprotein.

O colesterol total sofreu uma diminuição significativa nos animais que

receberam a dieta com CV. Em relação ao LDL e HDL, apenas o GIA apresentou um
aumento bastante significativo, enquanto os outros grupos se mantiveram em uma
faixa semelhante. No VLDL o GIA continuou com esse comportamento de aumento
significativo, contudo os grupos que receberam a dieta com chá verde demonstraram
uma diminuição desses parâmetros, tendo uma redução de quase 50% em
comparação ao grupo controle. Observou-se também nesses grupos da dieta com
chá uma diminuição bastante significativa da mensuração de triglicerídeos, tendo
diminuído mais que 50% em comparação ao grupo controle.
 50

5.4. ENZIMAS HEPÁTICAS E PERFIL PROTEICO

As enzimas hepáticas mesuradas foram a ALT/ TGP (Alanina
Aminotransferase) e AST/TGO (Asparato Aminotransferase), que foram expressas
na forma de média e desvio padrão na tabela 3. O perfil proteico foi realizado à partir
da mensuração da proteínas totais, albumina e globulina, que também foram
expressas na forma de média e desvio padrão na tabela 3.
A enzima ALT se mostrou significativamente aumentada no GIA, enquanto nos
GCCV e GICV ela sofreu uma redução de quase 25% quando comparada ao
controle. Já a AST não sofreu grandes alteração em relação aos grupos, tendo
diminuído um pouco apenas no GICV.
Em relação ao perfil proteico dos animais, se observou que a mensuração de
proteínas totais e globulinas se mantiveram estatisticamente iguais em todos os
grupos. Já a albumina sofreu uma pequena redução nos grupos que receberam CV.

Tabela 3 - Enzimas hepáticas e perfil proteico dos grupos de ratos avaliados.

Grupo Grupo Grupo Controle Grupo

Valor P
PARÂMETROS Controle Induzido Chá Verde Induzido Chá
(<0,05)
(GCA) (GIA) (GCCV) Verde (GICV)
15,19 ± 18,33 ± 10,23 ± 1,96
ALT/ TGP (U/L) 10,25 ± 1,93 c 0,0001
2,19 a 2,16 b c
AST/ TGO 47,30 ± 53,33 ± 33,20 ± 8,40
45,57 ± 8,73 a 0,009
(U/L) 10,82 a 4,84 a b
Proteínas 6,33 ± 5,91 ±
6,24 ± 1,05 5,26 ± 0,88 0,106
Totais (g/dL) 0,85 0,41
Albumina 2,93 ± 2,97 ±
2,31 ± 0,34 b 2,32 ± 0,31 b 0,0003
(g/dL) 0,31 a 0,23 a
Globulinas 3,39 ± 2,94 ±
3,70 ± 0,90 2,95 ± 0,64 0,090
(g/dL) 0,57 0,28
Legenda: As letras a, b e c representam as diferenças significativas entre os grupos. Foi utilizado o
teste ANOVA univariado associado ao teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. A
significância em todos os testes foi estabelecida ao nível de p < 0,05. Siglas: ALT/ TGP - Alanina
Aminotransferase; AST/TGO - Asparato Aminotransferase.
 51

5.5. TESTOSTERONA E CITOCINAS SÉRICAS

Foi possível observar que os níveis de testosterona do GIA se mantiveram
bem acima dos valores dos outros grupos. Assim, o GCA, GCCV e GICV possuindo
níveis de testosterona estatisticamente iguais, sendo possível observar esses
resultados na tabela 4. Esses valores foram observados por Silva 2019.
A citocina TNF- α também apresentou níveis maiores no GIA quando
comparada aos outros grupos estudados. Já o VEGF apresentou um comportamento
um pouco diferente dos demais. Foi possível observar que seus níveis no GIA se
mantiveram altos, porém no GICV também foi observado um aumento significativo
dessa citocina, possuindo o GIA e o GICV níveis séricos de VEGF estatisticamente
iguais. Esses valores também podem ser observados na tabela 4.

Tabela 4 - Níveis de testosterona e citocinas séricos dos grupos de ratos avaliados.

Grupo
Grupo
Grupo Grupo Induzido
Controle Valor P
PARÂMETROS Controle Induzido Chá
Chá Verde (<0,05)
(GCA) (GIA) Verde
(GCCV)
(GICV)
Testosterona 314,35 ± 680,00 ± 321,66 ± 270,14 ±
0,0002
(ng/dl) 74,199 a 134,16 b 193,59 a 155,67 a
0,0337± 0,0696 ± 0,0343 ± 0,0391±
TNF-α (pg/mL) 0,0005
0,006 a 0,028 b 0,005 a 0,006 a
1,792 ±
4,204 ± 2,846 ± 6,147 ±
VEGF (ng/mL) 0,714 a 0,0001
0,951 b 1,628 a 1,608 b

Legenda: As letras a e b representam as diferenças significativas entre os grupos. Foi utilizado o teste
ANOVA univariado associado ao teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. A significância
em todos os testes foi estabelecida ao nível de p < 0,05.
 52

5.6 MORFOMETRIA
O estudo confirmou que ocorreu aumento da altura e da área epitelial nos
animais que foram expostos ao propionato de testosterona em comparação aos outros
grupos estudados. A média da área epitelial do GIA se mostrou 81,9% maior do que
a média do GCA, além disso se observou que as médias da área epitelial do GCCV e
GICV se mostraram estatisticamente iguais à do GCA. A média da altura epitelial do
GIA se mostrou 73,8% maior do que a média do GCA, os GICV e GCCV se
comportaram da mesma maneira que na área epitelial, se mostrando estatisticamente
iguais ao GCA nesse parâmetro de avaliação (figura 11). Os resultados encontrados
nas medidas da área alveolar total e da média da área alveolar não demostraram
diferenças estatísticas no presente estudo. É possível observar esses valores
descritos na tabela 5.
Tabela 5 -Parâmetros histomorfométricos das próstatas dos grupos de ratos
avaliados.

Grupo Grupo
Grupo Grupo
Controle Induzido Valor P
PARÂMETROS Controle Induzido
Chá Verde Chá Verde (<0,05)
(GCA) (GIA)
(GCCV) (GICV)
Altura Epitelial 11,036 ± 19,180 ± 12,761 ± 13,798 ±
0,0001
(µm) 1,718 a 2,604 b 2,346 a 1,452 a
Área Epitelial 9,736 ± 17,716 ± 11,062 ± 9,372 ±
0,0007
Total (µm) 2,498 a 4,823 b 3,575 a 3,392 a
Área Alveolar 14,391 ± 13,970 ± 12,020 ± 9,989 ±
0,3736
Total (mm2) 7,506 4,262 1,556 4,484
Média da Área 0,070 ± 0,059 ± 0,053 ± 0,054 ±
0,3671
Alveolar (mm2) 0,025 0,019 0,014 0,015
Legenda: As letras a e b representam as diferenças significativas entre os grupos. Foi utilizado o teste
ANOVA univariado associado ao teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. A significância
em todos os testes foi estabelecida ao nível de p < 0,05.
 53

Figura 11 - Imagens da próstata dos grupos estudados evidenciando a altura do

epitélio prostático

Legenda: Coloração HE nos 4 grupos estudados. Barra de calibração medindo 50μm. Aumento de
400X.

5.7 ANÁLISE DE COLÁGENO

A análise qualitativa das fibras colágenas presentes em cada grupo estudado
foi realizada à partir de lâminas corada pela técnica de Picro Sirius Red sob a luz
polarizada. Essa técnica mostra a birrefringência específica dos tipos I (fibras mais
espessas, com coloração vermelho alaranjada) e III (coloração verde) de colágeno.
Pode-se observar então (Figura 12), que os grupos não sofreram grande
diferenciação referente aos tipos de birrefringência sendo elas majoritariamente do
tipo I, contudo no GIA observou-se maior birrefringência do tipo III, sugerindo
remodelamento de fibras.
 54

Figura 12- Imagens à esquerda digitalizadas sob luz polarizada de corte da próstata
em comparação com o mesmo corte não polarizado à direita.

Legenda: Coloração pelo Picro Sirius Red sob luz polarizada à esquerda e sem polarização à direita.
Barra de calibração medindo 100μm. Aumento de 200X.
 55

5.8 IMUNOHISTOQUIMICA
Foi possível observar pela análise qualitativa dos grupos estudados que o GIA
teve uma maior área de marcação específica quando comparado com os outros
grupos (figura 13). Ao se realizar a análise quantitativa desses grupos, chegou-se ao
mesmo resultado observado qualitativamente. O GIA apresentou uma porcentagem
de marcação por campo de em média 34,12%, o que se demonstrou sendo 295,7%
maior que a porcentagem observada no GCA. O GCCV e GICV se mostraram
estatisticamente iguais quando comparados com o GCA, sendo assim, a marcação
de VEGF no citoplasma do epitélio prostático demonstrou aumento significativo no
GIA havendo influência da dieta nesse parâmetro de avaliação. Esses valores podem
ser encontrados na tabela 6.

Tabela 6 – Valor em % de marcação específica de anticorpo VEGF em relação ao

epitélio das próstatas dos grupos de ratos avaliados.

Grupo
Grupo
Grupo Grupo Induzido
Controle Valor P
PARÂMETROS Controle Induzido Chá
Chá Verde (<0,05)
(GCA) (GIA) Verde
(GCCV)
(GICV)
8,624 ± 34,123 ± 11,701 ± 14,907±
VEGF (%) 0,0001
1,889 a 7,750 b 3,017 a 2,731 a
Legenda: As letras a e b representam as diferenças significativas entre os grupos. Foi utilizado o teste
ANOVA univariado associado ao teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. A significância
em todos os testes foi estabelecida ao nível de p < 0,05.
 56

Figura 13 - Imagens da análise qualitativa da marcação citoplasmática específica de

VEGF no epitélio prostático dos grupos de ratos avaliados.

Legenda: Imunohistoquimica de anticorpo primário VEGF com coloração secundaria de HE. Barra de
calibração medindo 50μm. Aumento de 400X.

6 DISCUSSÃO
Como descrito por Silva, 2019, o comportamento da testosterona no grupo
controle foi encontrado semelhante aos valores já referenciados para ratos Wistar
(MELO, 2012), sendo o seu aumento no grupo induzido relativo à uma boa indução
hormonal. Esses dados confirmam a literatura, demonstrando os efeitos
antiandrogênicos do consumo de polifenóis extraído do chá verde, seja pela
modulação do 5- enzima alfa-redutase ou outras vias (HIIPAKKA, 2002; BASU,
2013).
Além disso, é esperado que a concentração de triglicerídeos séricos, esteja
aumentada na presença de estímulo androgênico suprafisiológico, com o uso de
anabolizantes. Esse efeito pode ser visualizado em humanos, mesmo com a prática
de exercícios físicos. (VENÂNCIO et al., 2010) A administração de esteróides,
mesmo que por um curto período, produz efeitos desfavoráveis não apenas nos
 57

lipídios totais mas também nas apoliproteínas ligadas ao HDL. (HARTGENS et al.,
2004). Os valores de LDL nos grupos que receberam chá verde se mantiveram
próximos do controle. O chá verde apresenta em sua composição polifenóis e outros
agentes antioxidantes que se mostram eficazes na redução da concentração e da
oxidação LDL. (ANANDH BABU, SABITHA & SHYAMALADEVI, 2006; ROSENBLAT
et al., 2008; TINAHONES et al., 2008; ZHENG et al., 2011) Nesse estudo
encontramos aumentado o valor de LDL no grupo induzido. Uma diminuição
significativa no HDL colesterol e, por vezes, um aumento no LDL colesterol ocorrem
com o uso de esteroides anabolizantes, expondo o usuário a um risco elevado de
desenvolver doença aterosclerótica. Os níveis de colesterol HDL podem ou não voltar
ao normal quando cessa o uso do andrógeno, e essa normalização depende o tempo
de duração da estimulação androgênica. (MARAVELIAS et al., 2005) No entanto,
esses valores podem variar, além do tempo, de acordo com a via de administração
e a molécula de andrógeno utilizada. (GAREVIK et al., 2014)
Os valores mais elevados de HDL no grupo induzido, no entanto, não podem
sozinhos representar uma vantagem, considerando os demais resultados do perfil
lipídico observados nesse grupo. Os animais do nosso estudo que consumiram o chá
verde mantiveram a concentração de HDL estável. Os valores aparentemente abaixo
do controle não representam desvantagem para esses grupos, e ocorreram como
reflexo da redução de todas as frações do colesterol nesses animais. Encontramos
também em nosso trabalho uma redução significativa nos valores de VLDL sérico,
nos animais que receberam o fitoesterol. Esse dado corrobora os anteriores,
mostrando que o chá é eficaz na redução de VLDL, sendo indicados para melhora
do perfil lipídico tanto de usuários de testosterona exógena, quanto de outras
condições patológicas que influenciem o metabolismo de lipídios. (ANANDH BABU,
SABITHA & SHYAMALADEVI, 2006; ROSENBLAT et al., 2008; TINAHONES et al.,
2008; ZHENG et al., 2011)
Os parâmetros bioquímicos da proteína total e albumina se mostraram dentro
do intervalo de referência da literatura no GCA. (MELO et al., 2012) Apesar de terem
ocorrido algumas diferenças entre os grupos, na proteína total, esta não foi
significativa para os grupos GCA, GIA e GCCV. A variação da concentração da
testosterona não parece ser o único fator a ter efeitos significativos na proteína total
sérica nesses animais, pois nos grupos onde ocorreu a introdução da dieta pode ser
observada uma redução das proteínas e sobretudo da albumina. Silva e
 58

colaboradores (2018) tratou ratos por três semanas com Decanoato de nandrolona
para indução do estímulo androgênico e não encontrou diferenças significativas na
concentração de albumina sérica, que, tanto nos controles quanto nos induzidos,
ficou abaixo do intervalo de referência da literatura, mostrando que esses resultados
podem ser variáveis.
Uma das hipóteses para redução das proteínas nos grupos GCCV, GICV seria
o potencial anti-inflamatório do chá verde, que reduziria a quantidade de mediadores
inflamatórios no organismo, reduzindo a proteína total, (RAMESH, GERALDINE &
THOMAS, 2010; HSU et al., 2011; KUO et al., 2014) além dos benefícios sistêmicos
dos polifenóis, que melhorariam também o perfil protéico.
Trabalhos anteriores do nosso grupo, utilizando indução como causa de dano
e a linhaça como fator de proteção, mostraram que a proteína total e albumina não
se alteram, (DE AMORIM RIBEIRO et al., 2014) e outros trabalhos já mostraram que
a associação do chá verde com dietas à base de soja – que tem em sua composição
fitoestrógenos semelhantes aos da linhaça, e também é rica em ômega 6, como o
óleo de abacate - foi capaz de melhorar diversos parâmetros inflamatórios em
modelo animal, incluindo proteínas totais. (HSU et al., 2011) Esses dados apontam
para o potencial benéfico das dietas associadas ao chá, para melhora geral dos
parâmetros orgânicos.
Essa melhora geral se confirma quando observamos as enzimas hepáticas.
As enzimas ALT e AST são indicadores sensíveis de dano hepático em diferentes
tipos de doenças. Já foi mostrado que a sobredose de testosterona provoca danos
hepáticos graves. (STIMAC et al., 2002; KESLER, T., SANDHU, R. &
KRISHNAMOORTHY, S., 2014; LUCIANO et al., 2014) Nossos resultados
mostraram o potencial efeito protetor do chá verde, contra o dano causado pelas
altas concentrações de testosterona. Em ratos, estudos mostraram que a
administração de chá verde melhora parâmetros bioquímicos em geral, podendo
atuar positivamente sobre a resposta do fígado à administração de fármacos (SOHN
et al., 1994).
Em outro estudo, realizado em camundongos, ficou provado que a catequina
principal do chá verde é um protetor contra o dano hepático causado por ftalatos.
(GE et al., 2015) Esses achados da literatura, embora não abordem o abuso de
esteróides, corroboram nossos achados. O uso de anabolizantes aumenta o risco do
desenvolvimento de neoplasias hepáticas, com prognóstico grave para o usuário.
 59

(KESLER, T., SANDHU, R. S. & KRISHNAMOORTHY, S., 2014; GUPTA et al., 2016)
O consumo de chá verde, como observado, pelos seus efeitos, pode promover efeito
protetor sobre o fígado, e até mesmo ser aliado na terapia contra neoplasias
hepáticas. (DARVESH & BISHAYEE, 2013)
Em relação ao perfil hematológico, é de se esperar que a indução com
testosterona aumente a eritropoiese e os parâmetros de hemoglobina e volume de
hemácias (hematócrito), (GARDNER, PRINGLE & JR, 1961; FREY-WETTSTEIN &
CRADDOCK, 1970) pois uma das vantagens esperadas do uso de esteróides é o
aumento da oxigenação e recuperação tecidual mais rápida. (BEGGS et al., 2014) O
estímulo androgênico já foi testado como tratamento alternativo para anemias que
ocorrem em consequência de doenças graves, (MALGOR et al., 1986) pois além da
eritropoiese, a testosterona atua sobre o metabolismo do ferro. (BEGGS et al., 2014).
Esse fator eritropoietico poderia explicar um aumento do R.D.W (índice de
anisocitose) nos grupos induzidos.
Em nosso estudo, os valores de número de hemácias, hematócrito e
hemoglobina do grupo controle se mostraram dentro do intervalo de referência para
ratos machos, (MELO et al., 2012). Foi observada em nosso estudo uma redução da
hemoglobina nos animais do GICV e redução na Concentração Hemoglobina
Corpuscular Média no grupos que receberam CV. Resultados semelhantes foram
encontrados por Marouani e colaboradores (2007) que em seu trabalho afirma que
esse resultado aparentemente negativo dos parâmetros hematológicos em
indivíduos que consumiram chá verde em infusão, não se dá devido às catequinas
nele contidas, mas sim devido à absorção de outros componentes liberados durante
o cozimento, que alterariam a absorção do ferro.
A leucocitose observada no grupo induzido, não visualizada nos demais
grupos, pode ser efeito de processos inflamatórios agudos que ocorrem como efeitos
adversos do uso de anabolizantes. A literatura mostra que o uso de anabolizantes
está relacionado à inflamação aguda na pele, coração, (KENNEDY & LAWRENCE,
1993) vasos sanguíneos, (ROCKHOLD, 1993) rim, (DAHER et al., 2009) fígado
(ŠTIMAC et al., 2002) e outros órgãos, e que o recrutamento de leucócitos está
aumentado com o uso de doses suprafisiológicas de hormônios esteróides em ratos.
(CHIGNALIA et al., 2015)
Além disso, já foi mostrado que em ratos normais que recebem estímulo
androgênico, ocorre não somente a leucocitose, mas também a diminuição da
 60

celularidade no timo e na medula óssea, (FREY-WETTSTEIN & CRADDOCK, 1970)

o que corrobora a hipótese de que a dose hormonal suprafisiológica não apenas
aumenta a produção, mas também estimula a diferenciação e o recrutamento de
linfócitos. Fijak e colaboradores (2011) em seu trabalho reafirma esse resultado,
mostrando que a reposição hormonal com doses elevadas testosterona (in vivo) e a
adição do hormônio em cultura (in vitro) gera leucocitose e expande a população de
linfócitos T reguladores e linfócitos B, o que poderia explicar o aumento na população
de linfócitos do grupo induzido.
O grupo induzido que recebeu chá verde apresentou uma contagem de
linfócitos significativamente inferior à contagem do grupo induzido, e a população de
linfócitos estava equiparada à do grupo controle. Esse resultado se deve
provavelmente ao potencial antioxidante dos polifenóis contidos no chá verde, que,
num quadro pró-inflamatório como é o da obesidade, já se mostrou capaz de reduzir
a produção de citocinas pró-inflamatórias e diminuir a quimiotaxia de células
inflamatórias em modelo animal. (MOLINA, BOLIN & OTTON, 2015;
ALBUQUERQUE et al., 2016)
Os resultados da análise sorológica também já foram descritos por Silva 2019
concordam com os da análise morfométrica de TNF-alfa e VEGF. O aumento da fase
aguda citocinas inflamatórias, no grupo induzido mostra que a testosterona está
promovendo inflamação, com efeito nocivo sobre a próstata. Efeitos semelhantes
foram descritos por outros autores usando diferentes métodos de estudo. O aumento
sistêmico de testosterona promove produção de citocina inflamatórias como TNF-
alfa, além de ser associado ao rápido e grave evolução de doenças de diferentes
sistemas. (ANNIBALINI, 2014; GUPTA, 2013; ALBUQUERQUE et al., 2016;
MOLINA, BOLIN & OTTON, 2015; ZHOU et al., 2018). O microambiente inflamatório
prostático provocado na HPB leva a um aumento nos níveis de citocinas pró-
inflamatórias. Esse aumento foi observado em alguns espécimes com HPB quando
comparados aos grupos controles (ZHOU et al., 2018). O consumo do chá verde, no
entanto, mostra a capacidade de modular este efeito deletério, diminuindo a
concentração dessas citocinas nos animais induzidos. Polifenóis do chá verde
reduzir o dano oxidativo e pode diminuir a produção de essas citocinas, atenuando
assim o processo inflamatório (ALBUQUERQUE et al., 2016; MOLINA, BOLIN &
OTTON, 2015).
 61

A expressão sistêmica do receptor e concentração sérica de VEGF é esperada

elevar na presença de andrógenos devido ao processo inflamatório e o efeito pró-
angiogênico promovida pela testosterona no sistema cardiovascular (CAI et al., 2011;
CHEN et al., 2012). O aumento desses valores no GICV na análise sorológica está
relacionado à essa angiogênse (Silva, 2019). É um aumento considerado positivo e
corrobora com os estudos de Machova-Urdzikova et al., 2017, que observaram
aumento do VEGF estimulado pelo chá verde polifenóis associados à recuperação
tecidual pós-lesão. Níveis mais altos de VEGF nos grupos de chá, associados a
citocinas inflamatórias reduzidas, indicam o efeito protetor do chá nos vasos
sanguíneos e no tecido cardíaco, reduzindo os efeitos deletérios do processo
inflamatório (SILVA et al., 2019). Nesse estudo foi possível observar que na análise
sorológica, ou seja, sistemicamente o chá promoveu um aumento da expressão de
VEGF, devido aos seus efeitos no sistema cardiovascular.
Esse comportamento da expressão de VEGF não é observado quando a
próstata é observada isoladamente pela imunohistoquímica, tendo o chá verde
diminuído a expressão de VEGF. Em um câncer em crescimento, há uma produção
constante de indutores de angiogênese no tecido, incluindo o fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF), sendo esse um dos principais ativadores de angiogênese
tumoral (MELEGH et al., 2019). A liberação desses fatores também já foi descrita
como relacionada com o posterior desenvolvimento de processos malignos
prostáticos a partir da HBP devido à liberação concomitante de agentes inflamatórios
e fatores angiogênicos como VEGF (TRUJILLO-ROJAS et al., 2022). Contudo foi
possível realizar uma avaliação qualitativa a partir da imunohistoquímica que
demonstram que a intensidade do VEGF nas glândulas câncer prostático foi maior
em comparação com as glândulas hiperplásicas, porém não o suficiente para
diferenciar lesões malignas de benignas com precisão (RIVERA-PÈREZ et al., 2018).
Ensaios clínicos mostraram uma associação entre alta expressão de VEGF e
progressão tumoral avaliados a partir dos níveis de proteína VEGF por imuno-
histoquímica e outros métodos (LIU et al., 2015; WANG et al., 2012). Trujillo-Rojas
2022, também descreveu que indicam que o surgimento da HBP estaria relacionado
com alterações específicas no perfil geral de expressão de quimiocinas prostáticas
como o VEGF a partir de tecido prostático com outra metodologia. A literatura sugere
que a angiogênese é importante no câncer de próstata, levando a estudos clínicos
subsequentes para avaliar se a terapia anti-angiogênica é eficaz no tratamento do
 62

câncer de próstata (MELEGH et al., 2019). Já se observou que o EGCG pode inibir
a atividade da metaloproteinase da matriz que pode contribuir para invasão de
células tumorais e angiogênese (GARBISA et al., 2001). O EGCG não apenas
reprime a expressão do HIF-1 α, um forte ativador da expressão do VEGF, mas
também pode prevenir a ativação do eixo VEGF/VEGFR. O chá verde então pode ter
efeitos preventivos na angiogênese tumoral e na metástase por meio da redução da
expressão dos receptores VEGF (FERRARA, 2003; KOJIMA-YUASA, 2003;
RASHIDI et al., 2017). Zhou 2018, também encontrou uma baixa expressão de VEGF
em animais tratados com o chá verde. Sendo assim, o chá verde previne a
angiogênese deletéria na prostata, porém continua provendo seus efeitos protetivos
reparação tecidual no sistema cardiovascular dos animais.
Estudos anteriores já haviam demonstrado o aumento da próstata como um
todo em animais induzidos por testosterona (SHIMIZU et al., 2020, CHEN & SONG,
2016), o que também foi possível observar nesse estudo a partir da medida da área
epitelial total. Contudo, a alteração na altura epitelial no grupo induzido sem dieta nos
mostra a alteração gerada pela estimulação androgênica no epitélio prostático. O
mesmo resultado já foi descrito por outros autores em animais induzidos
androgênicamente (VARGAS et al., 2013; SAROBO et al., 2012; ZHOU et al., 2018;).
Embora a patogênese da HPB não seja completamente compreendida,
evidências crescentes demonstram que os processos de hiperplasia epitelial da
próstata e síntese da matriz fibromuscular são modulados por hormônios sexuais
(MINUTOLI et al., 2016; VARGAS et al., 2013). Na próstata, tanto o epitélio quanto o
estroma expressam receptores androgênicos e, consequentemente, podem mediar
a atividade androgênica (BRONSON & MATHERNE, 1997). A sinalização de
receptores androgênicos a proliferação gera uma diferenciação das células epiteliais
da próstata, interferindo nos fatores secretores das células estromais (WANG et al.,
2017). Além de afetar a secreção de alguns fatores de crescimento epiteliais e,
subsequentemente, desencadeia o crescimento da próstata, bem como a síntese e
deposição de colágeno (WU et al., 2017). Zhou 2018 demonstrou que em animais
induzidos há uma elevação significativa da expressão desses receptores
androgênicos. A testosterona é essencial para o desenvolvimento, crescimento e
manutenção da próstata. A 5-alfa-redutase parece desempenhar um papel
importante papel convertendo a testosterona em DHT e atuando nos núcleos
celulares de órgãos-alvo, incluindo o acessório masculino glândulas, pele e próstata.
 63

Em particular, a expressão de DHT, que é a forma mais ativa de testosterona, está

associada com a ocorrência e progressão da HPB (CARSON & RITTMASTER, 2003)
Como o uso de esteroides androgênicos ainda é utilizado para o tratamento
de diversas afecções em homens senis como hipogonadismo se torna importante o
desenvolvimento de uma profilaxia para o possível desenvolvimento de uma HPB
secundária a esses tratamentos hormonais (FODE et al., 2019). Foi possível
observar que o animais induzidos que receberam a dieta com chá verde tiveram os
efeitos deletérios no epitélio prostático diminuídos como observado por Shimizu,
2020. O efeito protetivo do chá verde está relacionado não só a suas propriedades
anti-oxidativas, mas também a sua capacidade de diminuir níveis séricos de
testosterona ao inibir a aromatase (MUSIAL et al., 2019; SATOH et al., 2002). Sendo
assim, reduzindo-se os níveis séricos de testosterona há uma diminuição de seus
efeitos nos receptores androgênicos no tecido prostático. A epigalocatequina-3-
galato (EGCG) é o principal polifenol do chá verde. Foi demonstrado que o EGCG
pode suprimir a proliferação e promover a apoptose na linha celular HPB humana
(WU et al., 2017). Entre os agentes avaliados até o momento, o EGCG em particular
também demonstrou afetar as vias moleculares implicadas na carcinogênese da
próstata (KUMAR et al., 2022). Dessa forma, foi possível observar nesse estudo que
nos animais induzidos que receberam a dieta com o chá verde, além de haver uma
diminuição dos níveis séricos de testosterona, houve também uma diminuição da
proliferação epitelial, corroborando com os achados de outros autores.
A avaliação das fibras colágenas na hiperplasia prostática desencadeada pela
obesidade mostrou que há aumento significativo da deposição de colágeno na
próstata hiperplásica (SILVA et al., 2015). No estudo realizado por Zhou 2018 foi
possível observar que nos animais com HPB induzida a protuberância papilar e a
deposição de colágeno foi maior do que nos animais tratados com EGCG. Há então
um aparente remodelamento da matriz extracelular no tecido prostático nos animais
induzidos neste estudo. Esse remodelamento pode ser decorrente do estímulo
hormonal supra fisiológico ocasionando a formação de novas fibras colágenas ao
longo do processo a partir do aparecimento de uma birrefringência do tipo III no grupo
induzido. Foi possível também observar o efeito protetivo do chá verde, já que a
birrefringência do grupo induzido tratado se manteve como nos grupos controles
como do tipo I.
 64

7 CONCLUSÕES

Conclui-se que o chá verde atua sobre a histomorfometria da próstata e

reduzindo a altura e área epitelial prostático em animais com HPB induzida por
testosterona. A análise imuno-histoquímica de VEGF mostra que também há um fator
anti-angiogênico no uso do chá verde sobre a próstata, reduzindo a marcação nos
animais que fizeram uso do nutracêuticos.
 65

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 78

ANEXO 1
 79

ANEXO 2

HEMATOXILINA-EOSINA
Finalidade:
Para tecidos em geral.

Corantes e soluções:
1. Hematoxilina de Harris;
2. Eosina aquosa 1%;
3. Álcool 95% acidificado em Àcido clorídrico

Fixador:
Indiferente.

Método de Coloração:
1. Desparafinar em duas mudas de Xilol P.A. por 3 minutos cada;
2. Hidratar álcool 100, 90, 80 e 70° por 1 min cada;
3. Lavar em água de torneira por 5 minutos;
4. Corar pela Hematoxilina de Harris por 1 a 5 minutos;
5. Lavar em água de torneira por 5 minutos;
6. Diferenciar em álcool-ácido até que os núcleos fiquem bem diferenciados;
7. Lavar em água de torneira por 10 minutos;
8. Corar pela Eosina por 3 a 5 minutos;
9. Lavar em água destilada;
10. Desidratar;
11. Montar.

Resultados:
Azul – núcleo, bactérias e cálcio;
Rosa – citoplasma;
Vermelho – hemácias e granulações eosinófilas;
Azul-claro – mucoproteína.
 80

ANEXO 3

PICRO SIRIUS RED

Finalidade:
Para fibras de colágeno.

Corantes e soluções:
1. Sirius Red F3BA 0,1% em solução aquosa saturada de ácido pícrico pH 2,0;
2. Hematoxilina de Harris ou Delafield.

Fixador:
Formalina tamponada 10%.

Método de coloração:
1. Desparafinar em 2 mudas de xilol P.A.;
2. Hidratar em álcool 100°, 90º, 70º e água destilada;
3. Corar por 1 hora no Sirius Red;
4. Diferenciar em 2 mudas de Ácido clorídrico (HCl) 0.01N, 1 minuto cada;
5. Lavar em água destilada
6. Corar em hematoxilina de Harris ou Delafield por 3 minutos;
7. Lavar em água corrente
1. Desidratar, clarificar e montar

Resultados:
Sem polarização
Vermelho – fibras de colágeno
Roxo – núcleos
Com polarização
Birrefringência laranja ou vermelha – Fibras de colágeno tipo I

Birrefringência verde – fibrilas de colágeno tipo III

 81

ANEXO 4
Artigo submetido (14/12/2023) para a revista “The Prostate” – Qualis A2 / Medicina II
Título: “Effects of a green tea-based diet on Wistar rats submitted to induced benign prostatic
hyperplasia”

“
82
83